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    表達(dá)H5N1亞型禽流感HA、NA、M1基因的重組桿狀病毒的鑒定

    2021-12-30 09:46:34李晶梅陳魯杰王煥君張飛雁石寶蘭漆世華謝紅玲
    中國獸藥雜志 2021年12期
    關(guān)鍵詞:桿狀病毒電鏡血凝

    李晶梅,陳魯杰,王煥君,李 改,朱 薇,張飛雁,石寶蘭,漆世華,謝紅玲

    (1.國藥集團(tuán)動物保健股份有限公司,武漢 430075;2.諾華生物科技(武漢)有限責(zé)任公司,武漢 430075)

    禽流感(Avian influenza,AI)是由A型流感病毒引起的一種禽類傳染病,其中的H5N1亞型禽流感是危害最大的禽類疫病之一。疫苗能有效防控該疫病,現(xiàn)階段主要應(yīng)用的是雞胚工藝或細(xì)胞培養(yǎng)工藝制備H5N1亞型禽流感病毒,進(jìn)而生產(chǎn)全病毒滅活疫苗。全病毒滅活疫苗需在生物安全三級的生產(chǎn)車間生產(chǎn),生產(chǎn)成本較高,因此廣大研究者一直在探尋新型疫苗研發(fā)方向[1]。

    昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種能夠高效表達(dá)外源基因的真核表達(dá)載體系統(tǒng)[2]。昆蟲桿狀病毒不感染脊椎動物,無生物安全隱患;基因組較大可容納大片段外源基因;能對表達(dá)的蛋白進(jìn)行加工修飾,使表達(dá)的蛋白保存原有的生物活性[3]。有研究表明該系統(tǒng)表達(dá)流感病毒的 HA、NA、M1 蛋白可自我包裝成形態(tài)類似于禽流感病毒的病毒樣顆粒(Virus-like particles,VLPs)[4]。VLPs具有較好的免疫原性,有開發(fā)成為疫苗產(chǎn)品的可能。

    為研究基于該系統(tǒng)構(gòu)建的含有H5N1亞型禽流感HA、NA、M1基因的重組桿狀病毒(簡稱“VLP01株”),其表達(dá)產(chǎn)物是VLPs,還是游離的HA、NA、M1等蛋白,對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了血凝、電鏡、Western Blot、ELISA鑒定,以確定其性質(zhì)。

    1 材料和方法

    1.1 毒種、細(xì)胞 VLP01株毒種由諾華生物科技(武漢)有限責(zé)任公司提供,國藥集團(tuán)動物保健股份有限公司擴(kuò)繁并保存;Sf9細(xì)胞由國藥集團(tuán)動物保健股份有限公司擴(kuò)繁并保存。

    1.2 主要試劑 H5N1 HA重組蛋白、H5N1 NA重組蛋白、H7N9 M1重組蛋白,Sino Biological公司產(chǎn)品;禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗(yàn)(Re-6)抗原(簡稱“H5禽流感病毒”),哈爾濱國生生物科技股份有限公司產(chǎn)品;HA單抗,由國藥集團(tuán)動物保健股份有限公司研制;NA多抗,abcam公司產(chǎn)品;M1單抗,santa cruz biotechnology公司產(chǎn)品;HRP羊抗鼠IgG和HRP羊抗兔IgG,KPL公司產(chǎn)品;DAB顯色試劑盒,武漢博士德公司產(chǎn)品;TMB顯色液,湖州英創(chuàng)生物科技有限公司產(chǎn)品;蛋白Marker,Thermo Scientific公司產(chǎn)品。

    1.3 主要設(shè)備耗材 超速離心機(jī),Beckman公司,水平轉(zhuǎn)子sw41Ti,角轉(zhuǎn)子 TyPe0ToTi;20 mL超濾濃縮離心管,50000MWCO,Vivaspin公司產(chǎn)品。

    1.4 制備表達(dá)產(chǎn)物 毒種接種Sf9細(xì)胞,27 ℃培養(yǎng)4 d,3000 r/min 20 min離心收獲上清即為表達(dá)產(chǎn)物。

    1.5 超速離心純化表達(dá)產(chǎn)物 角轉(zhuǎn)子離心表達(dá)產(chǎn)物,4 ℃ 28000 r/min 2 h。棄去上清,沉淀中加入PBS,震蕩懸浮后過夜,制成均勻混懸液。配制蔗糖密度梯度離心溶液,蔗糖密度分別為20%、60%,水平轉(zhuǎn)子離心混懸液,4 ℃ 28000 r/min 3 h。吸取目的條帶即為純化產(chǎn)物。

    1.6 血凝效價檢測 檢測表達(dá)產(chǎn)物、角轉(zhuǎn)子離心上清、混懸液、純化產(chǎn)物的血凝效價,血凝檢測的方法參照《中華人民共和國獸藥典2015版第三部》附錄27[5]。

    1.7 電鏡檢測 純化產(chǎn)物以超濾濃縮離心管脫糖,加至銅網(wǎng)上,2%磷鎢酸染色液負(fù)染,透射電鏡觀察VLPs的形態(tài)。

    1.8 Western Blot檢測 純化前表達(dá)產(chǎn)物、純化后表達(dá)產(chǎn)物、H5禽流感病毒(對照)和H5N1 HA重組蛋白(HA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品)經(jīng)10% SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)至NC膜,用HA單抗作為一抗、HRP羊抗鼠IgG作為二抗、DAB染色液顯色,鑒定HA蛋白。同法用NA多抗鑒定NA蛋白,用M1單抗鑒定M1蛋白。

    1.9 ELISA檢測 用NA兔多抗作為包被抗體、HA鼠單抗作為檢測抗體建立雙抗夾心ELISA方法,并以此方法檢測表達(dá)產(chǎn)物。包被捕獲抗體:加入NA多抗,200 ng/孔,100 μL/孔,2~8 ℃孵育過夜,PBST 洗板。封閉:加入含5%脫脂乳的PBS,250 μL/孔,37 ℃封閉 2 h,PBST 洗板。加樣:在酶標(biāo)板相應(yīng)孔中加入適當(dāng)稀釋的表達(dá)產(chǎn)物、H5禽流感病毒和HA蛋白、NA蛋白,100 μL/孔,3個重復(fù),37 ℃孵育1 h,PBST洗板。加檢測抗體:加入HA單抗,500 ng/孔,100 μL/孔,37 ℃孵育 1 h,PBST 洗板。加酶標(biāo)二抗:加入HRP羊抗鼠IgG工作液,100 μL/孔,37 ℃孵育1 h,PBST洗板。加顯色液:加入TMB顯色液,100 μL/孔,室溫反應(yīng)10 min。加終止液:加2 mol/L硫酸,50 μL/孔,在酶標(biāo)儀上讀取OD450nm的值。PBS各孔OD450nm值的平均數(shù)+3倍標(biāo)準(zhǔn)差為陰陽性判定的臨界值,OD450nm≥臨界值,判為陽性;OD450nm<臨界值判為陰性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 血凝效價檢測 表達(dá)產(chǎn)物、角轉(zhuǎn)子離心上清、混懸液、純化后表達(dá)產(chǎn)物的血凝效價和體積見表1。超速離心后有血凝活性的物質(zhì)在沉淀中而不在上清中。

    表1 被檢樣品血凝效價和體積Tab 1 HA titer and volume of the samples

    2.2 電鏡檢測 如圖1所示,電鏡下可見禽流感病毒形態(tài)特點(diǎn)的VLPs,呈圓形或橢圓形,直徑約100 nm,外周有環(huán)形的冠狀刺突。

    圖1 純化后樣品電鏡照片F(xiàn)ig 1 Observation of the purified sample by electron microscopy

    2.3 Western Blot檢測 用HA、NA、M1抗體分別檢測純化前表達(dá)產(chǎn)物、純化后表達(dá)產(chǎn)物、H5禽流感病毒及HA、NA、M1蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。

    2.3.1 HA抗體檢測HA蛋白 純化前后的表達(dá)產(chǎn)物、H5禽流感病毒、HA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品在70 kD左右有目的條帶,見圖2。H5禽流感病毒HA蛋白的條帶弱,可能因?yàn)榧兹缁顚?dǎo)致抗原表位被部分破壞,未被HA抗體全部識別。表達(dá)產(chǎn)物、H5禽流感病毒、HA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的HA蛋白的分子量有差異,可能因?yàn)楸磉_(dá)的系統(tǒng)不一樣,表達(dá)產(chǎn)物是昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的,HA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品是原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的,而H5禽流感病毒是雞胚擴(kuò)繁制備的。

    1:H5禽流感病毒;M:Marker;2:純化后的表達(dá)產(chǎn)物;3:純化前的表達(dá)產(chǎn)物;4:HA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品1: H5 AIV;M: Marker;2: Purified products;3: Unpurified products;4: HA protein圖2 Western Blot檢測HA蛋白Fig 2 Detection of HA protein by Western Blot

    2.3.2 NA抗體檢測NA蛋白 純化前后的表達(dá)產(chǎn)物、H5禽流感病毒、NA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品在50 kD左右有目的條帶,見圖3。

    1:純化前的表達(dá)產(chǎn)物;M:Marker;2:純化后的表達(dá)產(chǎn)物;3:NA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品;4:H5禽流感病毒1: Unpurified products;M: Marker;2: Purified products;3: NA protein;4: H5 AIV圖3 Western Blot檢測NA蛋白Fig 3 Detection of NA protein by Western Blot

    2.3.3 M1抗體檢測M1蛋白 純化前后的表達(dá)產(chǎn)物、H5禽流感病毒、M1蛋白標(biāo)準(zhǔn)品在27 kD左右有目的條帶,見圖4。

    1:H5禽流感病毒;M:Marker;2:純化后的表達(dá)產(chǎn)物;3:純化前的表達(dá)產(chǎn)物;4:M1蛋白標(biāo)準(zhǔn)品1: H5 AIV;M: Marker;2: Purified products;3: Unpurified products;4: M1 protein圖4 Western Blot檢測M1蛋白Fig 4 Detection of M1 protein by Western Blot

    2.4 ELISA檢測 預(yù)實(shí)驗(yàn)研究顯示,表達(dá)產(chǎn)物中有影響ELISA檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的物質(zhì),所以樣品需經(jīng)透析處理。ELISA方法檢測表達(dá)產(chǎn)物、H5 禽流感病毒和HA蛋白、NA蛋白,OD450nm值見表1,經(jīng)計(jì)算樣品陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)為0.164。結(jié)果顯示,不同批的表達(dá)產(chǎn)物為陽性,H5禽流感病毒和HA蛋白、NA蛋白均為陰性。結(jié)果說明,表達(dá)產(chǎn)物為同時含有禽流感HA、NA蛋白的VLPs。H5 禽流感病毒的ELISA檢測結(jié)果為陰性,結(jié)合2.3.1的結(jié)果,分析原因可能是甲醛滅活的H5禽流感病毒無法被HA單抗有效識別。

    表2 ELISA檢測表達(dá)產(chǎn)物Tab 2 Detection of the products by ELISA

    3 討論與結(jié)論

    昆蟲細(xì)胞的小規(guī)模和大規(guī)模培養(yǎng)都相對容易,因此,昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成為了最廣泛的應(yīng)用于重組蛋白的常規(guī)生產(chǎn)系統(tǒng)之一[6]。昆蟲細(xì)胞可以折疊、修飾、運(yùn)輸和組裝新合成的多肽,產(chǎn)生高度真實(shí)的可溶性最終產(chǎn)物[6],因此,將其作為疫苗的抗原生產(chǎn)系統(tǒng)在工藝和抗原性方面均滿足要求。

    VLP01株是基于昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建的含有H5N1亞型禽流感HA、NA、M1基因的重組桿狀病毒,以禽流感疫苗研發(fā)為目的。為確認(rèn)VLP01株表達(dá)產(chǎn)物是禽流感VLPs,對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定。角轉(zhuǎn)子超速離心后有血凝活性的物質(zhì)在沉淀中不在上清中,說明有血凝活性的物質(zhì)是可被超離沉淀的、沉降系數(shù)700~800 s的禽流感VLPs,而非沉降系數(shù)小于20 s、不能被超離沉淀的HA蛋白。禽流感病毒形態(tài)上為不規(guī)則球形,100 nm左右,包膜上有兩種糖蛋白,即血凝素和神經(jīng)氨酸酶,這兩類蛋白突出病毒體外,長度約為10~14 nm,直徑6~8 nm,被稱作刺突[7]。電鏡觀察本研究純化后的表達(dá)產(chǎn)物,可見上述大小的病毒樣顆粒及表面的環(huán)形冠狀刺突,說明表達(dá)產(chǎn)物具有禽流感病毒的形態(tài)特點(diǎn),是禽流感VLPs。HA、NA、M1抗體以Western Blot方法檢測蔗糖密度梯度方法離心純化的表達(dá)產(chǎn)物,可見特異性條帶,說明純化后的表達(dá)產(chǎn)物是同時含有HA、NA、M1蛋白的禽流感VLPs。NA多抗、HA單抗的夾心ELISA檢測表達(dá)產(chǎn)物為陽性,說明表達(dá)產(chǎn)物并非游離的HA蛋白、NA蛋白,而是同時含有HA蛋白、NA蛋白VLPs。

    血凝、電鏡、Western Blot、ELISA鑒定均說明VLP01株表達(dá)產(chǎn)物是形態(tài)結(jié)構(gòu)類似禽流感病毒的禽流感VLPs而非游離的HA、NA等蛋白。開展的其他研究顯示,基于VLP01株的禽流感VLPs疫苗在靶動物上一次免疫能夠產(chǎn)生不低于6log2的血凝抑制抗體,并可抵御相同分支的H5N1禽流感病毒的攻擊,不發(fā)病、不排毒,即禽流感VLPs具有禽流感病毒相似的免疫原性。綜上,昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建的重組桿狀病毒載體禽流感疫苗有被開發(fā)成為新型禽流感疫苗產(chǎn)品的可能。

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