circRNA在骨骼肌中的研究進(jìn)展

向婭，柴志欣，武志娟，鐘金城，信金偉

(1.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省、教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610041;2.省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，拉薩850000)

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類不具有5'端帽子和3'端poly(A)尾巴的共價(jià)閉合的環(huán)形RNA分子，由pre-mRNA經(jīng)過(guò)反向剪接(backsplicing)形成。circRNA最早于1976年被偶然發(fā)現(xiàn)，該類病毒RNA無(wú)法在其5'或3'末端進(jìn)行酶標(biāo)記，也無(wú)法被蛇毒磷酸二酯酶降解。1979年，Hsu等［1］利用電子顯微鏡鑒定出一些在真核細(xì)胞質(zhì)中具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RNA分子，但由于它們豐度低且不常見(jiàn)的特征，在隨后的幾十年這類RNA均被認(rèn)為是剪接錯(cuò)誤的產(chǎn)物，并未引起廣泛關(guān)注。隨著高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，2012年首次報(bào)道通過(guò)RNA-Seq方法鑒定了約80個(gè)circRNAs，circRNA才正式進(jìn)入科學(xué)家的視野。隨后科學(xué)家們先后在人［2］、豬［3］、牛［4］等物種上發(fā)現(xiàn)了circRNA。近年來(lái)，大量的研究表明circRNA在生物的生長(zhǎng)發(fā)育、疾病發(fā)生和發(fā)展等方面發(fā)揮重要作用。本文就circRNA的形成機(jī)制、生物學(xué)功能及其在動(dòng)物骨骼肌形成中的功能研究進(jìn)行概述，以期為今后探索circRNA在動(dòng)物骨骼肌中的功能及分子機(jī)制提供參考。

1 circRNA的形成機(jī)制

circRNA是經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄后由上游3'剪接位點(diǎn)和下游5'剪接位點(diǎn)反向剪接形成，沒(méi)有自由5'末端帽子和3'末端poly(A)尾的共價(jià)閉合環(huán)形分子［5，6］。因核酸外切酶無(wú)法識(shí)別這種特殊的結(jié)構(gòu)而不易降解，從而確保了circRNA的穩(wěn)定性。circRNA可來(lái)源于基因組的任何區(qū)域，長(zhǎng)度從幾百到幾千個(gè)核苷酸不等。根據(jù)circRNA分子的基因來(lái)源，主要分為3類，外顯子circRNA(circular exonic RNA，ecirRNA)、內(nèi)含子circRNA(circular intronic RNA，ciRNA)、外顯子-內(nèi)含子circRNA(exon-intron circRNA，EIciRNA)。研究者認(rèn)為不同circRNA的形成受不同的剪接機(jī)制調(diào)控，而以上3種類型的circRNA在其功能上是否會(huì)有所不同，有待進(jìn)一步研究。

外顯子環(huán)狀RNA最豐富，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。其形成機(jī)制有兩種，直接反向剪接和外顯子跳躍，這兩種形成機(jī)制與經(jīng)典剪接體相關(guān)，但直接反向剪接可能比外顯子跳躍發(fā)生的更頻繁。EIciRNA是circRNA的特殊亞型，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)兩個(gè)以上的外顯子在環(huán)化時(shí)，它們之間的內(nèi)含子可能滯留其中，形成既有外顯子又有內(nèi)含子的EIciRNA［7］。有研究表明，EIciRNA的形成機(jī)制可能與ecircRNA相似，但內(nèi)含子保留的機(jī)制尚不清楚。內(nèi)含子環(huán)狀RNA主要存在于細(xì)胞核中，在釋放5'外顯子后，末端3'-OH攻擊3'剪接位點(diǎn)，生成ciRNA并釋放3'外顯子［8］。研究發(fā)現(xiàn)，部分內(nèi)含子在剪接作用中會(huì)形成套索結(jié)構(gòu)，但很快被脫分支降解［9］。作為一類特殊的內(nèi)含子circRNA，tricRNA(tRNAintroniccircRNA)是由pre-tRNA剪切后形成的［10］，tricRNA形成必須含有保守的tRNA序列基序和加工酶。

2 circRNA的生物學(xué)功能

circRNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)或外泌體中，具有組織、疾病、時(shí)序、發(fā)育階段特異性及高穩(wěn)定性等特征［11］，circRNA特殊的結(jié)構(gòu)特征使其具有特定的生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA參與了基因轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，通過(guò)不同的作用方式在細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮重要功能［7］。

2.1 miRNA sponge

circRNA富含miRNA結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)吸附miRNA，阻止miRNA在3'非翻譯區(qū)與mRNA相互作用，進(jìn)而間接調(diào)控miRNA下游靶基因的表達(dá)，發(fā)揮競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)的功能［12］。由于circRNA的長(zhǎng)度和序列不同，其結(jié)合的miRNA分子數(shù)量與種類也各不相同。

目前已發(fā)現(xiàn)7種circRNA具有miRNA“海綿”作用。CDR1as是在哺乳動(dòng)物(主要是人和小鼠)腦中高度保守、高豐度的ecircRNA［5，6］，含有70多個(gè)miR-7的結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)吸附miR-7a調(diào)控其靶基因PARPA和SP1的mRNA表達(dá)水平［13］，因此，CDR1as被稱為miR-7的circRNA“海綿”。Sry轉(zhuǎn)錄而來(lái)的circRNA包含16個(gè)miR-138的結(jié)合位點(diǎn)，可通過(guò)吸附miR-138抑制其活性，從而調(diào)控多種生理病理過(guò)程［14］。circITCH可與miR-7、miR-17和miR-214結(jié)合，導(dǎo)致ITCH表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而抑制WNT信號(hào)通路［15］。通過(guò)功能恢復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)circHIPK3能直接與miR-124結(jié)合，沉默circHIPK3抑制細(xì)胞生長(zhǎng)［16］。

2.2 調(diào)控蛋白結(jié)合

circRNA可與mRNA調(diào)節(jié)的結(jié)合蛋白(RNAbinding protein，RBP)結(jié)合形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體(RNA-protein complex，RPC)，進(jìn)而改變剪接模式或mRNA穩(wěn)定性。Du等［17］研究顯示，circFOXO3可與抗衰老蛋白ID1、轉(zhuǎn)錄因子E2F1及低氧誘導(dǎo)因子1亞單位α(hypoxia inducible factor 1 subunit α，HIF1-α)相作用，阻止RBP蛋白的核定位，導(dǎo)致心臟衰老。盲肌(muscleblind，MBL)與其親本基因第2外顯子相結(jié)合，可促進(jìn)其環(huán)化生成circMbl，Ashwal-Fluss等［18］研究發(fā)現(xiàn)，MBL與circMbl相互作用，可調(diào)控circMbl和動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病相關(guān)因子circANRIL與必需的PES1相結(jié)合，抑制血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中核糖體的生物合成，進(jìn)而導(dǎo)致核仁應(yīng)激和細(xì)胞死亡［19］。

2.3 調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄

研究表明，circRNA能夠調(diào)控其親本基因的表達(dá)。ciRNA可與RNA聚合酶Ⅱ相互作用調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，目前已知的ciRNA有ci-ankdr52、cimcm5和ci-sirt7等。EIcircRNA與小核糖核U1 snRNP相互作用形成復(fù)合體，該復(fù)合體可在其親本基因啟動(dòng)子區(qū)與RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合，調(diào)控其親本基因的表達(dá)［7］。研究發(fā)現(xiàn)，利用RNAi技術(shù)敲低circEIF3J和circPAIP2的表達(dá)，可降低EIF3J和PAIP2的轉(zhuǎn)錄［7］。而其它c(diǎn)ircRNAs能否以類似的方式參與基因的調(diào)控還有待進(jìn)一步探索。Conn等［20］研究發(fā)現(xiàn)，circSEP3可與SEP3基因座結(jié)合形成R-loop(RNA與RNA雜交環(huán))，減弱線性SEP3與DNA的結(jié)合，從而導(dǎo)致circSEP3過(guò)度表達(dá)產(chǎn)生的擬南芥花與正常植物表型存在差異。

2.4 編碼翻譯功能

circRNAs因缺少5'端帽子和3'端poly(A)尾巴不能進(jìn)行帽依賴性的蛋白質(zhì)翻譯，故早期被認(rèn)為無(wú)法翻譯編碼蛋白。隨后科學(xué)家們逐漸發(fā)現(xiàn)circRNA可通過(guò)特殊的方式進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯，部分circRNA可通過(guò)作為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRESs)的序列，促進(jìn)起始因子或核糖體直接與可翻譯circRNAs的結(jié)合;circRNA在缺乏IRES、poly(A)和5'帽結(jié)構(gòu)的條件下，可通過(guò)RCA機(jī)制翻譯蛋白質(zhì);在IRES人工引入circRNA分子后，其可在293T細(xì)胞中進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯;circRNA含有多個(gè)m6A甲基化修飾位點(diǎn)，在單個(gè)m6A的驅(qū)動(dòng)下circRNA可翻譯合成蛋白質(zhì)。

3 circRNA在骨骼肌中的相關(guān)研究

目前，有關(guān)circRNA的研究主要集中在醫(yī)學(xué)方面，如癌癥發(fā)生、心血管疾病等生理病理過(guò)程，而在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育方面的研究鮮有報(bào)道，尤其是與動(dòng)物骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的circRNA。研究表明，動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)發(fā)育除了受骨骼肌轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Myf4、Myf5、Myf6、肌細(xì)胞生成素(Myogenin)，肌細(xì)胞增強(qiáng)因子家族(Myocyte enhancer，MEF)等主效基因的調(diào)控，也受circRNA、lncRNA等非編碼RNA的調(diào)控［21-23］。肌細(xì)胞增殖分化是影響肌肉發(fā)育重要的因素，因此研究者推測(cè)circRNA在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要功能。

3.1 豬

許多學(xué)者就circRNA在骨骼肌中的調(diào)控作用在家養(yǎng)動(dòng)物中開展了相關(guān)研究。Liang等［23］對(duì)貴州小型豬的9個(gè)器官和3個(gè)不同發(fā)育階段的骨骼肌進(jìn)行circRNA全基因組分析，發(fā)現(xiàn)149個(gè)circRNAs與肌肉發(fā)育相關(guān)，并構(gòu)建了首個(gè)豬的circRNAs數(shù)據(jù)庫(kù)。而且circRNA對(duì)骨骼肌的調(diào)控機(jī)制具有時(shí)序性，在豬出生0～30d時(shí)，circRNA主要對(duì)骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育和肌纖維類型轉(zhuǎn)換進(jìn)行調(diào)控，而在30～240d時(shí)，其主要調(diào)控骨骼肌糖代謝和鈣離子信號(hào)。Sun等［24］對(duì)長(zhǎng)白豬和藍(lán)塘豬的背最長(zhǎng)肌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選出236個(gè)差異表達(dá)的circRNAs，其中40個(gè)circRNA參與到26種miRNA介導(dǎo)的ceRNA相互作用的海綿調(diào)節(jié)劑，并提出circRNA可能對(duì)豬骨骼肌發(fā)育有潛在的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。Liu等［25］對(duì)大白豬肌肉轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，肌肉中差異表達(dá)基因主要富集在TGF-β、MAPK等信號(hào)通路中，而TGF-β可通過(guò)促進(jìn)纖維細(xì)胞增殖調(diào)控肌肉發(fā)育，使大白豬出生后肌肉肥大。Voillet等［26］對(duì)不同胚胎期的大白豬骨骼肌發(fā)育機(jī)制進(jìn)行多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)的功能主要集中在骨骼肌發(fā)生后期至肌肉成熟階段的物質(zhì)能量代謝過(guò)程中。目前，對(duì)豬骨骼肌中circRNA的研究主要以篩選和鑒定為主，在肌肉發(fā)育中的功能及調(diào)控機(jī)制方面的研究尚少，可能是因?yàn)楣δ苷{(diào)控方面的研究涉及到細(xì)胞層面，需要對(duì)豬胚胎、幼年和成年時(shí)期進(jìn)行屠宰。因此，circRNA與豬骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)聯(lián)還有待進(jìn)一步研究。

3.2 牛

魏雪峰等［27］研究了秦川牛骨骼肌兩個(gè)發(fā)育階段(胚胎和成年肌肉長(zhǎng)肌)的circRNA表達(dá)譜，鑒定出1個(gè)在牛肌肉中特異性表達(dá)的circLMO7，發(fā)現(xiàn)circLMO7可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-378a-3p，解除對(duì)靶基因HDAC4的抑制作用，從而調(diào)控肌細(xì)胞的增殖分化。Li等［28，29］研究發(fā)現(xiàn)，circFUT10、circFGFR4分別通過(guò)吸附miR-133a和miR-107調(diào)控秦川牛骨骼肌細(xì)胞的增殖分化過(guò)程。上述研究表明，circRNA在秦川牛骨骼肌發(fā)育過(guò)程中具有重要調(diào)控作用。然而，尚未有circRNA在牦牛骨骼肌發(fā)育過(guò)程中的相關(guān)研究，主要是涉及到牦牛批量屠宰，且牦牛多為高原地區(qū)牧民散養(yǎng)，批量購(gòu)買經(jīng)費(fèi)較多。今后可在秦川牛的研究基礎(chǔ)上，開展circRNA與牦牛肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)聯(lián)性研究，通過(guò)研究其肌肉發(fā)育相關(guān)circRNA提高牦牛產(chǎn)肉率及肉品質(zhì)特性，為牦牛分子育種提供理論依據(jù)，同時(shí)可從非編碼RNA的角度探索牦牛與其他牛種的遺傳特性。

3.3 綿羊

石田培等［30］研究顯示，綿羊大多數(shù)差異表達(dá)circRNA主要富集MAPK信號(hào)通路中，MAPK信號(hào)通路是參與調(diào)控肌細(xì)胞增殖分化的關(guān)鍵通路，直接或間接地參與綿羊胚胎肌肉的發(fā)育調(diào)控。在比較組中還發(fā)現(xiàn)circRNA2324只在D85和D105兩個(gè)階段上調(diào)，在D135時(shí)顯著下調(diào)，說(shuō)明在胚胎骨骼肌發(fā)育后期，circRNA2324的作用受到抑制。Li等［31］使用RNA-Seq分析了胚胎、成年時(shí)期哈薩克綿羊肌肉中circRNAs的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)多個(gè)circRNAs含有與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)miRNAs的多個(gè)吸附位點(diǎn)，如oar_circ_0001413同時(shí)包含miR-133、miR-125、miR-107等多個(gè)miRNAs結(jié)合位點(diǎn)。circHIPK3可通過(guò)結(jié)合到9個(gè)miRNAs的18號(hào)結(jié)合位點(diǎn)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)，因此推測(cè)綿羊肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育可能受到circRNA的內(nèi)源性調(diào)控。

3.4 人、猴和雞等其他物種

Kotb等［32］研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在猴子的骨骼肌發(fā)育中存在大量年齡依賴性的表達(dá)，直接或間接的調(diào)控肌原性轉(zhuǎn)錄因子和肌原性視黃醇結(jié)合蛋白。Ouyang等［33］對(duì)雞3個(gè)發(fā)育時(shí)期腿肌的circRNAs進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，在946個(gè)外顯子circRNAs中發(fā)現(xiàn)有150個(gè)已知的miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，circRBFOX2可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-206抑制成肌細(xì)胞的增殖分化。

circRNA調(diào)控人體骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育及相關(guān)疾病的發(fā)生方面也開展了大量研究。Legeini等［34］研究發(fā)現(xiàn)，circ-ZNF609直接翻譯出來(lái)的蛋白可以調(diào)控肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育。Qian等［35］研究發(fā)現(xiàn)，circ19142、circ5846通過(guò)調(diào)節(jié)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，且這兩種circRNA正向調(diào)控成骨細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程。李瑞［36］在C2C12成肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Malat1可通過(guò)結(jié)合miR-133位點(diǎn)調(diào)控其靶基因SRF的表達(dá)，從而影響成肌細(xì)胞的分化。Liu等［37］的研究表明，circRNA-CER可作為ceRNA調(diào)節(jié)MMP13的表達(dá)從而調(diào)控軟骨細(xì)胞胞外基質(zhì)的降解過(guò)程，推測(cè)circRNACER可作為骨關(guān)節(jié)炎潛在的治療靶點(diǎn)。上述研究表明，circRNA在人骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中也發(fā)揮重要作用，推測(cè)circRNA可能成為一種疾病診斷、預(yù)測(cè)方面的生物標(biāo)志，尤其在癌癥的發(fā)現(xiàn)和預(yù)防方面具有重要作用。以上研究顯示，對(duì)豬、猴骨骼肌中circRNA的研究以篩選和鑒定為主，牛、綿羊、雞和人中circRNA的研究主要涉及到其miRNA“海綿”作用，對(duì)circRNA調(diào)控各物種骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)制研究還不夠深入，很多動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的相關(guān)因子有待進(jìn)一步鑒定，其功能還待進(jìn)一步闡明，因此需加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)circRNA的鑒定、功能及調(diào)控機(jī)制等方面的研究，為進(jìn)一步從功能調(diào)控方面探索與動(dòng)物肌肉發(fā)育相關(guān)的circRNA，檢測(cè)其對(duì)下游靶基因表達(dá)的影響和改善動(dòng)物遺傳素材提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

4 小結(jié)

circRNA特殊的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)預(yù)示著它具有潛在的新功能，在未來(lái)可能成為一種新型的生物學(xué)標(biāo)志。隨著高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，越來(lái)越多的circRNA被發(fā)現(xiàn)，但目前circRNA的研究仍處于起步階段，主要以篩選和鑒定為主，有很多問(wèn)題亟待解決，如circRNA數(shù)據(jù)庫(kù)尚未建立完全，僅建立了人、豬、小鼠的circRNA數(shù)據(jù)庫(kù);circRNA的生物學(xué)功能也尚存一定爭(zhēng)議;在高通量測(cè)序時(shí)需要減少檢測(cè)帶來(lái)的假陽(yáng)性;circRNA的研究已涉及多個(gè)領(lǐng)域，如基因轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖分化等，但其分子形成機(jī)制、生物學(xué)功能及在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究探索，尤其是與動(dòng)物骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的circRNA?？赡苁且?yàn)閏ircRNA是一種新型環(huán)狀分子，研究較少，缺少相關(guān)研究的參考文獻(xiàn);部分物種生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，不便于采集樣品;進(jìn)行circRNA的鑒定和功能分析，需要屠宰一定量的動(dòng)物以采集試驗(yàn)樣品，采買經(jīng)費(fèi)較高。目前已有研究表明，circRNA在動(dòng)物骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要調(diào)控作用，這或?qū)⒊蔀閯?dòng)物遺傳育種工作的新思路。因此，進(jìn)一步挖掘新的circRNA，鑒定其種類及表達(dá)模式，探索circRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，闡明其對(duì)動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的作用機(jī)制，為深入研究動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)發(fā)育提供新的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。隨著信息技術(shù)和研究工具的不斷發(fā)展，相信在不久的將來(lái)，circRNA在調(diào)控動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)發(fā)育方面的研究將有突破性進(jìn)展。