全自動固相萃取氣相色譜-質譜法測定蔬菜中五氯硝基苯和百菌清殘留量

王 鐘，趙志強，徐文杰，何 漪，王 敏

（1.淄博市疾病預防控制中心，山東淄博 255026；2.淄博市環(huán)境有機污染與人群健康監(jiān)測分析重點實驗室，山東淄博 255026）

蔬菜安全是食品安全中十分重要的方面之一，蔬菜在食品中占有十分重要的地位，蔬菜中的農(nóng)藥殘留量常作為評價食品安全性的主要內(nèi)容之一[1-2]。為防止蔬菜在生長過程中遭受病蟲害，防止蔬菜在儲存和運輸過程中變質，噴灑農(nóng)藥和殺菌劑成為有效的措施之一[3]。但是，蔬菜中殘留農(nóng)藥殺菌劑的毒性嚴重危害人們的身體健康[4]。為確保蔬菜的質量安全，加強對蔬菜農(nóng)藥殘留檢測方法及農(nóng)藥污染控制措施的研究就顯得尤為重要。農(nóng)藥五氯硝基苯具有化學性質穩(wěn)定、不易揮發(fā)、不易氧化分解等特點，對多種蔬菜的苗期病害有較好的防治效果[5]。百菌清是一種高效、低毒的廣譜殺菌劑，已被廣泛應用于蔬菜病害的防治。對于文獻報道的五氯硝基苯農(nóng)藥殘留量和百菌清殘留量的檢測方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜-質譜法[6-9]。全自動固相萃取氣相色譜-質譜法測定蔬菜中五氯硝基苯和百菌清殘留量的檢測方法鮮有報道[10-11]。本文研究了全自動固相萃取儀凈化，用氣相色譜質譜儀同時測定蔬菜中的五氯硝基苯和百菌清農(nóng)藥殘留量的檢測方法，取得了較好的結果。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

氣相色譜-質譜儀（GC-MS QP 2010plus）；全自動固相萃取儀（Reeko Fotector Plus，48位）；氮氣吹干儀（OA-SYS/美國Organomation）；渦旋混勻器（SZ-1型，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠）；分析天平（賽多利斯sartorius CP225D）：感量0.000 01 g；高速組織搗碎機（Retsch GM200）；離心機（Thermo ST 16R）：轉速5 000 r/min；旋轉蒸發(fā)儀（STEROGLASS STRIKE 300）；乙腈（默克，色譜純）；丙酮（默克，色譜純）；甲苯（默克，色譜純）；正己烷（默克，色譜純）；Florisil固相萃取柱（安捷倫公司；1 g，6 mL）；氯化鈉（國藥集團，優(yōu)級純）；無水硫酸鈉（國藥集團，分析純）：經(jīng)550 ℃烘烤4 h，儲存于干燥器中，冷卻后備用；五氯硝基苯（GSB 05-1845-2016，100 μg/mL），定值單位：農(nóng)業(yè)部環(huán)?？蒲斜O(jiān)測所；百菌清（GSB05-2312-2016，100 μg/mL），定值單位：農(nóng)業(yè)部環(huán)?？蒲斜O(jiān)測所。內(nèi)標溶液配制：稱取美國AccuStandard 環(huán)氧七氯純品2.5 mg，用甲苯溶解并定容至100 mL，搖勻，濃度為25 mg/L。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的制備與保存

取蔬菜（以大白菜為例）樣品1 kg左右，取可食部分用勻漿儀充分粉碎。所取樣品平均分為2份，1份供測定，另1份放置于-20 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.2 提取

稱取15.00 g蔬菜樣品（精確至0.01 g）于50 mL具塞離心管中，加入60 μL內(nèi)標溶液，加入5.0 g氯化鈉，充分振搖混勻，加入30.0 mL乙腈，渦旋混勻1 min后置于超聲波儀中超聲20 min，加入8 g無水硫酸鈉，再渦旋混勻1 min，于4 000 r/min離心5 min，吸取上清液20.0 mL至25 mL離心管中，于35 ℃水浴中氮吹濃縮至近干，加入5.0 mL正己烷復溶，待凈化。

1.2.3 凈化和濃縮

取Florisil固相萃取柱（1 g，6 mL），依次用4 mL丙酮+正己烷（1∶9，v/v）溶液和4 mL正己烷活化后，吸取1.2.2提取液于固相萃取柱中并及時收集流出液，用6 mL丙酮+正己烷（1∶9，v/v）溶液洗脫，收集并合并洗脫液，于35 ℃水浴中氮吹濃縮至近干，用正己烷定容至1.00 mL，于GC-MS進樣分析，全自動固相萃取儀條件見表1。

表1 全自動固相萃取儀凈化條件

1.2.4 氣相色譜-質譜儀條件

色譜柱：石英毛細管質譜柱（RTX-5 MS，30 m×0.25 mm，0.25 μm）；柱箱溫度控制程序：初始溫度40 ℃，保持1 min，以30 ℃/min速率升至130 ℃，保持0 min，再以5 ℃/min速率升至250 ℃，保持5 min；色譜儀載氣類型：高純氦氣（純度＞99.999%），流速為1.9 mL/min；進樣口溫度：280 ℃；進樣方式：不分流進樣，1.5 min后開啟分流閥；傳輸線溫度：280 ℃；進樣量體積：1.0 μL；電子轟擊源（EI）能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；溶劑延遲：9.5 min；掃描模式：選擇性離子檢測（SIM）；定量方法：峰面積內(nèi)標法定量，目標物及內(nèi)標保留時間及定性、定量離子見表2。

表2 保留時間和質譜特征離子

1.2.5 標準曲線繪制

分別吸取五氯硝基苯、百菌清標準儲備溶液各0 μL、1.0 μL、2.0 μL、5.0 μL、10.0 μL 和 20.0 μL 于 6個1 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，每個容量瓶中加入40 μL內(nèi)標溶液，配制成混合標準工作溶液。

1.2.6 測定

（1）定性測定。對混合標準溶液及樣液按上述規(guī)定的條件進行測定時，如果樣液與混合標準溶液的選擇離子圖中在相同保留時間有峰出現(xiàn)，則根據(jù)定性選擇離子的種類及其豐度比對其進行陽性確證。

（2）定量測定。取凈化濃縮后的樣品溶液，按照上述儀器條件，進樣分析。將目標物和內(nèi)標物響應值的比值帶入標準曲線，計算目標物濃度。

2 結果與討論

2.1 優(yōu)化固相萃取條件

2.1.1 選擇合適的固相萃取凈化柱

在固相萃取法中，常用的吸附劑有反相C18、弗羅里硅土、石墨化碳黑、中性氧化鋁等。本文試驗了弗羅里硅土、反相C18、中性氧化鋁和石墨化碳黑的加標回收率。當用弗羅里硅土作為固相萃取劑時，五氯硝基苯和百菌清的回收率均在90%左右；當使用中性氧化鋁為固相萃取劑，兩者的回收率在70%左右，均高于反相C18和石墨化炭黑固相萃取柱；但中性氧化鋁的活性易受到樣品中含水量變化的影響，在相同條件下，其對色素的吸附能力比弗羅里硅土差，因此，最終選用弗羅里硅土為填充劑的固相萃取柱。

2.1.2 選擇固相萃取劑用量（固相萃取柱的規(guī)格）

在固相萃取法中，固相萃取柱填料的用量過少，凈化效果差；但如果填料用量過多，則需要用更大量的洗脫溶劑洗脫。試驗研究發(fā)現(xiàn)，當弗羅里硅土與蔬菜基質的質量比為1∶10時，方法回收率較高，且凈化效果較好。故本試驗選擇弗羅里固相萃取劑的用量為1.0 g（實際凈化蔬菜基質為10 g）。

2.1.3 選擇洗脫溶劑種類和洗脫液體積

大多數(shù)有機氯農(nóng)藥能較好的溶解在溶劑丙酮和正己烷中。根據(jù)此特點，本試驗分別以正己烷、丙酮+正己烷（1∶9）、丙酮+正己烷（1+1）和丙酮+正己烷（1+9）為洗脫溶劑，各取10 mL用量來考察對五氯硝基苯和百菌清的洗脫回收率。試驗研究發(fā)現(xiàn)，當用正己烷作為洗脫溶劑時，對目標物的洗脫強度較弱，回收率較低；當用丙酮+正己烷（1+9）作為洗脫溶劑時，對目標物的洗脫效果最好，五氯硝基苯和百菌清的添加回收率均在90%以上。在選定的丙酮+正己烷（1+9）作為洗脫溶劑的條件下，用20 mL洗脫溶劑考察了最佳用量，見圖1。由圖1可知，當用10 mL洗脫液時可以把90%以上的目標物洗脫下來。但當隨著洗脫液用量的進一步增大，加標回收率變化不明顯。最后確定最佳洗脫劑為丙酮+正己烷（1+9），用量為10 mL。

圖1 丙酮+正己烷（V/V=1+9）洗脫曲線

2.2 方法的線性范圍與最低檢測濃度

試驗表明，在所選五氯硝基苯、百菌清標準溶液濃度在0.10～2.00 μg/mL，按照上述優(yōu)化好的儀器條件進樣分析，色譜圖見圖2。以濃度為橫坐標，以目標物的響應值（峰面積）與內(nèi)標物響應值（峰面積）的比值為縱坐標繪制標準曲線，五氯硝基苯的方程為y=-0.006 8+0.28x，相關系數(shù)r大于0.999；百菌清的方程為y=-0.063+0.98x，相關系數(shù)r大于0.999。以3倍的基線噪音計算檢出限，當取樣量為15.0 g時，方法的最低檢測濃度分別為五氯硝基苯0.003 mg/kg，百菌清0.001 mg/kg。

圖2 標準色譜圖（1.0 μg/mL）

2.3 精密度和準確度試驗

稱取蔬菜（以大白菜為例）4份，1份作為本底檢測，另3份分別加入濃度0.50 μg/mL、1.00 μg/mL、1.50 μg/mL的五氯硝基苯和百菌清混合標準溶液各1.0 mL進行加標回收試驗來表示方法的準確度。同時對加標樣品進行（n=10）多次重復測定，用結果的相對標準偏差（RSD）來表示方法的精密度。試驗結果顯示，五氯硝基苯加標回收率為82.6%～91.6%，精密度為7.0%～9.6%；百菌清的加標回收率為83.0%～95.1%，精密度為6.5%～11.0%。

3 結論

本文研究了全自動固相萃取氣相色譜-質譜聯(lián)用法同時測定蔬菜中五氯硝基苯、百菌清農(nóng)藥殘留量。該方法檢測全過程全自動化程度高、精密度好、準確度高、檢出限低，適用于蔬菜中五氯硝基苯、百菌清殘留量的測定要求。