大鯢膠原蛋白肽制備工藝的優(yōu)化

于 洋，王東方，王 欣，白義化，邢曉明，馮 靜

（威海市宇王集團(tuán)海洋生物工程有限公司，山東威海 264200）

大鯢又稱娃娃魚，是世界上現(xiàn)存兩棲類動物中壽命最長的動物。野生大鯢作為我國珍稀名貴特產(chǎn)，已被列為國家二級保護(hù)動物[1-2]，經(jīng)現(xiàn)代營養(yǎng)成分分析研究結(jié)果表明：其含有18種氨基酸，是人體營養(yǎng)需求的優(yōu)質(zhì)蛋白源，具有極高的營養(yǎng)價值和藥用價值，被譽(yù)為“水中人參”[3]。大鯢喜棲息于山區(qū)清澈溪流以及山溪的石隙間，洞穴位于水面以下。其是中國特有物種，產(chǎn)于華北華中、華南和西南各省。近年來，由于人為因素，尤其是生存環(huán)境喪失、棲息地破壞以及過度利用，使野生大鯢物種數(shù)量銳減，大鯢的分布區(qū)成倍縮小。其生存地點多為人們難以達(dá)到的石灰?guī)r溶洞或者地下暗河。溶洞或者暗河這些惡劣的環(huán)境下，大鯢生存受到嚴(yán)峻的脅迫?，F(xiàn)因國家批準(zhǔn)許可小部分養(yǎng)殖專業(yè)戶利用人工養(yǎng)殖子二代以下的個體進(jìn)行科研、加工和利用，故涌現(xiàn)大量人工養(yǎng)殖和馴化大鯢的景象。目前，大鯢主要被粗加工成菜肴，但大鯢的深加工產(chǎn)品寥寥無幾。所以為了充分有效地開發(fā)利用人工養(yǎng)殖子二代大鯢和提高其附加值，其營養(yǎng)價值等問題的研究非常重要。

膠原蛋白廣泛存在于自然界的動物組織中，并且具有重要的作用。因其結(jié)構(gòu)的多樣性和良好的生物相容性，在日常生活中，膠原蛋白被廣泛地應(yīng)用于食品、化妝品、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，而它的生產(chǎn)來源主要依賴于陸地生物（主要為豬和牛）。由于氨基酸組成和交聯(lián)度等方面的差異，使得大鯢所含有的豐富膠原蛋白具有很多牲畜膠原蛋白所沒有的優(yōu)點，例如大鯢膠原蛋白肽具有膠原蛋白含量高、分子量低、生物污染物少和毒素微量、低抗原性、低過敏性等優(yōu)點。傳統(tǒng)大鯢膠原蛋白肽提取工藝是先將大鯢經(jīng)過高溫提取，在最適pH條件下，加入適量的酶解劑，進(jìn)行酶解提取，即成肽，完成后進(jìn)行精細(xì)過濾；濾液進(jìn)入蒸發(fā)濃縮系統(tǒng)濃縮脫水，經(jīng)濃縮后的液體達(dá)到一定濃度后，進(jìn)入噴霧干燥設(shè)備，所得粉末即為大鯢膠原蛋白肽。但是這樣制得的傳統(tǒng)大鯢膠原蛋白肽，過濾傳統(tǒng)工藝有以下缺點：①提取液體積較大，產(chǎn)品的生產(chǎn)周期較長；②酶解液除雜不徹底，影響產(chǎn)品品質(zhì)；③所得成品往往具有苦腥味，口感差。基于此，本文以人工養(yǎng)殖子二代大鯢為原料，對大鯢膠原蛋白肽的工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大鯢，威海市宇王集團(tuán)海洋生物工程有限公司提供；水解蛋白酶（40萬U/g）、中性蛋白酶（20萬U/g）、風(fēng)味蛋白酶（10萬U/g），諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司。

膠原蛋白肽生產(chǎn)線，威海市宇王集團(tuán)海洋生物工程有限公司；生物膜過濾系統(tǒng)，合肥科佳高分子材料科技有限公司；高效液相色譜儀，日本島津公司；恒溫干燥箱，上?，槴\實驗設(shè)備有限公司；超聲水浴箱，昆山美美超聲儀器有限公司；超聲波振蕩器，昆山美美超聲儀器有限公司；分析天平，奧豪斯儀器常州有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大鯢膠原蛋白肽制備工藝的優(yōu)化

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，針對大鯢膠原蛋白肽質(zhì)量不高、純度低、異味重、過敏原難去除以及分子量分布不均等許多共性問題和難題，精確研究分子量均一可控的酶解關(guān)鍵技術(shù)，以及生物膜過濾純化核心配套技術(shù)，實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)高純度、高效率、低能耗、分子量均一可控的大鯢膠原蛋白肽產(chǎn)品自主創(chuàng)新技術(shù)。大鯢膠原蛋白肽提取優(yōu)化工藝為人工養(yǎng)殖子二代大鯢→宰殺去膽囊和脂肪組織→預(yù)處理→脫脂→絞碎→提取→酶解催化→脫腥脫味→多級生物膜過濾分離技術(shù)→濃縮→噴霧干燥。

1.2.2 試驗步驟

①樣品處理：將活的人工養(yǎng)殖子二代大鯢停食數(shù)天使其排空腸道，再宰殺，去膽囊和部分脂肪組織。②預(yù)處理：將大鯢清洗干凈，并切成1～3 cm大鯢塊，備用。③脫脂：用氫氧化鈉溶液對大鯢塊進(jìn)行脫脂處理，脫脂溫度為20～25 ℃，時間1 h。④絞碎：將脫脂后的大鯢塊投入絞肉機(jī)中，絞成肉糜。⑤提?。簩⒚撝幚砗蟮拇篥F塊加水提取，提取過程中控制溫度95～100 ℃，熬煮時間1 h。⑥酶解催化：待提取液冷卻后，加入水解蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成的復(fù)合蛋白酶進(jìn)行酶解。酶解溫度為50～55 ℃，酶解時的pH控制在7.5～8.5左右，酶解時間4 h。⑦滅活：酶解完成后將酶解液升溫滅活，滅火溫度為90～100 ℃，滅火時間20～30 min。⑧脫腥脫味：將酶解液經(jīng)過多級過濾后，加入活性炭和助濾劑進(jìn)行脫炭處理30 min，得到澄清透亮的大鯢酶解液。⑨多級生物膜過濾分離技術(shù)：在常溫下對物料進(jìn)行有效的過濾，分離時不發(fā)生相變化，適用對膠原蛋白肽進(jìn)行分離，去除雜質(zhì)、菌絲。對于大鯢酶解液中分子量為150～1 000 Dalton小分子肽有分離性能；對于無機(jī)鹽的分離則存在Donnan效應(yīng)。⑩濃縮：利用雙效濃縮器對大鯢膠原蛋白肽液進(jìn)行濃縮。?離心噴霧：離心噴霧干燥得到大鯢膠原蛋白肽粉。

2 結(jié)果與分析

工藝改進(jìn)前后生產(chǎn)的大鯢膠原蛋白肽的分子量如圖1、圖2所示。傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的大鯢膠原蛋白肽相對分子量小于1 000 D的水解物所占比例為36.2%；而水解物中≥80%的肽段相對分子質(zhì)量為643.7，如表1所示。工藝改進(jìn)后生產(chǎn)的大鯢膠原蛋白肽中相對分子量＜1 000 D的肽段占比達(dá)到95.04%，≥80%肽段的相對分子質(zhì)量為317.14，如表2所示。因此，通過多級逆流萃取技術(shù)和納濾膜分離技術(shù)的共同改進(jìn)，生產(chǎn)出的大鯢膠原蛋白肽粉的分子量由原來的1 000 D～2 000 D變成現(xiàn)在均一穩(wěn)定、易于人體吸收且低于1 000 D的低聚肽。高溫催化、風(fēng)味酶的添加、管膜、納濾膜過濾等方法避免了膠原蛋白肽在酶解過程中產(chǎn)生的苦味肽，使得現(xiàn)在生產(chǎn)的大鯢膠原蛋白肽的口感更優(yōu)，并且無明顯的腥苦味，為以后以大鯢膠原蛋白肽為基礎(chǔ)生產(chǎn)不同劑型的保健品、飲品、糖果等提供了保障，可滿足不同客戶人群的需求。

圖1 傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)大鯢膠原蛋白肽的分子量分布圖

圖2 工藝改進(jìn)后生產(chǎn)大鯢膠原蛋白肽的分子量分布圖

表1 傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)大鯢膠原蛋白肽分子量分布范圍

表2 工藝改進(jìn)后生產(chǎn)大鯢膠原蛋白肽分子量分布范圍

3 結(jié)論

本研究采用堿處理對大鯢進(jìn)行脫脂預(yù)處理，通過三重生物酶復(fù)合酶解和多級逆流固液萃取技術(shù)以及生物濾膜過濾技術(shù)，將原來分子量大部分為1 000～2 000 D的大鯢膠原蛋白肽更新為分子量在1 000 D以下的低分子量的產(chǎn)品，獲得了高純度、無異味、易于人體吸收的低分子量的大鯢膠原蛋白肽，為不同人群、不同需求供應(yīng)不同產(chǎn)品提供了技術(shù)支持。并且有文獻(xiàn)記載，小分子量多肽更有利于人體吸收和抗氧化活性的增強(qiáng)［4-5］，這表明大鯢活性肽作為保健食品具有潛在的優(yōu)勢。

經(jīng)過提取工藝的改進(jìn)和采用多級生物膜過濾分離技術(shù)，大鯢膠原蛋白肽的分子量由原來小于1 000 D的蛋白質(zhì)水解物所占比例為36.2%轉(zhuǎn)變?yōu)楝F(xiàn)在95.04%。解決了大鯢膠原蛋白肽產(chǎn)品質(zhì)量不高、純度低、異味重、過敏原難去除以及分子量分布不均等許多共性問題和難題，實現(xiàn)了規(guī)?；a(chǎn)高純度、高效率、低能耗、分子量均一可控的大鯢膠原蛋白肽產(chǎn)品自主創(chuàng)新技術(shù)。