間充質(zhì)干細(xì)胞治療缺血性膽道損傷的研究進(jìn)展

代鑫 程龍 王強(qiáng) 駱助林 汪濤

缺血性膽道損傷（ischemic-type biliary lesion，ITBL）是指各種致病因素造成的膽道血供中斷而引起的局灶性或彌漫性膽道損傷[1]，廣泛存在于肝移植、膽道手術(shù)、經(jīng)肝動(dòng)脈灌注化學(xué)藥物治療（化療）和部分內(nèi)科疾病中。ITBL在臨床上主要表現(xiàn)為膽道鑄型、膽道狹窄或擴(kuò)張、肝內(nèi)膽汁瘤形成，在疾病的后期，甚至?xí)霈F(xiàn)瘙癢和黃疸，并可能發(fā)展為肝衰竭。目前對(duì)于ITBL的治療常以內(nèi)鏡治療為首選，對(duì)于常規(guī)療法無效的ITBL，治療手段及療效十分有限，唯一的根治性治療手段是進(jìn)行肝移植。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）作為干細(xì)胞家族的重要成員，不但具有自我更新及多向分化潛能，如分化為多個(gè)譜系的細(xì)胞，包括軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及外胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞等[2]，還具有促血管形成、抗炎、抗凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等特性[3-6]。MSC的異體移植作為一種新型的細(xì)胞治療方法，在各類疾病中的治療作用已被廣泛研究，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。目前MSC移植已在一些疾病中成功開展并取得了較好療效，如肺移植缺血-再灌注損傷、急性胰腺炎、心肌梗死、肝硬化、腎纖維化等[7-11]。近年來，MSC在治療ITBL方面也取得了一些進(jìn)展，研究發(fā)現(xiàn)MSC移植到ITBL動(dòng)物模型后，不但可歸巢到損傷區(qū)域，而且可通過抗炎、抗凋亡及促血管新生作用等促進(jìn)膽道組織的修復(fù)。本文就MSC治療ITBL的研究進(jìn)展做如下綜述。

1 MSC的生物學(xué)特性

1.1 增殖與多向分化潛能

MSC來源于中胚層，具有干細(xì)胞的自我更新能力和多向分化潛能。MSC增殖能力強(qiáng)，在特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為軟骨、骨、骨骼肌、脂肪等多種細(xì)胞類型[12-14]。

1.2 歸巢特性

歸巢是MSC在目標(biāo)組織的脈管系統(tǒng)中被捕獲，穿過血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移至目標(biāo)組織的過程，是干細(xì)胞對(duì)損傷組織發(fā)揮修復(fù)作用的重要條件[15]。組織在缺血、缺氧等損傷時(shí)釋放趨化因子、黏附分子、生長(zhǎng)因子和酶，如基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（stromal cell derived factor，SDF）-1、粒細(xì)胞集落刺激因子、單核細(xì)胞趨化蛋白等，它們與MSC上相應(yīng)受體結(jié)合介導(dǎo)MSC遷移歸巢于損傷區(qū)域[16]。

1.3 低免疫原性

MSC表面表達(dá) CD105、CD90、CD73受體及主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ類分子，MHC Ⅱ類分子表達(dá)極低， 而 CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a或CD19則不表達(dá)[17]。此外，MSC也不表達(dá)共刺激因子CD80、CD86及CD40等[18]，因此MSC具有低免疫原性，不會(huì)激發(fā)免疫應(yīng)答及移植排斥反應(yīng)。

1.4 免疫調(diào)節(jié)特性

大量研究表明，免疫調(diào)節(jié)作用則是由MSC分泌的各種細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）-β、 吲 哚 胺 2，3-雙 加 氧 酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）或外泌體與各種免疫細(xì)胞相互作用產(chǎn)生的，包括參與先天免疫的細(xì)胞[樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）、自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞]和獲得性免疫的細(xì)胞（B細(xì)胞和T細(xì)胞）[19-20]。

1.5 促血管形成特性

MSC通過旁分泌作用分泌大量促血管生長(zhǎng)因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管生成素（angiopoietin，Ang）-1、酪氨酸激酶受體（tyrosine kinase receptor，Tie）-2、SDF-1等促進(jìn)血管新生，從而促進(jìn)損傷組織的修復(fù)[21]。研究表明，在特定條件下，MSC亦可直接分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)血管生成[22]。

2 MSC治療ITBL的機(jī)制

2.1 MSC特異性歸巢組織損傷部位

MSC具有向損傷部位歸巢的特性，當(dāng)組織損傷后，靜脈或局部注射外源性MSC，其將以有限的效率優(yōu)先向損傷組織區(qū)域歸巢，從而發(fā)揮治療作用[23]。如呂俊生等[24]將BrdU示蹤劑標(biāo)記的同種系小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液均勻注射于環(huán)繞缺血膽道的大網(wǎng)膜周圍，術(shù)后21 d發(fā)現(xiàn)骨髓單個(gè)核細(xì)胞集中分布于缺血膽道周圍，并且其中一些已分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞。王橋等[25]將人臍帶MSC（human umbilical cord MSC，hUC-MSC）移植于兔ITBL模型的研究結(jié)果顯示，hUC-MSC治療組不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的各項(xiàng)生化指標(biāo)及術(shù)后第4周膽道造影結(jié)果均優(yōu)于未移植hUC-MSC組，提示MSC能向損傷組織特異性歸巢并有效減輕ITBL病變的程度，預(yù)防ITBL的發(fā)生。大量研究結(jié)果亦證實(shí)體外輸注的MSC有向缺血損傷組織遷移與定植的特性[26-29]。

2.2 MSC促血管形成

與肝臟具有來自肝動(dòng)脈和門靜脈的雙重供血不同，膽道系統(tǒng)僅依賴于動(dòng)脈供血，因此，膽道較肝臟對(duì)缺血損傷更為敏感，繼而發(fā)生膽道狹窄。缺血-再灌注損傷一直被認(rèn)為是ITBL發(fā)生的始動(dòng)因素，在ITBL的病理生理過程中扮演著關(guān)鍵一環(huán)。大量研究結(jié)果顯示MSC能促進(jìn)損傷組織血管新生。趙德芳等[30]研究發(fā)現(xiàn)MSC移植治療后可通過轉(zhuǎn)變?yōu)檠軆?nèi)皮細(xì)胞，分泌血管生成因子（VEGF、CD31、CD34），促進(jìn)血管生成，改善膽道供血。促進(jìn)損傷膽道的血管增生能充分有效地改善膽道血液供應(yīng)、加快膽道恢復(fù)，因此增強(qiáng)MSC的促血管生成能力，或許能更加有效地修復(fù)損傷膽道。

2.3 MSC抗凋亡

目前，多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為凋亡機(jī)制在缺血性病變的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，誘導(dǎo)抗凋亡相關(guān)基因的表達(dá)可能是MSC移植對(duì)缺血性損傷起保護(hù)作用的主要機(jī)制之一[31-32]。在ITBL中，趙德芳等[33]研究發(fā)現(xiàn)局部多點(diǎn)注射骨髓MSC（1×106個(gè)細(xì)胞/點(diǎn)，共8點(diǎn)），可通過上調(diào)survivin和B淋巴細(xì)胞瘤（B cell-lymphoma, Bcl）-2表達(dá)，阻止缺血膽道上皮細(xì)胞凋亡，減輕膽道缺血損傷后膽道狹窄程度。大量研究證實(shí)，MSC移植對(duì)缺血性損傷具有顯著的抗凋亡作用[34-35]，然而對(duì)于MSC如何減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)膽道損傷組織修復(fù)的調(diào)控機(jī)制還缺乏進(jìn)一步相關(guān)研究。

2.4 MSC抗纖維化

ITBL后良性膽道狹窄（benign biliary stricture，BBS）的發(fā)生機(jī)制尚不清楚，成纖維細(xì)胞增殖活躍、細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積及病理性瘢痕增生是形成BBS的重要因素。王永等[36]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠BBS模型中TGF-β1和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）表達(dá)上調(diào)，且二者具有協(xié)同作用，引起成纖維細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，從而導(dǎo)致膽道狹窄。Li等[37]通過研究地塞米松對(duì)BBS中TGF-β1/ Smad信號(hào)通路的影響也得到了類似的結(jié)果。在一項(xiàng)MSC移植治療肝纖維化的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，MSC對(duì)肝纖維化有顯著的治療作用，并通過TGF-β1/Smad信號(hào)通路減輕纖維化的進(jìn)展[38]。大量研究結(jié)果顯示，MSC移植對(duì)肺纖維化、腎纖維化亦有顯著的抗纖維化作用[39-40]。筆者由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，纖維化機(jī)制在ITBL后BBS的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，并且調(diào)控纖維化相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)可能會(huì)是MSC移植對(duì)ITBL發(fā)揮保護(hù)作用的潛在機(jī)制之一。

2.5 MSC免疫調(diào)節(jié)與抗炎

大量研究提示，免疫與炎癥因素在移植術(shù)后ITBL的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，如肝移植術(shù)后發(fā)生排斥反應(yīng)時(shí)，細(xì)胞毒性T細(xì)胞可激活供肝內(nèi)的枯否（Kupffer）細(xì)胞釋放炎癥因子，并在多種細(xì)胞因子的參與下，攻擊膽道上皮和血管內(nèi)皮細(xì)胞，引發(fā)凝血和炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致膽道周圍血管叢血管閉塞、膽道上皮細(xì)胞缺血壞死、管壁纖維化，最終形成非化膿性膽道炎及ITBL。目前MSC已經(jīng)成功地應(yīng)用于移植物抗宿主病和自身免疫性疾病等的治療[41-42]。盡管關(guān)于MSC的許多問題仍未得到解決，但MSC的免疫調(diào)節(jié)與抗炎作用已使其成為基于細(xì)胞移植的組織修復(fù)和疾病治療的理想種子細(xì)胞。在維持體內(nèi)平衡（免疫調(diào)節(jié)和抗炎活性）方面，MSC可通過細(xì)胞因子、趨化因子、細(xì)胞表面分子和代謝途徑介導(dǎo)與免疫細(xì)胞相互作用，調(diào)控免疫細(xì)胞（T細(xì)胞、B細(xì)胞、DC、NK細(xì)胞）分化、增殖和細(xì)胞毒性[43]。由此可知，MSC移植可能通過調(diào)控免疫細(xì)胞及炎癥因子對(duì)肝移植術(shù)后ITBL發(fā)揮保護(hù)作用。

3 MSC治療ITBL的臨床應(yīng)用

目前關(guān)于MSC移植治療ITBL的臨床研究尚處于探索階段，但大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)MSC可以有效地治療ITBL。在一項(xiàng)前瞻性、單中心、隨機(jī)對(duì)照研究中發(fā)現(xiàn)，與治療前比較，ITBL患者接受hUC-MSC治療后第20周和第48周血清總膽紅素、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶和堿性磷酸酶水平顯著降低[44]。此外，hUC-MSC移植組患者對(duì)介入治療的需求顯著降低，并且1年和2年移植物存活率顯著高于對(duì)照組。同時(shí)對(duì)輸注hUC-MSC后2年內(nèi)的不良事件進(jìn)行密切監(jiān)測(cè)，在試驗(yàn)期間并沒有觀察到與hUC-MSC治療相關(guān)的重大不良事件。由此可見，hUC-MSC移植治療ITBL臨床效果安全可靠、近期療效良好，有望成為治療ITBL的新方案。

4 小結(jié)與展望

ITBL是一種較為常見但尚未引起重視的膽道損傷，此類損傷一旦形成 ，將使臨床醫(yī)師在選擇治療策略時(shí)面臨極大困境。目前MSC治療ITBL的機(jī)制主要集中在抗凋亡和促血管新生方面，尚缺乏抗纖維化、抗炎及免疫調(diào)節(jié)方面的研究。除了單獨(dú)的MSC治療外，越來越多的研究考慮將MSC修飾、MSC來源的外泌體以及MSC與其他治療方法結(jié)合應(yīng)用于ITBL的治療。以往的動(dòng)物研究表明MSC有助于治療ITBL，但相關(guān)臨床研究仍較少，將MSC移植治療ITBL應(yīng)用于臨床的過程中仍需解決許多問題，如MSC移植的最佳時(shí)間、劑量、途徑、安全性以及MSC在膽道損傷部位的定植率和存活率等。

綜上所述，MSC移植可以有效地治療ITBL，因此MSC移植有望成為治療ITBL的新方案。但其作用機(jī)制尚不完全清楚，未來研究需要更多地集中于MSC的作用機(jī)制、藥物組合、臨床研究等方面，進(jìn)一步探索MSC移植在ITBL中的作用，以推進(jìn)MSC早日進(jìn)入ITBL的臨床治療。