EB病毒相關(guān)性移植后淋巴組織增生性疾病生物標志物的相關(guān)進展

艾亮 張盛 王強 李夏 成柯

愛潑斯坦-巴爾病毒（Epstein-Barr virus，EBV）相關(guān)性移植后淋巴組織增生性疾?。╬osttransplant lymphoproliferative disease，PTLD）是造血干細胞及實體器官移植術(shù)后因免疫功能障礙導致從多克隆增生到非霍奇金淋巴瘤的一組疾病[1]。EBV是隸屬于γ皰疹病毒的DNA病毒，人類是其唯一宿主，主要侵襲人B細胞與口咽部上皮細胞。EBV人群易感性高，主要通過飛沫傳播，實體器官移植受者還可能經(jīng)由EBV血清學陽性的供者或輸注未去除白細胞成分的血制品感染。PTLD是一系列異質(zhì)性疾病病變，包括病理類型、臨床特征和預后異質(zhì)性等。病理學類型表現(xiàn)可以從反應性多克隆B細胞良性增生到惡性侵襲性的淋巴瘤，超過70%與EBV感染相關(guān)[1-2]。

EBV相關(guān)性PTLD是兒童器官移植受者中最常見的惡性腫瘤，在兒童腎移植受者中發(fā)生率為3%～7%，其發(fā)展迅速并可能致命，病死率約為50%[3-4]。EBV相關(guān)性PTLD的治療方案包括減少或撤除免疫抑制劑、化學藥物治療、放射治療、抗CD20抗體利妥昔單抗治療及手術(shù)切除等[5]。 然而， 這些方法的療效尚未確定，復發(fā)率和治療相關(guān)的病死率高是目前臨床面臨的主要問題，且缺乏個體化治療方案，最佳治療方案尚沒有形成共識。鑒于這些挑戰(zhàn)，迫切需要開發(fā)微創(chuàng)生物標志物，以改善器官移植受者EBV相關(guān)性PTLD的早期診斷、個性化管理和治療。本綜述旨在闡明實體器官移植術(shù)后EBV相關(guān)性PTLD的細胞、分子和遺傳特征，并討論其作為潛在生物標志物的可能性。

1 EBV的生命周期和免疫反應

1.1 EBV的生命周期

EBV通常通過唾液從被感染的個體傳播到宿主，但在器官移植特別是兒童器官移植中，EBV可通過移植物進行傳播，如受者EBV血清學陰性，但接受了EBV血清學陽性供者的器官。EBV感染后，首先進入裂解階段，在口咽部復制，涉及上皮細胞和B細胞，并在產(chǎn)生新病毒子代時達到頂峰。病毒顆粒會脫落并繼續(xù)感染其他細胞，或被傳播到另一個宿主。在免疫功能正常的個體中，裂解階段一般無癥狀，但青少年和年輕人可發(fā)生傳染性單核細胞增多癥（infectious mononucleosis，IM），通常為自限性。最終，EBV過渡到一個慢性的潛伏階段，隱藏在宿主的記憶性B細胞中。EBV可以周期性地重新激活，可能是由感染細胞的B細胞受體的抗原接觸所觸發(fā)，但這一過程的確切機制仍不清楚。

1.2 EBV的免疫反應

個體感染EBV后，EBV囊膜上的gp350/220蛋白與B細胞上的CD21結(jié)合，通過細胞內(nèi)吞作用進入B細胞，導致B細胞感染。這些EBV感染的B細胞可以表達潛伏膜蛋白（latent membrane proteins，LMP）和EBV核抗原，進而被宿主識別，通過CD8+細胞毒T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）對其進行殺傷和清除[6]。這種細胞毒性效應可以減少EBV感染的B細胞數(shù)量，但是卻不能將其徹底清除，因為EBV還能感染記憶性B細胞，并且表達的LMP1可以上調(diào)抗凋亡基因的表達，以及誘導B細胞進入潛伏感染狀態(tài)，從而減少病毒抗原的表達，避免CTL的殺傷[6]。因此，EBV感染的B細胞與宿主的免疫系統(tǒng)處于動態(tài)平衡的狀態(tài)。但對于接受免疫抑制治療的實體器官移植受者，B細胞凋亡觸發(fā)過程受到抑制，使得EBV誘發(fā)的B細胞增殖與免疫系統(tǒng)（增殖、凋亡）間的平衡被破壞，異常B細胞克隆性增生，導致PTLD。

另外，亦有文獻報道T細胞與EBV的免疫應答有關(guān)[7]。病毒生命周期的每個階段都與特定病毒蛋白的表達相關(guān)，這些病毒蛋白能夠引發(fā)由T細胞（主要是CD8+T細胞）介導的細胞免疫反應，CD4+T細胞也發(fā)揮了一定的作用[8]。但受者感染EBV后，機體所發(fā)生的免疫應答過程，特別是繼續(xù)發(fā)展為EBV相關(guān)性PTLD的過程，目前尚不清楚。在這個過程中，免疫抑制劑對T細胞功能的抑制被認為是EBV相關(guān)性PTLD發(fā)展的主要因素。

2 EBV監(jiān)測的方法及臨床意義

2.1 EBV監(jiān)測的方法

EBV血清學檢測通常用于評估病毒感染狀態(tài)，并且可以針對EBV編碼的潛伏周期蛋白特異性抗體[9]。然而，由于免疫狀態(tài)的改變，移植受者血清學的變化更為復雜。因此，基于聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）直接定量EBV DNA的方法被廣泛用于監(jiān)測移植術(shù)后病毒載量，特別是在EBV陰性兒童受者接受來自EBV陽性供者的移植物中。雖然EBV相關(guān)性PTLD可以在移植術(shù)后的任何時候出現(xiàn)，但在移植術(shù)后1年內(nèi)，即免疫抑制最強的時期，發(fā)生率最高，因此在這一時期監(jiān)測最為重要。此外，PCR可用于EBV相關(guān)性PTLD出現(xiàn)癥狀時的EBV監(jiān)測，也可用于監(jiān)測EBV相關(guān)性PTLD的治療反應。通常EBV DNA載量的閾值由各實驗室確定，不利于跨中心比較。世界衛(wèi)生組織對于EBV國際標準的制定將有助于各中心基于PCR的EBV DNA定量的協(xié)調(diào)統(tǒng)一[10]。然而，目前尚不清楚哪種方式對病毒定量分析最有效。大多數(shù)研究采用全血或血漿，但也有少量研究利用血清、外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）或分離的B細胞來評估EBV DNA載量。有研究發(fā)現(xiàn)在不同器官樣本中，EBV DNA載量閾值、使用的檢測量有顯著差異[11]。因此，當早期診斷PTLD時，評估這些信息對于監(jiān)測EBV DNA載量具有重要意義。

2.2 EBV監(jiān)測的臨床意義

由于EBV相關(guān)性PTLD的臨床表現(xiàn)多樣，缺乏特異性，而EBV DNA載量與EBV相關(guān)性PTLD 的發(fā)生發(fā)展及演化過程變化相一致，實驗室血清學檢測EBV抗體靈敏度不高，因此，EBV特異性抗體可用于判斷移植前供、受者EBV血清學狀態(tài)，以評估PTLD的發(fā)生風險；而動態(tài)測定EBV DNA載量對于高?；颊咝g(shù)后早期PTLD的診斷以及治療具有重要的指導意義。

一項單中心研究提示，兒童肝移植術(shù)后PTLD患者的EBV DNA載量≥10 000 copies/mL是有臨床意義的，EBV DNA載量=10 875 copies/mL可作為臨界值，靈敏度為0.929，特異度為0.379，密切監(jiān)測EBV DNA載量對兒童肝移植受者PTLD的早期診斷和正確治療至關(guān)重要[12]。另一項單中心研究提示，兒童腎移植術(shù)后PTLD患者EBV DNA載量的最大峰值高于整體觀察到的中位數(shù)（59 909 copies/mL）是非早期病變PTLD和所有PTLD發(fā)病的獨立危險因素，高EBV DNA載量與PTLD的發(fā)生有關(guān)[13]。

3 EBV相關(guān)性PTLD的生物標志物

美國國立衛(wèi)生研究所于2001年將生物標志物定義為一種能客觀測量并評價正常生物過程、病理過程或?qū)λ幬锔深A反應的指示物[14]。生物標志物的發(fā)現(xiàn)、驗證和可重復性測試是一個嚴格的、多步驟的過程，必須應用各種統(tǒng)計測試來建立[15]。雖然目前已有關(guān)于EBV相關(guān)性PTLD腫瘤標本的研究，但還沒有確定的用于EBV相關(guān)性PTLD的生物標志物。

3.1 病毒核酸和蛋白質(zhì)

組織中病毒核酸和蛋白質(zhì)檢測可用于確定組織中EBV的存在。Epstein-Barr編碼區(qū)（Epstein-Barr encoding region，EBER）的原位雜交是檢測組織切片中EBV的標準方法。EBER檢測可用于提示潛伏性EBV感染，并有助于將病毒定位于病變內(nèi)的特定細胞類型。LMP1是一種EBV編碼的潛伏周期蛋白，可通過免疫組織化學染色鑒別組織標本中EBV感染的細胞。但也有專家認為，鑒于抗LMP1抗體在腫瘤中的表達具有潛在可變性，所以該方法的可靠性有待證實[16]。

微小核糖核酸（micro RNA，miRNA，miR）是一種微小非編碼RNA，在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起重要作用，且在血液中穩(wěn)定表達，已成為生物標志物方面的研究熱點。研究表明，EBV是第一個被發(fā)現(xiàn)可以編碼miRNA的病毒[17]。盡管關(guān)于EBV miRNA在B細胞轉(zhuǎn)化和增殖過程中作用的研究眾多，但涉及其作為EBV相關(guān)性PTLD生物標志物的研究相對較少。Hassan等[18]檢測了42例兒童腎移植受者BART和BHRF病毒開放閱讀框的EBV miRNA，發(fā)現(xiàn)幾個衍生的miRNA，包括BART7-3p、15、9-3p、1-3p和3-3p僅在經(jīng)典的霍奇金淋巴瘤和IM受者中檢測到。Navari等[19]發(fā)現(xiàn)，miRNA在腫瘤組織中的表達主要是細胞起源的，EBV miRNA的表達因EBV相關(guān)性PTLD的異質(zhì)性而不同，如與EBV相關(guān)性Burkitt淋巴瘤組織不同，彌漫性大B細胞淋巴瘤型PTLD中能檢測到EBV miR-BHRF-1-2。Zimmermann等[20]發(fā)現(xiàn)大多數(shù)EBV相關(guān)性PTLD標本中存在BART編碼和BHRF1編碼的miRNA，但不同類型的PTLD中miRNA表達不同。

EBV不僅可編碼自身miRNA，也可以調(diào)節(jié)其感染的宿主細胞miRNA。Sang等[21]的研究表明，EBV在人B細胞中潛伏感染的建立顯著改變了宿主細胞miRNA的表達。已有研究證實，miR-155可加速B細胞惡性腫瘤的發(fā)展[22]，miR-194參與白細胞介素（interleukin，IL）-10的調(diào)節(jié)[23]。近期研究證明，EBV感染的細胞可以釋放含有miRNA的外泌體到細胞外環(huán)境，這表明外泌體可能是血液中EBV相關(guān)miRNA的來源[24]。EBV感染B細胞來源的miRNA，在EBV相關(guān)惡性腫瘤（如鼻咽癌）中具有作為生物標志物的潛力[25]。

Evens等[26]對PTLD受者、非PTLD受者和EBV血癥的非移植受試者血液中裂解周期基因BZLF1和潛伏周期基因LMP2A的表達進行了分析，結(jié)果表明PTLD和非PTLD受者LMP2A/BZLF1比值差異無統(tǒng)計學意義，但均低于EBV血癥的非移植受試者。Habib等[27]對35例PTLD受者的血清進行檢測發(fā)現(xiàn)，60%的PTLD受者檢測到可溶性EBV BZLF1基因的產(chǎn)物ZEBRA蛋白，且早發(fā)PTLD受者ZEBRA蛋白水平明顯高于晚發(fā)PTLD受者。

研究表明潛伏期基因EBNA3c、LMP1和LMP2A/B以及溶解期相關(guān)基因gp350在PTLD心臟移植受者血液中的表達是可變的，具有溶解期和潛伏期的混合模式[28]。最常見的特征是潛伏期3和溶解期混合活動，可在病毒水平升高的未發(fā)病受試者（病毒攜帶者）中觀察到，但PTLD受者中尚未發(fā)現(xiàn)[29]。

以上研究表明單純的病毒基因表達與EBV相關(guān)性PTLD的發(fā)生無關(guān)。因此，需要更多的研究來確定病毒基因表達是否可以用來預測EBV相關(guān)性PTLD的癥狀和發(fā)病情況。一項針對兒童移植受者的多中心前瞻性臨床研究正在進行，主要評估LMP1中兩個功能增益突變的存在是否與EBV相關(guān)性PTLD風險增加有關(guān)[30]?？深A見地說，下一代測序方法可能有助于識別與EBV相關(guān)性PTLD發(fā)展相關(guān)的病毒基因組變異和（或）突變，并可能產(chǎn)生新的候選生物標志物。

3.2 基因多態(tài)性和人類白細胞抗原

細胞因子在介導和調(diào)節(jié)病毒和腫瘤細胞免疫應答中起著重要作用，而單核苷酸多態(tài)性與細胞因子水平相關(guān)。有研究檢測了移植受者細胞因子基因多態(tài)性，以確定特定細胞因子水平與EBV相關(guān)性PTLD的關(guān)系。雖然研究者發(fā)現(xiàn)二者存在一定的關(guān)聯(lián)，但同時存在一些非確定性或相互矛盾的結(jié)果，導致細胞因子基因多態(tài)性作為預測EBV相關(guān)性PTLD風險的潛在生物標志物尚未達成共識。

T細胞和自然殺傷細胞產(chǎn)生的干擾素（interferon，IFN）-γ在抗病毒應答中非常重要，低水平IFN-γ與EBV相關(guān)性PTLD的早期發(fā)病有關(guān)[31]。Toyoda等[32]和Lee等[33]在PTLD受者中發(fā)現(xiàn)IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β低基因型之間存在關(guān)聯(lián)。此外，McAulay等[34]報道，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α啟動子內(nèi)的一種特定變異等位基因在EBV相關(guān)性PTLD受者中更為常見，而淋巴毒素、IL-1α、IL-6、IL-10、TNF受體Ⅰ或Ⅱ、IL-1受體和IL-10受體的多態(tài)區(qū)域中未見差異。因此，目前還沒有明確的某一個細胞因子基因多態(tài)性或某一組基因多態(tài)性提示EBV相關(guān)性PTLD發(fā)生風險的增加。

研究發(fā)現(xiàn)，移植受者的人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）可能會影響EBV免疫應答的程度，這是由于EBV衍生肽的抗原提呈和病毒效應細胞識別的不同，供者或受者HLA不同亞型與EBV相關(guān)性PTLD易感性有關(guān)[35]。

3.3 其他可能對PTLD診斷有幫助的病毒

德國Quake實驗室檢測了96例心臟移植和肺移植受者血漿游離循環(huán)DNA中的人類病毒，并分析了免疫抑制和抗病毒預防對病毒水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)特定的病毒與不同水平的藥物治療相關(guān)[22]。當免疫抑制和抗病毒藥物水平較低時，患者血漿皰疹病毒和有尾噬菌體的載量較高，反之則以指環(huán)病毒為主，活組織檢查證實發(fā)生排斥反應的受者其細環(huán)病毒載量顯著低于無排斥反應的受者[22]。在高水平的指環(huán)病毒提示過度免疫抑制的情況下，指環(huán)病毒載量可能是體現(xiàn)免疫能力的替代標志物。另有研究對PTLD受者石蠟包埋淋巴瘤組織的鳥槍法宏基因組測序結(jié)果顯示，50%以上PTLD受者的標本含有指環(huán)病毒序列，單因素變量分析顯示指環(huán)病毒水平（而非EBV水平）與受者5年內(nèi)死亡有關(guān)[35]。這些發(fā)現(xiàn)表明，病毒組的變化，甚至是特定的病毒組分變化如指環(huán)病毒，可間接提示免疫抑制水平和免疫狀態(tài)，同時影響EBV相關(guān)性PTLD的疾病發(fā)展。

4 EBV陰性PTLD的病因及PTLD預后情況

部分PTLD受者表現(xiàn)為EBV陰性，且近年來有增加趨勢，但病因不明。因此，診斷PTLD并不一定要依靠EBV監(jiān)測。EBV陰性PTLD在發(fā)病機制不同于EBV相關(guān)性PTLD，而是與EBV陰性的惡性淋巴瘤類似。EBV陰性PTLD只是恰巧發(fā)生于免疫抑制狀態(tài)下，而不是真正的EBV相關(guān)性PTLD。不考慮EBV相關(guān)與否，目前PTLD受者總體預后較差，總病死率為25%～60%，治療手段的進步可提高PTLD受者的總體生存率[36]。已有研究表明，降低免疫抑制水平可以使疾病消退，在沒有排斥反應的情況下，可取得較好的治療效果，尤其是兒童受者。同時，PTLD的不良預后相關(guān)因素已有報道，高水平的乳酸脫氫酶、低蛋白血癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累及高齡等與不良預后相關(guān)[37]。

5 小 結(jié)

綜上所述，EBV相關(guān)性PTLD的診斷和治療仍然是臨床一大挑戰(zhàn)，尋找非侵入性、特異性和敏感性的生物標志物指導臨床診斷和治療具有重要意義。目前，生物標志物的焦點主要集中于可以在血液中檢測到的病毒核酸、蛋白質(zhì)和HLA。已有研究發(fā)現(xiàn)了一些很有潛力的候選分子，但在識別作為EBV相關(guān)性PTLD發(fā)生、診斷和治療反應的特定風險指標的生物標志物等方面仍存在重大挑戰(zhàn)，未來基于綜合分析候選分子和測量病毒載量，可能會獲得更好的分析結(jié)果。此外，目前大多數(shù)研究都是在樣本量較少的成年受試者中進行的，因此，建立以兒童受者為研究對象的隊列研究，對于探索和驗證高靈敏度生物標志物是十分重要的。