PBS在鼠疫血清學(xué)診斷中的作用及質(zhì)控措施

馮建萍，郭文濤，吳海生，魏紹振

(青海省地方病預(yù)防控制所 國家衛(wèi)生健康委鼠疫防治研究重點實驗室，西寧 811602)

鼠疫是嚴(yán)重危害人類和其他動物生命和健康的烈性傳染病，也是《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的甲類傳染病[1]。鼠疫的判定，特別是初次判定，以及鼠疫流行病學(xué)分析，都需要鼠疫細(xì)菌學(xué)做出正確診斷[2]。僅靠分離鼠疫菌的方法對鼠疫病人診斷、進(jìn)行病毒原學(xué)檢索、動物鼠疫調(diào)查已不能解決問題[3]。1952年Baker提取了特異的鼠疫F1Ag及特異性抗體的獲取成功，鼠疫間接血凝技術(shù)在鼠疫監(jiān)測、鼠疫診斷和追溯診斷中，具有簡便易行、敏感特異和較為經(jīng)濟(jì)等特點[4]。間接血凝試驗與50年代初由Amies最先引入鼠疫領(lǐng)域，1956年被WHO推薦為鼠疫診斷常規(guī)方法之一，70年代初，該試驗已在我國得到推廣，并大規(guī)模用于實踐[5]。檢查抗原的反向血凝試驗(RIHA)在70年代已陸續(xù)問世，目前已在國內(nèi)廣泛應(yīng)用[5，6]。在該實驗試劑制備過程中，綿羊紅血球與F1Ab結(jié)合需要一個適宜的pH及滲透壓環(huán)境。為此，磷酸鹽緩沖液(以下簡稱PBS)的制備質(zhì)量尤顯重要。因此我們對不同批次的PBS按其F1Ab綿羊紅血球操作流程進(jìn)行制備，對其結(jié)果進(jìn)行評價，為鼠疫菌的診斷提供標(biāo)準(zhǔn)、可靠的F1Ab綿羊紅血球，確保鼠疫檢測工作順利開展。

1 血清學(xué)反應(yīng)在鼠疫診斷中的應(yīng)用

通過對各種被檢材料進(jìn)行血清抗體檢查或抗原檢查，鼠疫血清學(xué)方法已在鼠疫監(jiān)測和臨床診斷及科學(xué)研究方面得到廣泛應(yīng)用。它可用于：檢查血清中鼠疫菌抗體；檢查材料中的鼠疫菌抗原。在鼠疫血清學(xué)檢驗中又分為鼠疫間接血凝試驗(RHA)和鼠疫反向間接血凝試驗(RIHA)。經(jīng)過50多年的廣泛應(yīng)用，間接血凝試驗已經(jīng)成為鼠疫血清學(xué)實驗的金標(biāo)準(zhǔn)。反向間接血凝試驗與間接血凝試驗一樣也是診斷鼠疫的常規(guī)方法之一。它具有快速、敏感、特異、操作簡便，對腐敗材料及干枯材料的檢測優(yōu)于細(xì)菌培養(yǎng)，因此在疑似鼠疫尸體材料的診斷中起著重要作用[1]。在血清學(xué)反應(yīng)中，診斷試劑制備的各環(huán)節(jié)又顯得極為重要。

1.1 F1Ab綿羊紅血球在鼠疫血清學(xué)診斷試劑中的作用

鼠疫F1Ab綿羊紅血球是反向間接血球凝集試驗的前提與基礎(chǔ)，它是用F1Ab致敏血球檢查鼠疫特異性抗原的血清學(xué)方法。可用于：檢查鼠疫菌(活菌、死菌)和可溶性抗原；檢查污染和腐敗材料中鼠疫菌抗原物質(zhì)；鼠疫患者和尸體的診斷；鼠疫動物病的監(jiān)測；鼠疫菌種的鑒定；檢查待測菌中是否有鼠疫F1Ag；鼠疫疫源地調(diào)查[7]。

1.2 磷酸鹽緩沖鹽水在制備F1Ab綿羊紅血球中的作用

磷酸鹽緩沖鹽水一般有活性的生物制劑都要用它來稀釋，原因就是它具有鹽平衡，可調(diào)整適宜pH的緩沖作用，蒸餾水不具有鹽平衡作用，可破壞生物蛋白的結(jié)構(gòu)及生物特性，生理鹽水不具有調(diào)整pH的作用，對完整的，具有活性的物質(zhì)不能保證其在最適條件下參與生物反應(yīng)，所以使用PBS是首選。它可維持體系的穩(wěn)定：保持pH的穩(wěn)定；保持溶液的總離子強度穩(wěn)定；保證溶液內(nèi)容物質(zhì)的穩(wěn)定，如一般酶反應(yīng)都要在緩沖液中進(jìn)行。鼠疫F1Ab致敏血球是間接血凝試驗的前提，鼠疫間接血凝技術(shù)在鼠疫監(jiān)測、鼠疫診斷和追溯診斷中，具有簡便易行、敏感特異和較為經(jīng)濟(jì)等特點。WHO(1956)將此方法在國內(nèi)得到推廣，并大規(guī)模用于實踐[8]。在該試驗試劑的制備過程中，綿羊紅血球與F1Ab的結(jié)合需要一個適宜的pH及滲透壓環(huán)境，為此PBS的制備質(zhì)量尤顯重要。

2 不同批次的磷酸鹽緩沖液對鼠疫F1Ab綿羊紅血球制備的效果評價

鼠疫F1Ab綿羊紅血球用的pH6.4的PBS將鼠疫F1Ab液與1%單寧酸血球懸液混合，置37℃水浴中作用15min～30min，再用0.9%生理鹽水洗3～4次，最后用1%健康兔血清鹽水洗1次，測定效價，并用該液配成10%血球懸液，(含0.1%NaN3防腐)分裝，放置冰箱備用[7]。pH6.4的PBS的制備按鼠疫防治制作流程進(jìn)行配制[9]。并對2019年和2020年兩個不同的時間段制備的PBS分別稀釋F1Ab致敏血球至最適濃度(50μg/mL-100μg/mL)，采用試管法用鹽水從1億個菌/mL稀釋至1.5萬個菌，觀察不同批次PBS對其測定效價的影響，從結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，2019年和2020年P(guān)BS對制備的鼠疫F1Ab綿羊紅血球其測定效價為：從1千個菌/mL至25個菌/mL，其效價均為(#)；濃度為12.5萬個菌/mL時，2019年制備的PBS對鼠疫綿羊紅細(xì)胞測定的效價為(+++)，2020年制備的PBS為(#)；6.25萬個菌/mL時，2019年和2020年的PBS對制備的綿羊紅血球其效價為(+++)；濃度為3.125萬個菌/mL時，2019年和2020的PBS對其制備的鼠疫F1Ab綿羊紅血球測定其效價為(++)；1.5萬個菌/mL時，保存一年和現(xiàn)場制備的PBS對鼠疫F1Ab綿羊紅血球其測定效價均為(-)。其中陽性對照為(+)，空白對照為(-)。從結(jié)果中可看出2019年和2020年的PBS對其制備的鼠疫F1Ab綿羊紅血球的濃度均達(dá)到3萬個菌/mL(可達(dá)到F1Ab診斷試劑盒5萬個菌/mL的診斷標(biāo)準(zhǔn))。從上述結(jié)果說明不同批次(保存一年和現(xiàn)場制備)的PBS對制備的鼠疫F1Ab綿羊紅血球測定結(jié)果無影響。

3 討論

鼠疫F1Ab致敏血球(簡稱F1Ab血球)是鼠疫反向血凝試驗的基礎(chǔ)，具有很強的敏感性，鼠疫F1Ab致敏血球是血凝反向藥盒的關(guān)鍵試劑[10]。反向間接血球凝集試驗是將鼠疫特異性抗體致敏到經(jīng)單寧酸處理的綿羊紅細(xì)胞上，以檢查鼠疫特異性抗原的血清學(xué)方法?？贵w致敏血球較穩(wěn)定，且可以通過抑制實驗排除非特異性凝集[1]。在該試驗試劑的制備中，綿羊紅血球F1Ab的結(jié)合，需要一個適宜pH及滲透壓環(huán)境，為此PBS的制備質(zhì)量尤顯重要。PBS可調(diào)整適宜pH緩沖作用，保存pH的穩(wěn)定及溶液的總離子強度穩(wěn)定，保證溶液內(nèi)容物質(zhì)的穩(wěn)定。那么不同保存期的PBS對制備的鼠疫F1Ab綿羊紅血球測定結(jié)果有何影響，還未曾有過報道。為此我們對2019年和2020年的PBS制備的綿羊紅血球，采用試管法，用鹽水從1億個菌/mL稀釋至1.5萬個菌/mL，測定其效價，從結(jié)果中發(fā)現(xiàn)不同批次的PBS對制備的鼠疫F1Ab綿羊紅血球滴度均達(dá)到3萬個菌/mL(可達(dá)到F1Ab診斷試劑盒5萬個菌/mL的診斷標(biāo)準(zhǔn))。由此說明：不同批次(保存一年和現(xiàn)場制備)的PBS對制備的鼠疫F1Ab綿羊紅血球測定結(jié)果無影響。(說明對其鼠疫F1Ab綿羊紅血球的敏感性不受影響，濃度均達(dá)到3萬個菌/mL，被檢菌液稀釋度越低，仍能檢測出陽性結(jié)果，說明該試劑敏感性好。)至于PBS長期保存是否對鼠疫F1Ab綿羊紅細(xì)胞血球測定效價有影響，還有待于繼續(xù)進(jìn)行探索，從而得出相應(yīng)的結(jié)論。因此，在鼠疫F1Ab致敏血球制備過程中，應(yīng)注意各個環(huán)節(jié)的影響因素，嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)，規(guī)范其操作規(guī)程[11]，從而制備出優(yōu)質(zhì)的鼠疫F1Ab致敏血球是保證鼠疫反向凝集試驗的基礎(chǔ)，以確保鼠疫防控工作順利進(jìn)行，為鼠疫的快速診斷提供良好的基礎(chǔ)保障。