豬等孢球蟲檢測及防控研究進展

劉海燕，馬文瑾，徐向月，霍美霞，王 磊，惠天翊，黃玲利

(1.國家獸藥殘留基準實驗室(華中農業(yè)大學)，武漢 430070；2.國家獸藥安全評價實驗室(華中農業(yè)大學)，武漢 430070；3.農業(yè)農村部獸藥殘留檢測重點實驗室，武漢 430070；4.華中農業(yè)大學動物醫(yī)學院，武漢 430070)

豬球蟲病是一類高度傳染的群體性寄生蟲病，病原主要有蒂氏艾美耳球蟲、粗糙艾美耳球蟲、有刺艾美耳球蟲以及豬等孢球蟲(Isosporasuis)，其中豬等孢球蟲的致病力最強[1-2]。目前已明確豬等孢球蟲的分類地位為：頂復門(Apicomplexa)、孢子蟲綱(Sporozoea)、球蟲亞綱(Coccidia)、真球蟲目(Eucoccidiorida)、艾美耳亞目(Eimeriorina)、艾美耳科(Eimeriidae)、等孢球蟲屬(Isospora)。豬等孢球蟲主要導致仔豬的料肉比、球蟲病的發(fā)病率(約80%)和死亡率均出現(xiàn)增高，仔豬往往表現(xiàn)發(fā)育不良[3]。本文綜合國內外報道的相關文獻資料，從流行病學特征、臨床癥狀、形態(tài)特征、生活史、檢測方法、防治措施等方面的研究進展對豬等孢球蟲進行綜合分析探討，以期為進一步認識病原、預防和治療豬球蟲病提供參考和幫助。

1 流行病學特征及臨床癥狀

豬等孢球蟲主要寄生于仔豬，以7～21日齡仔豬多見，成年豬多為帶蟲者(隱性感染)。由豬等孢球蟲引起的豬球蟲病四季均可發(fā)生，因球蟲卵囊的發(fā)育需要較高的溫度和濕度，所以該病普遍流行于春末和夏季，但哺乳仔豬發(fā)病無明顯的季節(jié)性規(guī)律可循。此病呈世界性流行，且規(guī)?；i場多發(fā)。

1.1 國外流行情況 據(jù)報道，豬球蟲病每年可導致美國經濟損失高達1億美元以上[4]。歐美國家中83%～100%的規(guī)?；i場也不同程度地存在著豬等孢球蟲感染[5]。Mundt等[6]調查發(fā)現(xiàn)，德國、澳大利亞和瑞士等國家的大型集約化養(yǎng)殖場豬等孢球蟲陽性率高達76.2%，發(fā)病率為40%～100%，平均發(fā)病率達到69%。Karamon等[7]調查發(fā)現(xiàn)，波蘭104個規(guī)?；B(yǎng)豬場中仔豬等孢球蟲的感染率為66.7%，其中在大、中、小型規(guī)?；B(yǎng)豬場中的感染率分別為32.7%、17.1%、13.2%；而艾美耳球蟲在大、中、小型規(guī)?；B(yǎng)豬場中的感染率分別為1.4%、0.6%、28.9%，推測可能是由于這兩種球蟲的發(fā)育周期存在一定差異，即豬等孢球蟲卵囊孢子形成的時間短(約24～48 h)，而艾美耳球蟲卵囊產孢時間長(5～12 d)。有調查表明，日本的規(guī)模化養(yǎng)豬場豬等孢球蟲陽性率約為80%，患病率為12%～17%[8]；西班牙、比利時、荷蘭、墨西哥、意大利等國家的規(guī)?；i場豬等孢球蟲感染率分別為85%、80%、72%、70%、68%[9](表1)。

表1 部分國家豬球蟲感染率比較Tab 1 Comparison of infection rates of coccidia in pigs in some countries

由此可見，豬等孢球蟲所引起的豬球蟲病在國外廣泛流行，特別是集約化養(yǎng)豬場，因其養(yǎng)殖量大、飼養(yǎng)密度高而多發(fā)。通過流行病學調查數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，豬等孢球蟲的感染率因豬只生長階段、豬場規(guī)模而異，等孢球蟲感染率：仔豬>中豬>大豬，大型豬場>中型豬場>小型豬場；不同國家仔豬感染等孢球蟲的日齡也存在差異[1]，英國和加拿大7～10日齡的仔豬易感，丹麥7～14日齡的仔豬易感，巴西10～19日齡的仔豬易感，所以某些歐美國家及亞洲部分國家已將豬等孢球蟲作為引起7～14日齡仔豬腹瀉的主要病原之一；而且仔豬等孢球蟲的流行和傳播與母豬并沒有相關性，即使母豬在分娩前后沒有球蟲卵囊排出，其仔豬也有感染豬等孢球蟲的風險[7]。

1.2 國內流行情況 目前，我國有關豬球蟲病的研究報道相比雞、兔球蟲病要少，且主要集中在流行病學調查階段(如表2所示)。鹿雙雙等[10]調查發(fā)現(xiàn)，全國13個省(直轄市、自治區(qū))119個規(guī)?；i場哺乳仔豬感染豬等孢球蟲的陽性率為43.38%。劉文婷等[11]調查發(fā)現(xiàn)豬等孢球蟲在華北地區(qū)規(guī)?；i場的感染率為34.43%。郭建超等[12]調查發(fā)現(xiàn)，2016-2017年華南地區(qū)規(guī)模化豬場豬等孢球蟲感染率為47.6%。黃儀娟[13]調查發(fā)現(xiàn)，廣東省部分地區(qū)規(guī)模豬場等孢球蟲感染率為26.48%，其中11～20日齡仔豬感染陽性率高達37.80%。程俊貞等[14]研究表明，豬等孢球蟲主要侵害11～20日齡仔豬，感染率達19.52%。盛祖勛等[15]發(fā)現(xiàn)安徽省豬等孢球蟲陽性率為13.20%。以上數(shù)據(jù)表明，我國不同地區(qū)仔豬等孢球蟲感染率差異較大，仔豬球蟲病在華北地區(qū)規(guī)模豬場較為普遍，且感染率較高。我國豬球蟲病大都發(fā)生在一些飼養(yǎng)條件差、衛(wèi)生水平低的種豬場的仔豬群中，多表現(xiàn)為發(fā)展緩慢，久治不愈，所以應提高豬場人員對豬球蟲病的認識，加強對仔豬球蟲病的防控，從而為生豬生產提供多重保障。

表2 國內不同地區(qū)豬等孢球蟲感染率比較Tab 2 Comparison of infection rate of Isospora suis in different regions of China

1.3 臨床癥狀 發(fā)病仔豬所表現(xiàn)出的臨床癥狀是球蟲內源性發(fā)育階段對腸道黏膜破壞的結果，主要表現(xiàn)為腹瀉，糞便呈現(xiàn)黃色或灰色。病初，糞便疏松或呈糊樣，隨著病情加重后表現(xiàn)出水樣腹瀉，有時由于潛血而呈棕色[16]。仔豬因常常沾滿液狀糞便，還會散發(fā)出腐敗乳汁樣的強烈酸臭氣味。仔豬腹瀉一般可持續(xù)4～8 d，常表現(xiàn)出被毛雜亂、脫水、行走不穩(wěn)、生長發(fā)育遲緩等癥狀。不同窩的仔豬臨床上所呈現(xiàn)出的病癥往往存在著差異，即使同一窩仔豬的不同個體所表現(xiàn)出來的具體癥狀也不完全相同[2]。

2 豬等孢球蟲形態(tài)特征和生活史

豬等孢球蟲是一種單細胞真核生物，蟲體微小，肉眼不可見，在生活史的不同階段，形態(tài)也有所差異。常見的豬等孢球蟲卵囊一般呈球形或亞球形，卵囊壁光滑且比較薄，卵囊平均尺寸為22.2 μm×18.4 μm。在適宜的條件下，未孢子化卵囊發(fā)育成為2個圓形或橢圓形的孢子囊，孢子囊平均大小為18.5 μm×17.5 μm，內含4個子孢子，呈臘腸形或香蕉形，形成的最早時間為63 h[1]。

豬等孢球蟲生活史可分為3個時期，即孢子生殖階段、裂殖生殖階段和配子生殖階段。其中孢子生殖階段(外生性發(fā)育階段)在外界環(huán)境中進行，裂殖生殖階段和配子生殖階段在宿主體內(內生性發(fā)育階段)進行。孢子生殖階段是從未孢子化卵囊(不具感染能力)發(fā)育成孢子化卵囊(具感染能力)的階段，此階段是該球蟲能否感染宿主的關鍵[17]。卵囊隨糞便排出后在合適的環(huán)境溫濕度和充分的氧氣狀況下通過孢子生殖發(fā)育至孢子化卵囊，不同的環(huán)境溫度會影響卵囊孢子化的時間[18-19](表3)。孢子化卵囊被攝入后，釋放出孢子囊，隨后釋放出子孢子，入侵腸上皮細胞進行增殖(內生發(fā)育)。子孢子發(fā)育為滋養(yǎng)體，后者在上皮細胞內進一步發(fā)育為裂殖體，成熟后釋放出裂殖子，隨后進入其他腸上皮細胞并侵害周圍的細胞，形成新一代裂殖體。裂殖生殖的代數(shù)依等孢球蟲的不同種類而異，一般2～3代后進行配子生殖，亦稱為有性生殖階段。裂殖子分別結合形成大小配子體，兩者結合為合子后發(fā)育成卵囊；卵囊成熟后進入腸腔并隨糞便排出體外(圖1)。

表3 不同環(huán)境溫度對豬等孢球蟲卵囊孢子化的影響Tab 3 Effects of different ambient temperatures on sporulation of oocysts of Isospora suis

圖1 豬等孢球蟲生活史[20]Fig 1 Life cycle of Isospora suis

3 檢測方法

臨床上7～14日齡仔豬出現(xiàn)腹瀉，用抗生素治療無效時可懷疑其患有球蟲病[21]。由于豬等孢球蟲感染前期沒有特征性病癥，且感染后排卵囊量無明顯規(guī)律并呈現(xiàn)排卵囊周期短的特點，快速檢測仍然是該病有效診斷的瓶頸。目前國內外的專家學者對豬等孢球蟲的檢測方法進行了大量探索與鉆研，以期建立迅速、高效、科學、準確和低成本的診斷方法。

3.1 糞便學方法

3.1.1 直接涂片法 直接涂片法通過直接涂片后在普通光學顯微鏡下進行鏡檢觀察有無卵囊。該方法簡便、易行、快速，適合于蟲卵數(shù)目多的糞便檢查。由于球蟲卵囊尺寸、糞便、雜物等干擾，此種方法的檢出率較低。

3.1.2 漂浮法 漂浮法的原理是通過采用比重高于蟲卵的溶液來稀釋糞便，將糞便中的蟲卵和糞渣分開而浮集于液體的表面，隨后進行檢查。豬等孢球蟲卵囊的檢測常采用飽和食鹽水漂浮法和飽和糖鹽水溶液漂浮法，其他飽和溶液如飽和硫酸鋅、飽和硫酸鎂、飽和蔗糖等由于比重較大，反而明顯降低了球蟲卵囊的檢出率。由于該法可能會受到脂肪顆粒和氣泡等的影響，故不易發(fā)現(xiàn)卵囊，或易出現(xiàn)假陽性。

3.1.3 沉淀法 沉淀法可有效地去除仔豬糞便中的脂質，應用較為廣泛。常見的沉淀法包括汞碘醛離心沉淀法、福爾馬林-乙醚沉淀法、福爾馬林-乙酸乙酯沉淀法和Teleman法。其中Teleman法，又稱之為離心沉淀法，被認為是最有效的仔豬球蟲卵囊檢測方法。Teleman法利用5%醋酸和乙醚溶解糞便中的脂肪顆粒，通過離心遺棄上清液以純化卵囊，最后在光學顯微鏡下進行檢查[22]。它既有效地克服了直接涂片鏡檢法由于存在糞便顆粒等異物干擾的缺點，又克服了漂浮法中較大脂肪顆粒與卵囊混雜在一起的缺點[23]。臧傳佼[24]采用了Teleman法加1 mol/L的糖鹽水漂浮法純化等孢球蟲卵囊，能有效的減少豬糞中過多的脂類物質造成的影響。但由于Teleman法檢測步驟比較繁瑣，且仔豬球蟲卵囊檢出率與漂浮法的檢測結果相差不大，其應用實際并不如漂浮法廣泛。

3.1.4 熒光顯微鏡檢測法 熒光顯微鏡檢測法利用豬等孢球蟲卵囊壁(在孢子化卵囊中則是孢子囊壁)在熒光顯微鏡的檢測下可發(fā)出藍光的原理，可直接在熒光顯微鏡下對豬等孢球蟲進行計數(shù)，做到卵囊的敏感定性和半定量評價。該方法簡便、快速，應用于單個仔豬樣本時也可用于確定排泄的程度，但必須要在有熒光顯微鏡的條件下才能進行操作，在臨床中應用并不廣泛。

3.2 分子生物學方法 PCR技術是一種既特異又敏感的DNA體外擴增方法，其操作簡便快捷，無需對病原體進行分離純化，豬等孢球蟲和艾美耳球蟲的種間分化已通過特異性的聚合酶鏈反應等分子診斷方法完成，利用該技術擴增目的DNA或rRNA檢測可直接區(qū)分出未孢子化的豬等孢球蟲卵囊與豬艾美耳球蟲卵囊，從而達到定性和定量檢測的目的[25]。目前最常用檢測豬等孢球蟲的PCR方法是根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫上記錄的豬等孢球蟲18S rRNA基因序列來設計特異性引物，從而建立PCR檢測方法。

臨床上豬等孢球蟲的糞便學診斷常采用直接涂片法、飽和糖鹽水溶液漂浮法以及飽和食鹽水漂浮法[26]，但都需要減少脂肪、蛋白質對診斷的影響。熒光顯微鏡檢測法的敏感性高于上述三種方法，但要在特定條件下才能進行。PCR診斷具有更高的敏感性和特異性，但會受到個體感染動物排泄周期短的影響[27]，且依賴特定的儀器。所以，探索出一種便捷、快速、可靠的檢測豬群中等孢球蟲的方法迫在眉睫。

4 防治措施

目前防治球蟲病的方法主要有三種，即中藥治療、疫苗免疫和化藥治療。

4.1 中藥治療 中藥如常山、使君子、青蒿、白頭翁、苦參等，對球蟲病均有一定的治療效果，且具有來源廣泛、抗蟲譜廣、療效顯著、毒副作用小、無殘留等優(yōu)勢[28]。但目前開發(fā)的中草藥大部分被用于防治雞、兔球蟲病，還未見使用中藥治療豬球蟲病的相關報道。所以，加強中藥及其提取物、中藥復方等研究可為今后豬球蟲病的防治提供更多選擇。

4.2 疫苗免疫 疫苗免疫是有效預防球蟲病的方法之一。目前雞球蟲疫苗主要是雞球蟲病三價活疫苗(柔嫩艾美爾球蟲PTMZ株+巨型艾美爾球蟲PMHY株+堆型艾美爾球蟲PAHY株)，還沒有國家統(tǒng)一制定的兔球蟲疫苗，也沒有針對豬等孢球蟲的疫苗。雖然有研究表明高劑量的卵囊在母豬產前重復接種可為部分孕畜提供保護[29]，但是疫苗的制備需利用未經修飾或減毒的活寄生蟲配方，且目前還沒有用于豬等孢球蟲的減毒株。曾有學者將豬等孢球蟲裂殖子黏附蛋白 (attachment protein, ASP) 作為疫苗候選因子對宿主進行免疫，發(fā)現(xiàn)其可以誘導裂殖子減少96%～99%[30]，不過最終也沒有相關疫苗商品上市。Nicola Palmieri等[31]將反向疫苗學與轉錄組學和比較基因組學相結合，確定了一系列豬等孢球蟲疫苗候選蛋白，并將接種苗獲得的候選疫苗與從豬血清免疫印跡實驗中鑒定的蛋白進行重疊，確定了一種新候選疫苗(豬等孢球蟲特異性42 kD跨膜蛋白)，并在體外證明了其免疫原性。因此，篩選出結構穩(wěn)定、免疫原性強的候選因子(蛋白)可能是今后研制豬球蟲疫苗的關鍵。

4.3 化藥治療 目前對于豬球蟲病的防治多借助于化學驅蟲藥物，且以抗生素治療為主，主要有聚醚離子類的莫能菌素、三嗪類的妥曲珠利、磺胺類等藥物。莫能菌素能改善仔豬飼料轉化率、降低腹瀉和死亡率，但日糧中超過100 mg/kg的劑量會影響飼料的適口性。拉沙里菌素和常山酮在減輕腹瀉，降低卵囊排出的同時，也會降低仔豬免疫力。磺胺類藥物雖有預防效果，但其具有腎臟毒性，不適合長期用藥[32]。妥曲珠利是目前歐盟唯一認證的對抑制豬球蟲病有效的化藥，主要作用于球蟲子孢子和早期裂殖體[33]。妥曲珠利的劑型在市場上十分單一，僅有妥曲珠利溶液劑(百球清，禮藍公司生產)。百球清按仔豬(3～5日齡)每千克體重20～30 mg口服一次，既能有效降低卵囊排泄，又能緩解仔豬下痢[34]。但豬等孢球蟲現(xiàn)場分離株對妥曲珠利也會產生耐藥性，并可能出現(xiàn)更廣泛的耐藥性[2]。所以，應加強化藥的研發(fā)力度，為采取科學的聯(lián)合用藥方式提供更多選擇。

4.4 預防措施 減少或滅活感染性卵囊是控制豬球蟲病的關鍵。做好預防工作主要有以下幾點：一是保持豬舍衛(wèi)生，及時收集豬糞進行堆積和發(fā)酵處理，以及時殺滅球蟲卵囊；二是定期消毒，特別是產仔舍和各類用具的消毒，可選擇5%氨水或50%漂白粉[35]，最后再用甲醛和高錳酸鉀進行熏蒸消毒；三是盡量減少應激，應避免斷奶、突然更換飼料和運輸產生的應激；四是定期添加抗球蟲藥物，在母豬分娩前一周和產后哺乳期內，在飼料中添加25～65 mg/kg體重的氨丙啉，可有效預防仔豬感染[1]；五是實行全進全出的管理方式，在仔豬轉舍時， 必須一次性全部轉出，切忌留有個別弱小仔豬在產房繼續(xù)飼養(yǎng)，容易造成環(huán)境中球蟲卵囊遺留，危害下一批仔豬；六是保持合理飼養(yǎng)密度和濕度，要注意控制豬群飼養(yǎng)密度，加強通風管理，保持圈舍潔凈干燥，這不僅能增強豬只體質和免疫力，還可以減少單位面積內產生的糞便和球蟲卵囊數(shù)量；七是定期進行豬球蟲篩查，動態(tài)掌握豬群中的球蟲傳播感染情況，以防止豬球蟲病意外爆發(fā)[36]。

5 結 語

綜上所述，豬等孢球蟲感染率高，仔豬在感染該蟲后表現(xiàn)出腹瀉、消瘦，且哺乳期仔豬對豬等孢球蟲的易感性最高，臨床上常表現(xiàn)為水樣腹瀉，治療不及時仔豬出現(xiàn)死亡或成為僵豬，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失。隨著科研人員對豬等孢球蟲的深入研究，其流行病學特征、形態(tài)學特征、生活史、檢測方法以及防治措施等都已取得了一定成果。但豬等孢球蟲的生活史、檢測方法和科學防控手段等問題還有待進一步探究。未來可加強對以下幾方面的探究：一是探究豬等孢球蟲的生活史，完全掌握其生長、發(fā)育和增殖這三個階段的生物學特性，尋找消滅豬等孢球蟲的有效時期；二是探究豬等孢球蟲在豬體內的侵染機制、致病機制和免疫逃避機制，為治療藥物的篩選和研究提供理論依據(jù)；三是加強對豬等孢球蟲基因組結構和功能的研究，探究其特異性抗原，為疫苗候選因子的篩選提供可靠理論基礎；四是研究并建立靈敏度高、特異性好、易操作、成本低的豬等孢球蟲現(xiàn)場檢測方法，以實現(xiàn)快速診斷。