NCEH1基因在肝癌組織與細(xì)胞系中的表達(dá)及生物學(xué)作用

曾裕文， 張芳雍， 譚國(guó)鉗,2， 吳 帆,2

1 暨南大學(xué)附屬?gòu)V州紅十字會(huì)醫(yī)院 肝膽外科， 廣州 510220； 2 廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院 肝膽外科， 廣州 510220

原發(fā)性肝癌的發(fā)病率持續(xù)增長(zhǎng)，已居惡性腫瘤死亡率的第四位[1]，盡管目前肝癌治療水平已有較大提高[2]，但其預(yù)后依然不容樂(lè)觀[3]。探索肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制及尋找有效的肝癌治療靶點(diǎn)仍是肝癌研究的重要內(nèi)容。已有研究[4-5]表明，中性膽固醇酯水解酶1(neutral cholesterol ester hydrolase 1，NCEH1)在侵襲性前列腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，抑制NCEH1的表達(dá)則可降低前列腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力，提示NCEH1是一促癌基因。然而截至目前，NCEH1在肝癌中的表達(dá)及作用均尚不清楚。本研究旨在了解NCEH1在肝癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)情況并探討其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移及侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 NCEH1基因樣本 選取2013年1月—2019年6月在暨南大學(xué)附屬?gòu)V州紅十字會(huì)醫(yī)院手術(shù)治療的32例肝癌患者標(biāo)本及對(duì)應(yīng)的癌旁組織。所有標(biāo)本離體后立即存放在液氮罐中，然后于-80 ℃深低溫箱中保存。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NCEH1基因的相對(duì)表達(dá)量。同時(shí)從ICGC數(shù)據(jù)庫(kù)(https://daco.icgc.org)下載截至2020年9月日本人群的肝癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)(包含240個(gè)肝癌樣本和220個(gè)正常肝組織樣本)作為驗(yàn)證組，應(yīng)用R軟件(4.0.2版本)中的limma、beeswarm包對(duì)NCEH1基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)并做散點(diǎn)差異圖進(jìn)行可視化[6]。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HL7702正常人肝臟細(xì)胞系和SMMC-7721、Bel-7402、HepG2和Hep3B人肝癌細(xì)胞系均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，293T細(xì)胞購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，以含10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，按常規(guī)進(jìn)行傳代。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 提取細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄，在熒光定量PCR儀(TP800，日本TAKARA公司)上行PCR檢測(cè)，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性15 s，然后95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，每次在延伸階段讀取吸光值。NCEH1引物為：上游5′- CCTGCCGTCCTTCCTTCTTC-3′；下游5′-CCGTGGTGCCCTGTATCATTA -3′。以管家基因GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)為內(nèi)參基因，引物序列為：上游5′- TGACTTCAACAGCGACACCCA -3′；下游5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA -3′。以2-ΔΔCT法分析各細(xì)胞系中NCEH1基因的相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)水平。若肝癌組織中的NCEH1基因表達(dá)水平高于相應(yīng)的癌旁組織，則為NCEH1表達(dá)上調(diào)。

1.4 慢病毒介導(dǎo)的小干擾RNA(siRNA) 慢病毒質(zhì)粒GV122、包裝質(zhì)粒pGC-LV、pHelper 1.0和pHelper2.0均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。設(shè)計(jì)針對(duì)NCEH1基因的shRNA序列如下，正義鏈：5′-CCGGATCCAGGCAGAATTTGCATTTCTCGAGAAATGCAAATTCTGCCTGGATTTTTTG-3′，反義鏈：5′AATTCAAAAAATCCAGGCAGAATTT-GCATTTCTCGAGAAATGCAAATTCTG- CCTGGAT-3′；陰性對(duì)照組序列為，正義鏈：5′-CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAA- GAGAA-CGTGACACGTTCGGAGAATTTTTG-3′,反義鏈：5′-AATTCAAAAATTCTCCGA- ACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAA-3′。上述序列由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成，將其所形成的雙鏈DNA分別連接到siRNA慢病毒質(zhì)粒GV122，再將上述質(zhì)粒分別與pGC-LV、pHelper1.0和pHelper2.0 3個(gè)包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至 293T 細(xì)胞，上述兩種慢病毒各自感染的SMMC-7721肝癌細(xì)胞系即被分別命名為NCEH1敲減組(KD組)和陰性對(duì)照組(NC組)。采用熒光倒置顯微鏡(micropublisher 3.3RTV，日本奧林帕斯公司)觀察兩組細(xì)胞的慢病毒感染效率，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)兩組細(xì)胞中NCEH1基因的相對(duì)表達(dá)水平，以檢測(cè)NCEH1基因的敲減率。

1.5 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力 將KD組及NC組SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，選取5塊96孔板，分別標(biāo)記為1、2、3、4、5 d；每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 μl細(xì)胞懸液，每板分別鋪3組細(xì)胞。從鋪板后第2天開(kāi)始，培養(yǎng)終止前4 h加入20 μl 5 mg/ml的MTT于孔中。4 h后完全吸去培養(yǎng)液，加100 μl DMSO溶解甲瓚顆粒。振蕩器振蕩2～5 min，酶標(biāo)儀490/570 nm檢測(cè)光密度(OD)值。

1.6 Annexin V-APC單染法檢測(cè)肝癌細(xì)胞凋亡率 將KD組及NC組SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，與上清細(xì)胞收集于同一5 ml離心管中。然后1300 r/min離心5 min，棄上清，4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞沉淀。1×binding buffer洗滌細(xì)胞沉淀一次，1300 r/min離心3 min，收集細(xì)胞，200 μl 1×binding buffer重懸細(xì)胞沉淀，加入10 μl Annexin V-APC染色，室溫避光10～15 min。根據(jù)細(xì)胞量，補(bǔ)加400～800 μl 1×binding buffer，上機(jī)檢測(cè)。

1.7 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞遷移能力 將KD組及NC組SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，根據(jù)細(xì)胞大小決定鋪板細(xì)胞密度。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第2天使用劃痕儀對(duì)準(zhǔn)96孔板的上端中央部位，向上輕推形成劃痕。使用PBS輕輕漂洗2～3遍，加入含1% FBS血清培養(yǎng)基，0 h掃板。再次于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，根據(jù)愈合程度選擇合適時(shí)間用Celigo掃板，用Celigo分析遷移面積并計(jì)算遷移率。

1.8 Transwell轉(zhuǎn)移和侵襲實(shí)驗(yàn) 將Transwell小室置于新的24孔板中，上室加100 μl無(wú)FBS培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中放置1 h。將KD組及NC組SMMC-7721細(xì)胞加入每個(gè)小室，下室內(nèi)加入含30% FBS的培養(yǎng)基600 μl，5% CO2、37 ℃孵育48 h。倒扣小室于吸水紙上以去除培養(yǎng)基，用棉拭子輕輕移去小室內(nèi)非轉(zhuǎn)移細(xì)胞，將小室置于4%多聚甲醛固定液中固定30 min后撈出，用吸水紙吸干小室表面固定液，滴1～2滴染色液到膜的下表面染色轉(zhuǎn)移細(xì)胞1～3 min后，將小室浸泡沖洗數(shù)次，空氣晾干。在顯微鏡下拍照并計(jì)算各組轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)。如將Transwell小室先鋪Matrigel膠再重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟即為Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.9 倫理學(xué)審查 本研究通過(guò)暨南大學(xué)附屬?gòu)V州紅十字會(huì)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，批號(hào)：穗紅院醫(yī)倫審2019-028-01。所有標(biāo)本采集前均已獲患者知情同意。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織中NCEH1的表達(dá) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在32例患者標(biāo)本中，有22例肝癌組織中的NCEH1基因表達(dá)上調(diào)，NCEH1基因在肝癌組織中的平均表達(dá)量高于相應(yīng)的癌旁組織(Z=2.263，P=0.024)(圖1a)。下載ICGC數(shù)據(jù)庫(kù)中日本人群的肝癌標(biāo)本(包含240個(gè)肝癌樣本，202個(gè)正常肝組織樣本)，篩選出每個(gè)樣本中NCEH1基因表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，NCEH1基因在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常肝組織(U=18 768，P<0.001)(圖1b)。

注：a，NCEH1基因在32例肝癌及癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量；b，ICGC數(shù)據(jù)庫(kù)中NCEH1基因在肝癌中的表達(dá)量。

2.2 NCEH1在肝癌細(xì)胞系中的相對(duì)表達(dá)水平t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，NCEH1在中等侵襲轉(zhuǎn)移潛能的SMMC-7721和Bel-7402細(xì)胞系中的相對(duì)表達(dá)量較低或無(wú)侵襲轉(zhuǎn)移潛能的HepG2(0.004 2±0.000 2 vs 0.002 9±0.000 4，t=4.651，P=0.01；0.003 9±0.000 3 vs 0.002 9±0.000 4,t=3.218,P=0.03)和Hep3B細(xì)胞系高(0.004 2±0.000 2 vs 0.002 7±0.000 2,t=9.496,P=0.001；0.003 9±0.000 3 vs 0.002 7±0.000 2，t=3.218,P=0.005)；而NCEH1在低或無(wú)侵襲轉(zhuǎn)移潛能的HepG2和Hep3B細(xì)胞系中的相對(duì)表達(dá)量較正常HL-7702肝細(xì)胞系高(0.002 9±0.000 4 vs 0.001 5±0.000 1,t=5.682,P=0.005; 0.002 7±0.000 2 vs 0.001 5±0.000 1,t=11.302,P=0.000 3)。

2.3 慢病毒的感染效率及NCEH1基因敲減效率 熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，KD組及NC組慢病毒對(duì)肝癌細(xì)胞的感染效率均達(dá)到80%以上，KD組SMMC-7721細(xì)胞中NCEH1基因的相對(duì)表達(dá)量?jī)H為NC組細(xì)胞的26.0%(0.260±0.035 vs 1.004±0.106，t=11.578，P=0.000 3)，即NCEH1基因在SMMC-7721人肝癌細(xì)胞系中的敲減效率達(dá)到了74.0%(圖2)。

注：a，KD組熒光視野(×200)；b，NC組熒光視野(×200)；C，KD組明視野(×200)；d，NC組明視野(×200)；e，KD組和NC組實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果比較。

2.4 NCEH1敲減對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力的影響 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，KD組SMMC-7721肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)速度較NC組明顯減緩(第5天相對(duì)增殖倍數(shù)為3.055±0.046 vs 4.462±0.060，t=32.100，P=0.000 006)，提示NCEH1基因敲減明顯抑制了肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖(圖3)。

圖3 MTT檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 敲減NCEH1基因?qū)Ω伟┘?xì)胞凋亡的影響 Annexin V-APC單染法流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，KD組SMMC- 7721肝癌細(xì)胞凋亡率明顯高于NC組(6.650%±0.203% vs 3.150%±0.090%，t=27.303，P=0.000 01)，提示敲減NCEH1基因可促進(jìn)細(xì)胞凋亡(圖4)。

2.6 敲減NCEH1基因?qū)Ω伟┘?xì)胞遷移能力的影響 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，KD組的SMMC-7721肝癌細(xì)胞遷移率明顯低于NC組(34.68%±1.89% vs 54.37%±4.23%，t=9.51，P=0.000 01)，提示敲減NCEH1基因可明顯抑制肝癌細(xì)胞的遷移能力(圖5)。

注：a，KD組流式細(xì)胞分析結(jié)果；b，NC組流式細(xì)胞分析結(jié)果；c，KD組和NC組肝癌細(xì)胞凋亡率比較。

注：a，KD組肝癌細(xì)胞劃痕后0 h的熒光照片；b，NC組肝癌細(xì)胞劃痕后0 h的熒光照片；c，KD組肝癌細(xì)胞劃痕后56 h的熒光照片；c，NC組肝癌細(xì)胞劃痕后56h的熒光照片；e，KD組和NC組肝癌細(xì)胞遷移率比較。

2.7 敲減NCEH1基因?qū)Ω伟┘?xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，KD組SMMC-7721肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)明顯低于NC組(12.89±3.63 vs 75.04±7.65，t=38.123，P<0.000 1)，提示NCEH1基因敲減可明顯抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力(圖6)。

注：a，KD組肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移穿過(guò)聚碳脂膜的顯微鏡照片(×100)；b，NC組肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移穿過(guò)聚碳脂膜的顯微鏡照片(×100)；c，KD組和NC組肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移數(shù)比較。

2.8 敲減NCEH1基因?qū)Ω伟┘?xì)胞侵襲能力的影響 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，KD組的SMMC-7721肝癌細(xì)胞侵襲數(shù)明顯低于NC組(63.67±8.86 vs 144.52±16.60，t=22.331，P<0.000 1)，提示NCEH1基因敲減可明顯抑制肝癌細(xì)胞的侵襲能力(圖7)。

注：a，KD組肝癌細(xì)胞侵襲小室實(shí)驗(yàn)顯微照片(×100)；b，NC組肝癌細(xì)胞侵襲小室實(shí)驗(yàn)顯微照片(×100)；c，KD組和NC組肝癌細(xì)胞中侵襲細(xì)胞數(shù)比較。

3 討論

肝癌在全球的發(fā)病率和死亡率較高，據(jù)估計(jì)2015年全球肝癌死亡人數(shù)約為80萬(wàn)[7]，而在全球每年新增肝癌病例中，約一半發(fā)生在我國(guó)，已成為最致命的癌癥之一[8]。盡管針對(duì)肝癌的治療手段眾多，手術(shù)切除仍然是治療肝癌的首選方案，但由于肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)率相對(duì)較高，導(dǎo)致肝癌術(shù)后5年無(wú)復(fù)發(fā)生存率僅為38%，嚴(yán)重限制了肝癌的總體治療效果[9-10]。因此，探索肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制以獲得有效的肝癌治療靶點(diǎn)已成為肝癌研究的重點(diǎn)。

近年來(lái)的研究表明，脂代謝異?？赡苁谴龠M(jìn)癌癥發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要因素，Jiang等[11]通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，改變細(xì)胞內(nèi)膽固醇的分布，可有效抑制肝細(xì)胞癌的增殖和轉(zhuǎn)移。Lin等[12]通過(guò)脂質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)代謝的改變與腫瘤侵襲性、生長(zhǎng)和增殖密切相關(guān)，目前也已發(fā)現(xiàn)多個(gè)脂質(zhì)代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶在腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)[13-14]，這為肝癌治療提供了一個(gè)新思路。NCEH1是一個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，定位于人染色體3q26.31，大小為80 970 bp。NCEH1基因編碼的蛋白由408個(gè)氨基酸組成，大小為45.808 kD，是一種絲氨酸水解酶，在巨噬細(xì)胞和中樞神經(jīng)細(xì)胞中有較高表達(dá)[15-16]，并在調(diào)節(jié)膽固醇代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4]。已有研究[17-18]發(fā)現(xiàn)，NCEH1表達(dá)產(chǎn)物可作為乙醚脂質(zhì)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中連接血小板活化因子和溶血磷脂酸的中心節(jié)點(diǎn)，抑制NCEH1表達(dá)產(chǎn)物可降低癌細(xì)胞中的醚脂質(zhì)代謝并抑制腫瘤細(xì)胞遷移和生長(zhǎng)。Chang等[5]的研究則發(fā)現(xiàn)，選擇性NCEH1抑制劑可明顯降低人前列腺癌細(xì)胞系的遷移、侵襲、存活及增殖能力，提示NCEH1可能與腫瘤的侵襲、遷移及增殖相關(guān)，但NCEH1在肝癌中的表達(dá)水平及作用目前均不清楚。

為此，本研究首先通過(guò)對(duì)本院32例肝癌及對(duì)應(yīng)癌旁標(biāo)本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，NCEH1在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織，然后分析ICGC數(shù)據(jù)庫(kù)中日本人群的肝癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，NCEH1在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于正常肝組織，與本研究結(jié)果一致，提示NCEH1在肝癌組織中的表達(dá)上調(diào)。繼而，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，NCEH1在所有肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)均高于正常肝細(xì)胞系，這與其在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)的結(jié)果一致。更重要的是，NCEH1在侵襲轉(zhuǎn)移潛能較高的肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于低侵襲轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞系，這與Chang等[5]在前列腺癌細(xì)胞系中的結(jié)果一致，提示NCEH1與肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究采用慢病毒介導(dǎo)的siRNA技術(shù)敲減NCEH1在SMMC-7721肝癌細(xì)胞系(該細(xì)胞系的NCEH1表達(dá)水平在筆者檢測(cè)的4株肝癌細(xì)胞系中為最高)中的表達(dá)，結(jié)果顯示，NCEH1基因的敲減效率高達(dá)74.0%，NCEH1基因敲減的SMMC-7721肝癌細(xì)胞系得以成功建立。接下來(lái)，本研究采用MTT生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞流式檢測(cè)及Transwell轉(zhuǎn)移和侵襲實(shí)驗(yàn)等一系列細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)觀察NCEH1在肝癌細(xì)胞中的功能，結(jié)果顯示,NCEH1基因敲減可明顯降低肝癌細(xì)胞系的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲能力并促進(jìn)凋亡，這些結(jié)果也均與Chang等[5]在前列腺癌細(xì)胞中獲得的結(jié)果一致，提示NCEH1可能是一個(gè)潛在的肝癌治療靶點(diǎn)。

對(duì)于NCEH1表達(dá)及發(fā)揮作用的分子調(diào)控機(jī)制的研究相對(duì)較少，Cheung等[19]發(fā)現(xiàn)在牛皮癬皮膚的皮下脂肪組織中miR-26b-5p高度上調(diào)，而NCEH1是miR-26b-5p的直接靶點(diǎn)之一，miR-26b-5p可靶向下調(diào)NCEH1的表達(dá)。現(xiàn)有的研究顯示，miR-26b-5p在不同腫瘤組織中均起著抑癌作用[20]，其在肝癌細(xì)胞系中明顯下調(diào)，且與肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[21-22]。而miRNA被認(rèn)為可調(diào)控60%蛋白質(zhì)編碼基因，并參與幾乎所有細(xì)胞過(guò)程的調(diào)控[18,23]。筆者據(jù)此推測(cè)miR-26b-5p在肝癌中也可能存在對(duì)NCEH1基因表達(dá)的負(fù)向調(diào)控，即miR-26b-5p的下調(diào)可能促使NCEH1基因在肝癌組織中的表達(dá)上調(diào)，并因此增強(qiáng)了肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移及侵襲能力。然而，NCEH1在肝癌中表達(dá)升高及發(fā)揮生物學(xué)作用的具體分子機(jī)制均尚有待于進(jìn)一步研究闡明。

綜上所述，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NCEH1基因在肝癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)明顯升高，體外實(shí)驗(yàn)中可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移并抑制凋亡，提示其可能是一個(gè)潛在的肝癌治療靶點(diǎn)。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：曾裕文負(fù)責(zé)資料分析、擬定寫(xiě)作思路、收集數(shù)據(jù)、撰寫(xiě)論文、修改論文；張芳雍、譚國(guó)鉗參與指導(dǎo)撰寫(xiě)文章、收集數(shù)據(jù)、修改論文；吳帆負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。