普氏原羚致病性大腸桿菌的分離及生物學(xué)鑒定

李秀萍，王世辰，簡瑩娜，林偉山，王光華，胡勇，羅濤，何玉邦，趙殿智，梁欽，李成林，馬利青

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧810016;2.青海湖國家級自然保護(hù)區(qū)管理局，西寧810001;3.青海省剛察縣林草站，剛察812399)

普氏原羚(Procapra przewalski)是一種極度瀕危的羚羊，也是中國特有的物種，被IUCN紅色名錄列為瀕危(EN)等級，是國家一級保護(hù)動物。1875年，俄羅斯探險(xiǎn)家普熱瓦爾斯基首次在內(nèi)蒙古鄂爾多斯采得本種的模式標(biāo)本，普氏原羚也因此得名。歷史上，普氏原羚曾分布于內(nèi)蒙古、甘肅、寧夏和青海的廣大地區(qū)。

20世紀(jì)60年代，普氏原羚曾是青海湖地區(qū)一種常見動物，而1994年在青海湖周邊地區(qū)僅發(fā)現(xiàn)約300只左右［1］。1999年被列入《中國瀕危動物紅皮書》，在2017年的IUCN紅皮書中被列為瀕危(EN)物種(IUCN/SSC，2017)。青海省林業(yè)局和中科院西北高原生物研究所對普氏原羚調(diào)查表明，普氏原羚現(xiàn)存7個(gè)相互隔離的種群，分別是元者、湖東、海晏剛察、塔勒旋果、鳥島、生格和切吉灘［2］。

據(jù)青海湖巡湖員講述，每年在巡湖過程中都會發(fā)現(xiàn)一些死亡的普氏原羚尸體。為確診本次普氏原羚幼齡羊死亡的原因，進(jìn)行了相關(guān)病原診斷及病原菌生物學(xué)特性分析試驗(yàn)，具體試驗(yàn)如下。

1 發(fā)病情況

2021年9月18日，剛察縣哈爾蓋鎮(zhèn)某牧民發(fā)現(xiàn)1只普氏原羚幼齡公羊不合群，精神沉郁，隨后臥地不起，最后死亡，遂反映給保護(hù)站，由保護(hù)站送檢至青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院獸醫(yī)生物技術(shù)研究室進(jìn)行病原診斷。

2 剖檢變化

心臟腫大，心包積液;肝臟有2個(gè)豌豆大小的鈣化結(jié)節(jié)灶;脾臟正常;肺臟氣腫，左側(cè)肺小葉尖部背側(cè)有4×4mm大小的淤血斑塊;腎臟未見異常;腸淋腫大;小腸鼓氣，腸壁變薄，內(nèi)充滿黃色稀便;結(jié)腸腸壁增厚，有出血點(diǎn);回盲口有潰瘍。

3 分離培養(yǎng)

無菌采集病死普氏原羚的心、肝、脾、肺、腎、腸淋、胃腸內(nèi)容物等接種至普通肉湯、鮮血平板和VF培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h。脾臟培養(yǎng)物中，普通營養(yǎng)肉湯變渾濁，表面有菌膜;鮮血平板上有灰色、中等大小、具有β溶血的圓形菌落。將可疑菌落接種于麥康凱和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃培養(yǎng)24h后，在麥康凱培養(yǎng)基上可見玫紅色菌落，在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上為黑色帶金屬光澤菌落。

4 小鼠致死性試驗(yàn)

經(jīng)鮮血平板純化的分離菌株接種至普通肉湯，分別取18h普通肉湯培養(yǎng)物0.2 mL和0.5 mL，經(jīng)腹腔注射昆明系實(shí)驗(yàn)小鼠各3只，對照組2只注射相應(yīng)劑量的營養(yǎng)肉湯，結(jié)果0.5 mL劑量組的3只小鼠在注射后12h內(nèi)死亡;0.2 mL劑量組的2只小鼠在24h內(nèi)死亡;對照組未出現(xiàn)異常。將致死小鼠的脾臟再次培養(yǎng)后，分離到相同形態(tài)的細(xì)菌。

5 生化試驗(yàn)

從細(xì)菌微量生化鑒定管中選取用于鑒定腸桿菌科的生化鑒定管(葡萄糖、乳糖、甘露醇、MR-VP、靛基質(zhì)均購自杭州微生物試劑有限公司)，將分離菌分別接種至生化鑒定管中，置37℃溫箱培養(yǎng)24h，分離菌株能發(fā)酵葡萄糖、乳糖;甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣;MR試驗(yàn)陽性;VP試驗(yàn)和靛基質(zhì)試驗(yàn)陰性，符合大腸桿菌的特性(表1)。

表1 普氏原羚肺臟分離菌株生化試驗(yàn)結(jié)果

6 分子生物學(xué)檢測

對該菌進(jìn)行分離、純化培養(yǎng)后，利用細(xì)菌16S rRNA特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(見圖1)，擴(kuò)增產(chǎn)物送樣測序，經(jīng)序列比對分析表明，分離菌株為大腸桿菌。

圖1 分離菌16S rRNA基因擴(kuò)增結(jié)果

7 藥物敏感性試驗(yàn)

藥物敏感性試驗(yàn)表明，該菌株對磺胺甲惡唑(SXT25)、諾氟沙星(NOR10)、氯霉素(C30)和環(huán)丙沙星(CIP5)高度敏感;對強(qiáng)力霉素(DO30)、四環(huán)素(TE30)、卡那霉素(K30)中等敏感;對呋喃妥因(P10)、桿菌肽(B10)和多黏霉素(CT10)耐藥(詳見表2)。

表2 分離菌株藥物敏感性試驗(yàn)

8 小結(jié)

經(jīng)臨床癥狀，剖檢變化，病原菌的分離培養(yǎng)，生化發(fā)酵試驗(yàn)，致病性試驗(yàn)，PCR及測序分子鑒定，藥物敏感試驗(yàn)，表明該普氏原羚幼齡羊是感染了致病性大腸桿菌死亡，且該菌株具有一定耐藥性。

9 討論

近年來，隨著普氏原羚種群保護(hù)力度的加大，其種群數(shù)量有所增加，但仍然沒有達(dá)到人們期望的理想數(shù)量。普氏原羚的死亡原因較多，狼是原羚的主要天敵，能造成15%～20%的死亡，網(wǎng)圍欄掛傷死亡比例占5%，報(bào)道稱原羚采食垃圾后導(dǎo)致消化不良而死亡現(xiàn)象較多［3］。也有學(xué)者認(rèn)為體內(nèi)外寄生蟲病也是死亡的原因之一［4-6］。霍賓等［7］(2020)認(rèn)為原羚的死亡與機(jī)體嚴(yán)重缺硒有一定的關(guān)聯(lián)。李忠秋［8］(2016)認(rèn)為與普氏原羚的性別、群體類型、群體大小、捕食風(fēng)險(xiǎn)、人類干擾等有關(guān)。董逵才［9］(2016)認(rèn)為環(huán)湖地區(qū)的草場圍欄和硬化渠道等人工設(shè)施是影響普氏原羚生存和發(fā)展的主要因素。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，牛、羊跟普氏原羚共享一個(gè)草場，使得家養(yǎng)動物跟野生動物之間可能存在動物疫病的相互傳播。

本次實(shí)驗(yàn)室檢測雖分離得到了致病性大腸桿菌，但并沒有進(jìn)行病原菌的動物溯源調(diào)查，從藥物敏感性試驗(yàn)的結(jié)果來看，分離菌株已經(jīng)產(chǎn)生一定耐藥性，間接說明分離菌株有可能感染自放牧家畜或棲息環(huán)境中，因?yàn)檎Ｇ闆r下野生動物是不會接觸到相關(guān)抗菌素的。

同時(shí)，本研究室在另外的研究中進(jìn)行過致病性大腸桿菌的動物溯源調(diào)查［10］，隨著野生動物病原分離培養(yǎng)的積累，在今后的研究中將會開展類似的動物病原溯源調(diào)查，以此來為控制野生動物和家養(yǎng)動物感染大腸桿菌相關(guān)疾病提供技術(shù)依據(jù)。

致謝在樣品采集過程中得到青海湖國家級自然保護(hù)區(qū)管理局和剛察縣林草站的大力支持，在此一并致謝。