金黃色葡萄球菌感染的治療新策略—噬菌體

段懷洋,楊曜

(1.貴州省畢節(jié)市納雍縣農業(yè)農村局動物疫病預防控制中心，畢節(jié) 553300；2.貴州省畢節(jié)市納雍縣農業(yè)農村局動物衛(wèi)生監(jiān)督所，畢節(jié) 553300)

金黃色葡萄球菌在自然界中廣泛存在，50%以上健康人的皮膚上都存有金黃色葡萄球菌。而且其污染食品的機會很多[1]，常見的乳以及乳制品、蛋以及蛋制品、各類熟制品都有可能污染[2]。同時金黃色葡萄球菌在臨床上可以引發(fā)心內膜炎、骨髓炎、肺炎等疾病，占醫(yī)院感染病例的10%[3]。對于金黃色葡萄球菌感染最主要治療策略是抗生素，然而由于抗生素的廣泛使用，導致出現大量的耐藥菌株尤其是耐甲氧西林葡萄球菌(MRSA)[4]。因此，對于金黃色葡萄球菌的潛在危害的研究以及對它的控制成為熱點。

噬菌體是一種能夠感染細菌的小病毒，可以通過對細菌的吸附達到自己繁殖的目的，同時對細菌進行裂解[5]。由于其這種專門吸附細菌的特性，是一種很好的細菌殺傷武器[6]。而且據報道已經鑒定和描述的噬菌體超過6000種[7]，不難想象其作為一種豐富的資源，有待人們去挖掘。

近幾年，隨著細菌耐藥性的不斷嚴重，西方一些權威的研究機構和業(yè)內的專業(yè)人士開始重新審視噬菌體療法。一些公司已經對天然的噬菌體展開了研究，如弗吉尼亞州的 Ampli Phi 生物科學中心，已經在倫敦完成了一個包含 24 人的臨床研究，他們利用噬菌體療法成功治愈了綠膿桿菌感染引起的成人中耳炎[8]； Basdew和Laing利用3株噬菌體在體外有效治療金黃色葡萄球菌感染的奶牛乳腺炎[9]。但是人們對于噬菌體治療的研究和了解還是有限，本文就已有的噬菌體知識進行綜述，幫助更好的了解審視噬菌體。

1 噬菌體治療的發(fā)展歷史

1896年，Ernst Hankin報道了印度恒河和朱納河流域的霍亂弧菌的一種抗菌活性。兩年后，一位俄國細菌學家在研究枯草芽孢桿菌時，也描述了類似的情況。直到1915年，Frederick Twort推測病毒可能是這種抗菌活性的原因。英國細菌學家在嘗試脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)牛痘病毒時，注意到了微球菌“玻璃”菌落的生長[10]。當他在顯微鏡下觀察這些菌落時，他注意到有退化細菌的顆粒，由此闡明了他的假設。后來法裔加拿大微生物學家Felix d’Herelle繼續(xù)在噬菌體領域進行了研究，他聲稱觀察到了“噬菌體現象”。在實驗中，d’Herelle在瓊脂培養(yǎng)基上發(fā)現了細菌菌落周圍的清晰區(qū)域，后來稱其為空斑。在他的發(fā)現(1919年)之后不久，其在巴黎醫(yī)院 des Enfants-Malades教授的監(jiān)督下，用噬菌體療法治療痢疾。在4例患者治療后，噬菌體的制備證實了其療效。然而，這些發(fā)現直到1931年才發(fā)表，這給了Richard Bruynoghe和Joseph Masin很大的啟發(fā)，使得他們后來報道了噬菌體在治療人類感染上的第一個應用[11]。他們用噬菌體治療葡萄球菌性皮膚病。在這些重要的發(fā)現之后，微生物學家開始在動物和人類的治療方面使用噬菌體。噬菌體治療領域的工作開始迅速發(fā)展。D 'Herelle建立了自己的實驗室，生產了第一個商業(yè)噬菌體雞尾酒?？茖W家們在各種感染上試驗噬菌體;一項對21例傷寒患者的研究報告顯示，在使用噬菌體治療的情況下，死亡率從15.6%下降到4.8%，并發(fā)癥減少了43.2%。大量噬菌體成功治療試驗的報道開始出現，如敗血癥、尿路感染、手術感染、皮膚感染、腹膜炎、耳鼻喉科感染，以及沙門氏菌相關結腸炎等。噬菌體治療熱潮已經蔓延到美國，甚至著名的制藥公司，如Eli Lilly、Abbott Labs和E.R.Squibb，也開始生產治療噬菌體雞尾酒。在磺胺類抗生素和青霉素出現后，對噬菌體治療的興趣消退，在1934年Eaton和Bayne-Jones 的報告中，對噬菌體治療方案的準確性和一致性提出質疑[12]。而一些國家，如波蘭、格魯吉亞和俄羅斯，繼續(xù)在噬菌體治療領域進行研究，至今仍使用噬菌體治療細菌感染。

2 噬菌體治療的優(yōu)點

噬菌體治療有許多優(yōu)點，使它成為一種非常有潛力的替代抗生素治療的藥品。首先，噬菌體對它們的宿主是非常特殊的，不像抗生素，它有更廣泛的宿主譜，可能會導致生物失調、繼發(fā)感染和其他副作用。而噬菌體只感染細菌細胞，對哺乳動物細胞沒有影響，所以對宿主是沒有毒性的。此外，噬菌體在自然界中普遍存在，使得新噬菌體的分離和選擇相對于抗生素的發(fā)展來說是一個相對快速的過程，而抗生素的開發(fā)需要花費數百萬美元以及多年的研究來開發(fā)一種有效的抗生素藥物[13]。因此，與抗生素相比，噬菌體治療的發(fā)展階段相對便宜。耐藥性的發(fā)展是抗生素治療的一個重要問題，盡管細菌可能會對特定的噬菌體產生抗性，但總有一系列不同的噬菌體具有相同的靶點。同時，高頻率的突變使得噬菌體能夠與宿主共同進化，通過強大的進化壓力來克服任何獲得的抗性?？股夭⒉豢偸怯行У脑蛑皇撬鼈儽淮x并從體內排出而沒有到達感染部位。噬菌體的優(yōu)勢在于，它們只能在宿主細菌的存在下進行復制，并在系統(tǒng)管理后廣泛傳播到全身，從而到達感染部位。它們的微小尺寸允許它們滲透到藥物分子無法穿透的區(qū)域，例如血腦屏障。一些噬菌體甚至能夠滲透和破壞生物膜[14]。一旦在感染部位，噬菌體的指數增長可能會比抗生素治療所需要的治療次數少，且劑量更低。

同時噬菌體對宿主菌有依賴性，只在宿主菌感染部位發(fā)生作用，并在宿主菌體內迅速增殖，能在細菌感染的整個過程中發(fā)揮作用，隨著宿主菌的清除而死亡，不會在體內殘留[15]。另外，根據 Carlton 的報道，烈性噬菌體通過在細菌體內的不斷復制和循環(huán)代謝到很長時間之后能夠對相應細菌產生適應性的變異從而變的能夠裂解更多的細菌，但是自身依舊具有對細菌強烈的裂解能力，這也就意味著噬菌體的適應能力和感染效率能夠得到提高，而傳統(tǒng)抗生素不具備這種優(yōu)勢。

而且噬菌體治療現在不僅局限于自己本身治療，其表達的裂解酶也是一種很好的治療手段。噬菌體裂解酶是由噬菌體感染細菌的后期由噬菌體基因組編碼合成的一種細胞壁水解酶，有選擇性、快速的殺滅特定的革蘭氏陽性細菌[16]。肽聚糖作為革蘭氏陽性菌細胞壁的重要組成部分，對維持細菌內部的正常滲透壓起著至關重要的作用，如果肽聚糖遭到破壞可以直接導致細菌的滲透性損傷和細菌崩解。而且裂解酶用于治療具有以下幾點優(yōu)勢：第一，具有高度的特異性，大多數具有種屬特異性，這主要是由于不同細菌細胞壁上的肽聚糖成分有差異；第二，具有快速、高效的特點，一旦裂解酶與肽聚糖上的底物接觸，就可以在極短的時間內將處于靜態(tài)或生長狀態(tài)的細菌殺滅；第三，可以有效的治療生物被膜引起的心內膜炎等感染；第四，可以與針對細胞壁起作用的抗生素發(fā)揮協(xié)同作用；第五，可以使抗性菌株恢復對抗生素的敏感性[17]。

3 噬菌體治療的缺點

3.1噬菌體方面 盡管使用噬菌體作為抗菌素治療有明顯優(yōu)勢，但也有不少挫折。其中之一是缺乏適當記錄的臨床研究。目前還沒有關于治療方法、劑量、頻率和持續(xù)時間的既定協(xié)議。我們對噬菌體體內行為的了解非常有限。已經有人提出，在人體內部，網狀內皮系統(tǒng)可能會顯著減少噬菌體的數量，從而減少與病原體對抗的可能性[18]。此外，噬菌體中和抗體的出現可能會阻礙噬菌體對抗目標細菌病原體的能力。在波蘭，對57例細菌感染患者進行的一項研究記錄了這一現象，在對噬菌體進行了腸道輔助治療，這項研究在當地和口服藥期間是否會發(fā)生還沒有定論。從理論上講，噬菌體中和抗體的發(fā)展不應成為噬菌體治療的重要障礙，因為噬菌體的吸附和裂解動力學應該比宿主的抗體產生更快。另一個問題是噬菌體處理細胞內病原體的功效。盡管如此，據報道，噬菌體成功地預防了沙門氏菌病和沙門氏菌生物膜產生[19]。長期的噬菌體治療的副作用仍然未知。此外，沒有足夠的質量控制數據，噬菌體制劑的純度和穩(wěn)定性是可疑的。安全和語言障礙阻礙了科學家在俄羅斯和波蘭的期刊上解釋實驗程序。自然，噬菌體在它們的目標宿主范圍內是高度特異性的，它可能包括整個物種的成員，或者是一個物種內的一些菌株。這一特性既有消極的方面，也有積極的方面，它有助于避免對微生物群落的負面影響，以及在發(fā)現和消滅目標病原體方面的障礙。檢測一種可能導致患者病情惡化的病原體，是需要耗費大量時間的。使用噬菌體雞尾酒，它包含許多不同的噬菌體，涵蓋了廣泛的潛在毒株，是解決這一問題的一種方法。用于噬菌體治療的噬菌體應僅由毒性噬菌體，而非溫帶噬菌體組成，以避免致病性特征的水平轉移[20]。了解許多不同類型的噬菌體的確切行動模式并不是一件簡單的事情，因為噬菌體在體內條件下的表現可能與體外的不同。在孟加拉國進行的一項針對急性細菌性腹瀉兒童的隨機試驗表明，口服的噬菌體未能在腸道內擴增，導致腹瀉發(fā)作的發(fā)生沒有改變[21]。為了闡明噬菌體在體內的作用機制，還需要進行更多的噬菌體治療試驗和藥物動力學研究。

3.2細菌方面 正如細菌可能對抗生素產生抗藥性一樣，它們也可能通過一系列機制對噬菌體產生抗藥性。這些包括在細菌細胞上對噬菌體表面受體進行修飾，將噬菌體的基因組與細菌的基因組整合，并丟失特定于噬菌體復制或組裝的基因[22]。具有機制如下：

3.2.1物理阻隔 細菌細胞外結構不僅有利于細菌在惡劣環(huán)境中存活，對阻止噬菌體侵染也起一定作用。如某些固氮菌可產生藻酸鹽，增加細菌對噬菌體的抵抗。此外，許多細菌的莢膜如鏈球菌中的透明質酸也可以抵御噬菌體的侵蝕[23]。

3.2.2吸附抑制 噬菌體吸附宿主菌的部位和受體不同，由此決定了噬菌體的宿主特異性。這些受體包括細菌表面的磷壁酸、多糖、脂多糖或蛋白質等。還有一些噬菌體吸附于宿主菌的菌毛，如銅綠假單胞菌噬菌體 MPK7 和 M22 可以利用Ⅳ型菌毛作為它們的受體，當銅綠假單胞菌缺乏 pilA 基因時，可以產生對噬菌體 MPK7 和 M22 的抵抗[24]。

3.2.3注入阻滯 注入阻滯是由質粒或前噬菌體編碼的蛋白發(fā)揮阻滯 DNA 注入宿主菌的作用，是細菌抗噬菌體的第二層手段。溫和噬菌體整合入細菌宿主染色質中后，具有抵抗同種或有近緣關系的噬菌體重復感染的能力，這個過程稱為超感染排除(superinfection exclusion，Sie)[25]。

3.2.4限制—修飾系統(tǒng)(Restriction-Modification，R-M)是細菌一種廣泛地針對靶向DNA的免疫系統(tǒng)。到目前為止，在已測序的細菌和古細菌的基因組中，超過 90% 都含有 R-M系統(tǒng)[26]。

3.2.5流產感染系統(tǒng) 流產感染(abortive infection，Abi)是指當噬菌體成功注入 DNA 后，其繁殖受到阻斷，導致子代噬菌體繁殖和釋放失敗，從而避免其他細菌被噬菌體感染。與其他抵抗機制相比，這種系統(tǒng)在摧毀噬菌體的同時最終會導致宿主細菌的死亡，但是通過這種犧牲個體的方式可以保護細菌群體[27]。

3.2.6CRISPR-Cas系統(tǒng)CRISPR在近一半細菌和所有的古細菌中都存在。CRISPR序列也成為目前基因改造和基因緘默的工程工具[28]。當噬菌體感染細菌，一些細菌會在靠近 CRISPR 序列前導區(qū)處插入一段和噬菌體序列一致的間區(qū)序列，當相同噬菌體再次感染時，細菌的CRISPR-Cas相關基因產物(CRISPR-associated proteins)，利用間區(qū)序列介導產生一種CRISPR RNA 前體轉錄子(pre-crRNA)，之后被加工成小的CRISPR RNA 分子(crRNA)，利用類似 RNA干擾(RNA-interference-like)的機制啟動誘導細菌崩解入侵的噬菌體核酸[29]。

4 噬菌體在治療金黃色葡萄球菌感染方面的可行性

4.1細菌方面分析 金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽性球菌，屬于微球菌屬[30]。由于其細胞壁結構與革蘭氏菌細胞壁的不同，噬菌體對其進行裂解時只需要分泌表達裂解酶就可以對其進行裂解[31]，不需要進行其他步驟。而且金黃色葡萄球菌現在面臨的主要問題是抗生素耐藥性的產生，還沒有細菌產生針對噬菌體裂解酶抗性機制的研究報道[32]。另外，有報道對金黃色葡萄球菌用亞最小抑制濃度的裂解酶時，不會產生對裂解酶表現抗性的突變菌株。在實驗中，將噬菌體裂解酶滴到長有金葡菌菌苔的平板上，然后在空斑的邊緣處挑取單菌落繼續(xù)培養(yǎng)后再次涂平板滴裂解酶，如此重復操作40個循環(huán)，即便如此，仍然沒有抗性菌株出現[33]。在另一項研究中，體外使 MRSA 菌株暴露于遞增濃度梯度的特異性裂解酶 Cly S 或者莫匹羅星，結果8d之后產生了具有低水平莫匹羅星抗性的突變菌株，而沒有發(fā)現對裂解酶具有抗性的突變株。盡管金黃色葡萄球菌可以形成生物被膜，但是這不能阻礙裂解酶發(fā)揮其裂解活性[34]。

4.2噬菌體方面分析 細菌進化的同時，噬菌體也跟著細菌進化。如面對固氮菌產生的藻酸鹽，噬菌體F116 會產生一種藻酸鹽裂解酶，解除藻酸鹽的物理阻隔。一些噬菌體還可以通過產生多糖裂解酶或多糖水解酶來裂解胞外多糖(EPS)[35]，消除生物膜的阻礙作用。噬菌體還可通過多種方式逃避 R-M系統(tǒng)，如靶序列突變、抑制限制性內切酶、合成可以水解 R-M因子的酶 (如 AdoMet )。博得特菌(Bordetella spp)噬菌體編碼自身甲基轉移酶差異反轉錄因子 (diversity-generating retroelements，DGRs)，通過 DGRs使噬菌體與不同的細菌表面結構相互作用，促進噬菌體的吸附。面對流產感染機制，噬菌體orf38 基因的突變可以使其避免AbiQ[36]。對于CRISPR-Cas免疫而言，噬菌體僅通過原型間隔序列單點突變可克服這種免疫，如噬菌體通過自身編碼CRISPR-Cas系統(tǒng)干擾宿主的抗病毒系統(tǒng)，完成裂解循環(huán)[37]。

5 結論與展望

隨著金黃色葡萄球菌耐藥性越來越嚴重，人們急需一種新的治療手段來對付金黃色葡萄球菌。通過對噬菌體治療的優(yōu)缺點分析以及治療可行性分析，我們不難發(fā)現，雖然噬菌體治療存在一定的風險，但是其治療的優(yōu)越性是顯而易見的，如果我們的研究技術能夠更先進，未來噬菌體治療金黃色葡萄球菌感染方面將得到很好的應用。而且現在人們將目光更多的聚焦于裂解酶治療，其作為一種蛋白，具有更廣的宿主譜，且不易產生抗性，同時更容易研發(fā)成制劑，配合抗生素使用，將會有很好的效果，也是未來研發(fā)的一個主方向。