鷹嘴豆分離蛋白對豬肉肌原纖維蛋白乳化特性的影響

栗俊廣，張旭玥，陳宇豪，王昱，劉驍，白艷紅

1.鄭州輕工業(yè)大學 食品與生物工程學院， 河南 鄭州 450001；

2.河南省冷鏈食品質量與安全控制重點實驗室， 河南 鄭州 450001

0 引言

肌原纖維蛋白(Myofibrillar Protein，MP)是肌肉蛋白質中最主要的一種，約占肌肉總蛋白質含量的50%[1]. 肌原纖維蛋白的乳化特性直接決定肉制品的質構和持水保油能力，在肉類加工中對脂肪和水分的固定起著至關重要的作用. 在肉制品的儲藏加工過程中，肌原纖維蛋白易受外界環(huán)境影響，如冷凍、加熱等均可使其溶解度降低、乳化特性減弱，從而影響肉制品的品質[2]. 此時，添加外源植物蛋白(如大豆蛋白、乳清蛋白等)是改善肌原纖維蛋白乳液特性的常用手段，可以有效改善肌原纖維蛋白乳化特性，提高肉制品的品質[3-4].

鷹嘴豆(CicerarietinumLinn.)是世界第二大消費豆類，因其極高的蛋白質功效比值、生物利用價值和消化吸收率贏得了“豆中之王”的稱號，近年來在中國云南、甘肅、新疆等地大面積種植[5]. 鷹嘴豆的蛋白質含量約占鷹嘴豆種子總質量的22%，并含有人體所需的18種氨基酸及8種必需氨基酸[6-7]. 鷹嘴豆分離蛋白(Chickpea Protein Isolate，CPI)是從鷹嘴豆中提取出的一種高純度蛋白質，具有較高的溶解性、吸水性、保水性及乳化特性[8-11]，在肉制品生產加工中具有很好的應用前景. 目前，國內外學者對大豆分離蛋白與豬肉肌原纖維蛋白的相互作用已有大量研究.例如，梁婧等[12]建立了改性大豆分離蛋白與豬肉肌原纖維蛋白共混體系，發(fā)現(xiàn)經熱改性處理后，該共混體系的乳化特性和凝膠特性均顯著提高；朱佳倩等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在豬肉肌原纖維蛋白中添加質量分數(shù)為10%的大豆分離蛋白可以顯著提高混合凝膠的凝膠強度和保水性，而CPI對肌原纖維蛋白乳化特性的影響還鮮有報道. 基于此，本研究擬向豬肉肌原纖維蛋白中添加不同質量分數(shù)的CPI，研究其對豬肉肌原纖維蛋白乳液的乳化活性(Emulsion Activity Index，EAI)、乳化穩(wěn)定性(Emulsion Stability Index，ESI)、流變特性等乳化特性的影響，以期為CPI在肉制品加工中的應用提供理論依據(jù)和參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鷹嘴豆，產自云南省文州自治區(qū)丘北市天星鄉(xiāng)；豬里脊肉、金龍魚大豆油，購于鄭州丹尼斯百貨有限公司；標準牛血清蛋白(Bovine Albumin，BSA)，北京索萊寶科技有限公司產. NaCl、MgCl2、NaH2PO4、Na2HPO4、HCl、NaOH，天津市大茂化學試劑廠產；十二烷基硫酸鈉(SDS)，上海源葉生物有限公司產；正己烷，天津市富宇精細化工有限公司產；乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)，北京華邁科生物技術有限責任公司產.以上化學試劑均為分析純.

1.2 主要儀器與設備

AB265-S型分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產；JA3003N型電子天平，上海箐海儀器設備有限公司產；101C-4型電熱恒溫鼓風烘箱，上海一恒科學儀器有限公司產；LM3100型錘式實驗粉碎磨，瑞典波通公司產；T25型數(shù)顯型高速勻漿機，德國IKA公司產；Lab-1-50型冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司產；SZ-22A型絞肉機，廣州旭眾食品機械有限公司產；GM200型刀式研磨儀，德國萊馳公司產；HH-42型水浴鍋，常州國華電器有限公司產；Discovery型流變儀，美國TA儀器公司產；TU-1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司產;TURBTSCAN LAB型穩(wěn)定性分析儀，法國Formulaction儀器公司產.

1.3 實驗方法

1.3.1CPI的提取參考栗俊廣等[14]的方法，將脫脂鷹嘴豆粉與去離子水混合，調節(jié)混合溶液pH值至10.0，于40 ℃水浴條件下連續(xù)攪拌至充分溶解；于6000 r/min條件下離心15 min，將沉淀重復提取兩次并收集上清液，調節(jié)上清液pH值至等電點后再次離心；收集蛋白沉淀物并加少量去離子水復溶，調節(jié)復溶溶液pH值為7.0，真空冷凍干燥后即到CPI.

1.3.2CPI化學成分的測定CPI水分、脂肪、蛋白質、灰分等化學成分均按照國標規(guī)定的檢測方法進行測定[15-18].

1.3.3CPI理化性質的測定按照E.S.Tan等[19]的方法，分別測定CPI的持水力、持油力、乳化活性和乳化穩(wěn)定性. 將0.1 g CPI與1.5 mL蒸餾水或大豆油(密度為0.912 g/mL)于10 mL離心管中渦旋混合1 min后稱重，在室溫下孵育30 min，于6526 r/min轉速下離心30 min，棄上清液后稱重. CPI的持水力和持油力分別按式①和式②計算：

①

②

式中，m1為樣品、蒸餾水和離心管總質量/g；m2為棄上清液后混合樣品和離心管總質量/g；m3為樣品、大豆油和離心管總質量/g；m4為棄上清液后混合樣品和離心管總質量/g.

用生理鹽水緩沖液(0.6 mol/L NaCl，50 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH值為7.0)將CPI的質量濃度調整為0.1 mg/mL，加入與樣品總體積相同的大豆油，使用高速勻漿機在10 000 r/min轉速下勻漿2 min，再于3197 r/min轉速下離心5 min，測量乳化液層高度. 對于乳液穩(wěn)定性分析，按照上述方法制備樣品后，于80 ℃條件下孵育30 min，于3197 r/min轉速下離心5 min，測量乳化液層高度. CPI的乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別按式③和式④計算：

③

④

式中，VE為乳化層體積/mL；VT為總體積/mL；R為于80 ℃條件下孵育30 min后的乳化層體積/mL；Ri為初始乳化層體積/mL.

1.3.4 豬肉肌原纖維蛋白的提取按照J.G.Li等[20]的方法，將豬里脊肉解凍后，倒入4倍體積的冰肌原纖維蛋白提取液(0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，10 mmol/L MgCl2和1 mmol/L EGTA，pH 值為7.0)，使用高速勻漿機在10 000 r/min的轉速下勻漿60 s(每勻漿20 s間歇20 s)，于5460 r/min轉速下離心15 min，棄上清液，并重復上述步驟兩次；再加入4倍體積的冰NaCl溶液(0.1 mol/L)洗滌蛋白沉淀物，并于5460 r/min轉速下離心15 min，棄上清液，重復該步驟3次，在最后一次離心前過濾，即得純凈的豬肉肌原纖維蛋白；將該蛋白置于冰水浴中，于4 ℃條件下儲存，最長存放2 d. 豬肉肌原纖維蛋白質量濃度采用雙縮脲法進行測定，以BSA作為標準蛋白繪制標準曲線.

1.3.5 豬肉肌原纖維蛋白乳液的制備用生理鹽水緩沖液將豬肉肌原纖維蛋白的質量濃度調整為10 mg/mL. 分別加入質量分數(shù)為0、0.3%、0.6%、0.9%和1.2%的CPI，使用高速勻漿機在10 000 r/min的轉速下勻漿60 s(每勻漿20 s間歇20 s)，于2229 r/min轉速下離心5 min，以趕出蛋白中的氣泡. 取20 mL混合蛋白溶液，加入總溶液體積20%的大豆油后混勻，即制得豬肉肌原纖維蛋白乳液. 將該乳液置于冰浴條件下，并于0～4 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆?

1.3.6 豬肉肌原纖維蛋白乳液EAI指數(shù)和ESI指數(shù)的測定參考K.N.Pearce等[21]的濁度法，并稍加修改. 吸取50 μL豬肉肌原纖維蛋白乳液，再加入5 mL質量分數(shù)為0.1% 的SDS溶液，漩渦振蕩混勻后，于500 nm波長處測其吸光度，記為A0. 從乳液制備好即開始計時，10 min后再次從乳液底部相同位置吸取50 μL勻漿乳液，按照上述方法混合并測其吸光度，記為A10. 分別按照如下公式計算乳液的EAI指數(shù)和ESI指數(shù)：

⑤

⑥

式中，C為蛋白質質量濃度/(g·mL-1)；φ為油相體積分數(shù)，φ=20%.

1.3.7 豬肉肌原纖維蛋白乳液流變特性的測定按照K.Li等[22]的方法，并稍加修改. 取1.3.5中制備好的豬肉肌原纖維蛋白乳液，將乳液充分覆蓋在40 mm平板底座測試平臺上，切邊后使用硅油密封. 夾縫間距0.5 mm，頻率0.1 Hz，應變1%，初始溫度25 ℃. 在25 ℃條件下保溫5 min后，以1 ℃/min的升溫速率加熱至90 ℃. 測試指標為流變儲能模量G′.

1.3.8 豬肉肌原纖維蛋白乳液總體穩(wěn)定指數(shù)的測定使用穩(wěn)定性分析儀測定乳液的總體穩(wěn)定指數(shù). 將被測樣品裝入樣品池中，溫度為室溫(20 ℃)，設定掃描時間1 h和掃描間隔時間4 s. 測定樣品的透射光(T)和被樣品反射后的背散射光(Backscattering，BS)，通過軟件分析總體穩(wěn)定指數(shù)曲線獲得乳液的總體穩(wěn)定指數(shù).

1.3.9 豬肉肌原纖維蛋白乳液乳析指數(shù)的測定參考劉競男等[23]的方法，并稍加修改. 將1.3.5制備好的豬肉肌原纖維蛋白乳液立即裝入帶刻度的10 mL玻璃試管中，于4 ℃環(huán)境下分別靜置1 h、2 h、4 h、8 h，記錄乳析界面的高度變化. 按式⑦計算乳液的乳析指數(shù)：

⑦

式中，H0為清液的高度/cm；Ht為乳液的初始高度/cm.

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個實驗至少重復3次，每個樣品的各項指標至少平行測定3次，實驗結果以(平均值±標準差)表示. 采用SPSS 22.0中的Duncan′s test檢驗進行組間平均值顯著性分析，利用Origin9.0作圖.

2 結果與分析

2.1 CPI的化學成分和理化性質分析

CPI化學成分的測定結果顯示，CPI中含 (6.03±0.85)%的水分、(1.90±0.22)%的脂肪、(3.80±0.28)%的灰分及 (81.90±4.22)%的蛋白質. 蛋白質持水力、持油力的大小是評價蛋白質品質的重要指標，持油力越高，蛋白質與脂質的結合能力越強. CPI理化性質的測定結果顯示，每g CPI的持水力為 (3.21±0.08) g，持油力為 (5.85±0.35) g，高于已有報道的米糠蛋白((2.60±0.00) g,(5.00±0.30) g)和大豆蛋白((3.10±0.20) g,(2.60±0.10) g)；每g CPI的乳化活性為(28.17±1.34) m2，也高于該報道中測定的大豆分離蛋白((12.13±0.55) m2)[24]. 顧楠等[25]研究發(fā)現(xiàn)的CPI乳化穩(wěn)定性(75%)低于本研究測得的結果(87.14±2.22)%.CPI的乳化穩(wěn)定性差異可能與鷹嘴豆種類、提取方法、處理手段的差異有關. 本研究提取的CPI具有良好的持水力、持油力和乳化特性.

2.2 CPI添加量對豬肉肌原纖維蛋白乳液EAI的影響分析

EAI是指蛋白質在形成乳液過程中在油-水界面的吸附能力，它取決于蛋白質-油或蛋白質-蛋白質之間的相互作用[26]. CPI添加量對豬肉肌原纖維蛋白乳液EAI的影響如圖1所示，其中不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05,下同).由圖1可以看出，隨著CPI添加量的增加，豬肉肌原纖維蛋白乳液的EAI指數(shù)呈逐漸升高的趨勢. 未添加CPI時，豬肉肌原纖維蛋白乳液的EAI指數(shù)為24.54 m2/g；隨著CPI添加量的增加，豬肉肌原纖維蛋白乳液的EAI指數(shù)顯著升高(P<0.05)，并在CPI添加量為1.2%時達到最大值，為30.49 m2/g. 這表明CPI的加入可提升豬肉肌原纖維蛋白的乳化能力，并在其添加量為1.2%時，豬肉肌原纖維蛋白能乳化的油量最多.

圖1 CPI添加量對豬肉肌原纖維蛋白乳液EAI的影響Fig.1 Effect of CPI addition on EAI of pork myofibrillar protein emulsion

2.3 CPI添加量對豬肉肌原纖維蛋白乳液ESI的影響分析

ESI可表征加工過程中蛋白質維持乳液體系穩(wěn)定不分層的能力[27]. CPI添加量對豬肉肌原纖維蛋白乳液ESI的影響如圖2所示. 由圖2可以看出，未添加CPI的肌原纖維蛋白乳液，其ESI指數(shù)為33.2%. 隨著CPI添加量的增加，肌原纖維蛋白乳液的ESI指數(shù)逐漸升高(P<0.05)，當CPI添加量為0.9%時達到最大值，為94.41%，此時的ESI指數(shù)與CPI添加量為0.6%和1.2%的組別之間無顯著差異(P>0.05)，且3個處理組乳液的ESI指數(shù)均顯著高于未添加CPI組. 這表明添加CPI能夠顯著提升豬肉肌原纖維蛋白乳液的穩(wěn)定性，并在CPI的添加量為0.6%～1.2%時ESI指數(shù)相對較高且穩(wěn)定.

2.4 CPI添加量對豬肉肌原纖維蛋白乳液流變特性的影響分析

CPI添加量對豬肉肌原纖維蛋白乳液儲能模量G′的影響如圖3所示. 由圖3可以看出，在30～50 ℃時，所有處理組乳液的流變儲能模量G′均隨溫度的升高而逐漸緩慢增大，然后迅速增大，并在52～54 ℃達到最大值. 隨后，G′急劇下降，并在61 ℃時降到最小. 之后，G′再次隨溫度的升高而逐漸增大. 與未添加CPI組相比，豬肉肌原纖維蛋白乳液的G′隨著CPI添加量的增加而增大，且在CPI添加量為1.2%時達到最大值. 這表明添加CPI能提升豬肉肌原纖維蛋白乳液熱誘導形成的凝膠的保水能力，且能提升豬肉肌原纖維蛋白乳液的凝膠強度，使其形成更穩(wěn)定的乳化凝膠網絡.

圖3 CPI添加量對豬肉肌原纖維蛋白乳液儲能模量G′的影響Fig.3 Effect of CPI addition on storage modulus (G′) of pork myofibrillar protein emulsion

2.5 CPI添加量對豬肉肌原纖維蛋白乳液總體穩(wěn)定指數(shù)的影響分析

總體穩(wěn)定指數(shù)可以快速、簡便地表征樣品的穩(wěn)定性，而近紅外脈沖光源可以快速分析半液態(tài)、液態(tài)溶液等分散體系的乳化現(xiàn)象. 分散相粒子的體積分數(shù)和平均粒徑可影響散射光強度的變化程度，決定體系的穩(wěn)定程度，總體穩(wěn)定指數(shù)曲線越低表明體系的總體穩(wěn)定性越好[28]. CPI添加量對豬肉肌原纖維蛋白乳液總體穩(wěn)定指數(shù)的影響如圖4所示. 由圖4可以看出，隨著CPI添加量的增加，豬肉肌原纖維蛋白乳液的總體穩(wěn)定性逐漸升高，當CPI添加量為1.2%時，總體穩(wěn)定指數(shù)最小，即乳液體系穩(wěn)定性最好，這與ESI分析結果一致，表明添加CPI能提升豬肉肌原纖維蛋白乳液的穩(wěn)定性.

圖4 CPI添加量對豬肉肌原纖維蛋白乳液總體穩(wěn)定指數(shù)的影響Fig.4 Effect of CPI addition on total stability index of pork myofibrillar protein emulsion

2.6 CPI添加量對豬肉肌原纖維蛋白乳液乳析指數(shù)的影響分析

新制備的乳液在靜置過程中，會隨著時間的推移而出現(xiàn)絮凝、聚集甚至乳化分層的現(xiàn)象，這與乳液的穩(wěn)定性密切相關. 乳液可分為上下兩層，頂層為乳化層，底層為水層，分層越明顯表明乳液體系的穩(wěn)定性越差[29]. 乳析指數(shù)反映了乳液中油滴聚集和絮凝的程度，乳析指數(shù)越小，乳液越穩(wěn)定[30]. CPI添加量對豬肉肌原纖維蛋白乳液乳析指數(shù)的影響如圖5所示. 由圖5可以看出，隨著CPI添加量的增加，乳析指數(shù)逐漸減小(P<0.05)，當CPI添加量為1.2%時，豬肉肌原纖維蛋白混合乳液的乳析指數(shù)最小，為2.9%，且顯著低于未添加CPI組(P<0.05)，該結果與ESI及總體穩(wěn)定指數(shù)分析結果一致. 這表明添加CPI能提升豬肉肌原纖維蛋白乳液的穩(wěn)定性.

圖5 CPI添加量對豬肉肌原纖維蛋白乳液乳析指數(shù)的影響Fig.5 Effect of CPI addition on creaming index of pork myofibrillar protein emulsion

3 結論

本文研究了添加不同質量分數(shù)的CPI對豬肉肌原纖維蛋白乳液的EAI、ESI、流變性能等乳化特性的影響，結果表明：添加CPI可以顯著提高豬肉肌原纖維蛋白乳液的EAI和ESI；隨著CPI添加量的增加，豬肉肌原纖維蛋白乳液的流變儲能模量G′逐漸升高，總體穩(wěn)定指數(shù)曲線逐漸降低，當CPI添加量為1.2%時，豬肉肌原纖維蛋白乳液的G′最大，總體穩(wěn)定指數(shù)和乳析指數(shù)均最小，乳液最穩(wěn)定.該研究結果表明添加CPI能改善豬肉肌原纖維蛋白的乳化特性，在肉制品加工中具有廣闊的應用前景.