阿魏酸酯酶及其產生菌株的功能特性及應用研究

楊晶晶，曹陽

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，大慶 163319）

阿 魏 酸 酯 酶（Ferulic acid esterase，FAE，EC 3.1.1.73）又名肉桂酸酯酶、肉桂酸水解酶，屬于羧酸酯酶亞類。1987年，MacKenzie等[1]首次在橄欖色鏈霉菌中發(fā)現阿魏酸酯酶。于1991年被成功分離純化，并研究了其理化性質[2]。1990~2000年，關于阿魏酸酯酶文獻總量大約有240篇，而2001~2008年大約就有420篇，其中大多數是真菌產生的阿魏酸酯酶[3]。

產阿魏酸酯酶菌株在自然界中分布廣泛。桑姝麗[4]從海水中采用平板透明圈法分離到一株具有阿魏酸酯酶活性的菌株，經一系列鑒定推測為嗜甲基菌科，這是此菌株首次被發(fā)現具有阿魏酸酯酶活性。劉小梅等[5]在富含植物纖維的腐土樣中篩選出產阿魏酸酯酶菌株，經鑒定為谷子彎孢菌。李玉霞等[6]采用平板法，從熱帶牧草青貯飼料中篩選出產阿魏酸酯酶活性較強的乳酸菌。李翠翠等[7]從黃酒中分離出一株高產阿魏酸酯酶的枝狀枝孢霉菌，結果表明，該菌株可在黃酒釀造中發(fā)揮積極作用。產阿魏酸酯酶菌株也可從人和動物的腸道、反芻動物瘤胃中分離得到，但大部分為厭氧微生物，分離培養(yǎng)較為困難，不能滿足規(guī)模生產的需求[8]。雖然大多數微生物均能產生阿魏酸酯酶，但目前阿魏酸酯酶工業(yè)化生產的來源主要為真菌[9]。隨著工業(yè)化應用阿魏酸酯酶不斷的擴大范圍，更多的研究者致力于尋求能夠產生阿魏酸酯酶的優(yōu)良菌株。

自2020年7月1日起，我國已全面禁止在畜禽飼料中添加抗生素，因此探究和開發(fā)抗生素替代物是當前飼料和養(yǎng)殖行業(yè)的研究焦點[10]。阿魏酸酯酶作為添加劑添加到飼料中有望代替抗生素的部分功效。阿魏酸（Ferulic acid，FA）是阿魏酸酯酶通過水解酯鍵釋放出來的，它是天然的抗氧化劑，屬于植物細胞壁中一種酚酸，在機體內可起到降血脂、抗血栓、消炎抗菌等多種功效[3]。阿魏酸酯酶也是降解木質纖維的關鍵酶之一[11]，它能使飼料中木質纖維素的結構疏松、加快植物細胞壁的降解速度，達到增強動物對飼料消化功能的目的[12]，這對提高飼料利用率具有重要意義。

1 產阿魏酸酯酶菌株及其產酶的種類

目前已知的產阿魏酸酯酶菌株包括細菌、真菌、放線菌，且大部分是從真菌中分離出來的[9]。細菌包括乳酸桿菌屬（植物乳桿菌、布氏乳酸菌、嗜酸乳桿菌、約氏乳桿菌，均為桿菌）[13]、熒光假單胞菌、熱纖梭菌、伯克霍爾德氏菌屬[14]等；真菌包括曲霉屬（黃曲霉、米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉）等[15]；放線菌中主要為鏈霉菌，除蟲鏈霉菌等均可產生阿魏酸酯酶[16]。

根據阿魏酸酯酶蛋白質一級結構的同一性以及酶作用底物的類型，可將其分為A、B、C、D四類[17-18]。A型阿魏酸酯酶底物是含甲氧基的物質，如芥子酸，是一種有刺激氣味的黃褐色粉末，對水體容易造成污染。除了具有A型阿魏酸酯酶的功能，B型阿魏酸酯酶還能催化香豆酸和咖啡酸等物質。C型阿魏酸酯酶的一級蛋白序列類似于綠原酸酯酶、鞣酸酯酶的氨基酸序列。D型阿魏酸酯酶含有一種能水解植物細胞壁中酯鍵的熒光假單胞菌纖維素乙酰酯酶[18]。到目前為止，4種類型的阿魏酸酯酶已經從黑曲霉中被分離鑒定出來[19]。此外，Udatha等[20]基于分類和機器學習算法的描述符，將阿魏酸酯酶分成12個家族。這種新型分類系統(tǒng)和傳統(tǒng)的分類并不矛盾，它極大擴展了對產阿魏酸酯酶菌株分類領域的認識，以使人們能夠更為系統(tǒng)地了解產阿魏酸酯酶菌株的作用方式。

2 不同培養(yǎng)條件對產阿魏酸酯酶菌株生長及其酶活性的影響

2.1 溫度對產阿魏酸酯酶菌株生長及其酶活的影響

溫度對菌株的生長以及酶活性有很大的影響。過高或過低的溫度都不利于菌株的生長及產酶，甚至使酶失活[21-23]。約氏乳酸桿菌菌株的產酶最適溫度為30℃。在此溫度下，酶活力高、穩(wěn)定性好，當溫度低于20℃或高于40℃時，酶活均較低，且超過40℃后酶活下降較快[24]。嗜熱真菌菌株產酶的最適溫度為55℃，此時酶具有較好的穩(wěn)定性[25]。溜曲霉菌株產酶的最適溫度為32℃，溫度高時，菌體生長快，但容易老化，致使菌體活力維持時間較短[26]。

2.2 pH對產阿魏酸酯酶菌株生長及其酶活的影響

不同來源的菌株產生的阿魏酸酯酶pH存在著一定的差異。荷斯坦閹牛瘤胃液中的阿魏酸酯酶的最適pH為9.0[25]；大腸桿菌的阿魏酸酯酶MhpC的最適pH為7.0[27]。嗜甲基菌科菌株的最適生長pH為7.0，且pH在6.0~9.0時有較好的穩(wěn)定性[4]。溜曲霉菌株的生長和產酶最適pH分別為5.0和6.0[26]。伯克霍爾德氏菌屬菌株的最適產酶pH為6.5，且此時酶活最大，而最適生長pH為5.5，由此可見菌株的最適pH未必是最適產酶pH[14，28]。

2.3 金屬離子對產阿魏酸酯酶菌株生長及其酶活的影響

張雷等[16]研究得出Mg2+、Mn2+可促進阿魏酸酯酶的活性，K+、Ca2+、Fe2+、Cu2+對該酶有一定的抑制作用，Zn2+對該酶有顯著的抑制作用。而K+、Na+、Ca2+對嗜熱真菌產生的阿魏酸酯酶活性有顯著的促進作用，Fe3+和Zn2+對該酶有輕微的抑制作用，Cu2+和Mn2+對該酶的抑制作用更為顯著[25]。深綠木霉產阿魏酸酯酶的活性可被Mg2+和Ca2+等激活，Pb2+、Hg2+等重金屬離子幾乎可以完全抑制該酶的活性[29]。

2.4 碳源對產阿魏酸酯酶菌株生長及其酶活的影響

溜曲霉菌株產生的阿魏酸酯酶能在葡萄糖、乳糖、甘油和蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中生長，但在蔗糖中繁殖最好，而在乳糖中菌落數量最低[30]。菌株在上述碳源中基本不產生阿魏酸酯酶，而且酶活很小，主要因為隨著糖的不斷分解，分解代謝物阻礙菌體產生阿魏酸酯酶[31]。而許錫凱等[32]發(fā)現好食脈孢菌菌株在以葡萄糖為碳源時阿魏酸酯酶含量最多且酶活最大。

2.5 氮源對產阿魏酸酯酶菌株生長及其酶活的影響

溜曲霉菌株產生的阿魏酸酯酶能在尿素、蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、酵母浸提物為氮源的培養(yǎng)基中生長，該菌株在蛋白胨、酵母提取物培養(yǎng)基中生長良好，但在尿素中生長較差[26]。好食脈孢菌菌株在以尿素為氮源的培養(yǎng)基中，生長良好且產酶最多[32]。由于有機氮源富含蛋白質、游離的氨基酸、少量的糖類、脂肪以及生長因子等，微生物能在此培養(yǎng)基中旺盛生長[33]。

2.6 接種量對產阿魏酸酯酶菌株生長及其酶活的影響

接種量對產阿魏酸酯酶菌株的生長影響較小，接種量少會延遲菌株的產酶時間，接種量多時菌體很快達到穩(wěn)定期，但對營養(yǎng)的利用和代謝廢物的產生也快，導致衰亡期較快到來[34-35]。接種量對產酶量有較大的影響，接種量太少或太多都會使產酶量減少，黑曲霉菌株最適接種量為1%[36]。溜曲霉菌株最適接種量為2.5%[26]。而康超等[37]研究發(fā)現黃曲霉菌株接種量為4%時阿魏酸酯酶酶活最高。接種量較少時，菌體生長緩慢且產酶量低。當接種量過多時，由于菌體生長過快，導致培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質明顯不足，從而影響菌體的生長及產酶[23]。

2.7 轉速對產阿魏酸酯酶菌株生長及其酶活的影響

溶解氧在一定范圍內隨轉速的增加而增多，有利于菌體的生長以及提高產酶量。黃曲霉菌株在轉速為200 r·min-1時產阿魏酸酯酶最多，酶活最高[37]，但轉速過高之后，溶解氧急劇升高，同時產生大量代謝物，影響菌體生長，產酶量也就降低[4]。

2.8 發(fā)酵時間對產阿魏酸酯酶菌株生長及其酶活的影響

菌體數量隨著發(fā)酵時間的延長而增多，當數量較多時有利于產酶量的提高。溜曲霉菌株在48 h時菌體量達到最多且酶活在96 h時達到最大[26]。黃曲霉菌株在84 h時菌體量及酶活達到最高，然后又因菌體數量過多，引起培養(yǎng)基中氧氣和營養(yǎng)物質供應不足，最終導致菌體數量明顯下降[38-40]。

3 產阿魏酸酯酶菌株的培養(yǎng)特性及菌體形態(tài)特征

產阿魏酸酯酶的黃曲霉菌株，它有一個疏松的放射狀分生孢子頭和一個近球形的頂囊，在小梗上鏈狀著生，周圍有呈球形的小突起[37]。在固體培養(yǎng)基上，嗜甲基菌科菌株形成表面粗糙干燥，邊緣不規(guī)則的白色菌落，可延伸到培養(yǎng)基內部，顯微鏡下觀察到這些細胞呈球形，革蘭氏陰性菌[4]。伯克霍爾德氏菌屬在LB固體培養(yǎng)基上可形成形態(tài)為淡黃色、規(guī)則橢圓形、表面濕潤光滑、不透明的菌落，革蘭氏陰性菌，菌體桿狀、有鞭毛、無芽孢[14]。在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，溜曲霉菌株形成表面凹凸不平的菌落，菌絲鋪成棉氈狀，有放射狀皺褶，呈螺紋狀，菌絲初期為白色，隨培養(yǎng)時間的延長顏色逐漸為黑色，菌絲因其營養(yǎng)菌絲扎根于培養(yǎng)基內部而不易挑起，孢子彎曲如新月并逐步膨脹[26]。

4 阿魏酸酯酶水解產物的功能

阿魏酸酯酶是羧酸酯酶的一個亞類，可通過水解木質素與多糖、多糖與多糖之間的共價鍵形成阿魏酸，阿魏酸是存在于細胞壁中的酚酸，在甘蔗、竹子、甜菜、小麥等植物中含量最為豐富[11]。阿魏酸與細胞壁中木質素和半纖維素通過酯鍵和醚鍵連接，形成致密的網狀結構[41]。利用阿魏酸酯酶切斷相交聯的酯鍵，破壞細胞的網狀結構，使木質纖維素結構變得疏松，其他水解酶類更容易作用于底物中心，從而可達到有效降解利用的目的。阿魏酸具有降血脂、抗氧化、抗血栓、防治冠心病、防癌、消炎抗菌、清理身體內含有的自由基以及抗突變等醫(yī)療效果[3，42]，在養(yǎng)殖業(yè)應用可達到預防畜禽某些疾病，增強機體的免疫力的作用。目前，工業(yè)生產阿魏酸可采用的方法包括從植物中直接提取法、化學合成法、生物酶解法和堿解法等。其中，以阿魏酸酯酶為主的生物酶解法，因其所需原材料主要來自各種農作物副產品如麥麩、甜菜渣、玉米等，生產成本低廉、反應迅速、生產過程中污染輕微、產品較為安全等優(yōu)勢而受到廣泛關注[25]。

5 阿魏酸酯酶的結構與作用機理

近些年來，人們對黑曲霉的A型阿魏酸酯酶（AnFaeA）的晶體結構進行了廣泛的研究，Hermoso等[43]于2004年首次解析了該結構，證實該酶是一種典型的α/β水解酶結構，空間上是一個結構緊湊的球形蛋白（圖1a），整個拓撲結構由7個α螺旋，9個β折疊，2個β小片段折疊區(qū)構成（圖1b）。Prates等[44]的研究發(fā)現，來源不同菌株產生的阿魏酸酯酶在結構上雖然有所差異，但均為球蛋白結構，活性中心是以氨基酸Ser133-His194-Asp247的三聯體結構（圖2）。活性位點是絲氨酸Gly-X-Ser-X-Gly的保守區(qū)域，也是脂肪酶以及酯酶的保守域。從三級結構來看，構成供小分子進入的“入口”為天冬氨酸殘基、組氨酸殘基和絲氨酸殘基，這是完成酯鍵水解的關鍵結構。第136~176位氨基酸殘基形成的結構類似“蓋子”，該結構內部疏水性大小和周圍氨基酸殘基極性的大小可能會影響阿魏酸酯酶的活性以及底物選擇性[13]。在催化反應過程中，起催化作用的組氨酸結合天冬氨酸殘基，阿魏酸酯酶的絲氨酸活性中心結合底物中的阿魏酸殘基，形成一個穩(wěn)定的四面體過渡態(tài)，酯鍵被活性中心催化打開，形成?；?酶的復合物，再以親核形式攻擊四面體中間物，打開酯鍵并釋放出游離的阿魏酸[45]（圖3）。

圖1 阿魏酸酯酶AnFaeA的結構[43]Fig.1 The structure of ferulic acid esterase AnFaeA

圖2 阿魏酸酯酶的活性中心[44]Fig.2 The active center of ferulic acid esterase

圖3 阿魏酸酯酶的作用機理[45]Fig.3 The mechanism of ferulic acid esterase

6 阿魏酸酯酶的應用

6.1 糧食副產物加工阿魏酸

農作物在糧食加工時會大量產生副產品，如麥麩、米糠、玉米麩、啤酒糟等，其細胞壁富含的阿魏酸結合木質素、纖維素和半纖維素等形成酯類物質，導致無法發(fā)揮生物學功能[24]。傳統(tǒng)工業(yè)中，細胞壁中的阿魏酸是用堿法提取的，但高濃度的堿會改變植物細胞壁中某些成分以及容易造成化學殘留等影響。目前，主要是利用阿魏酸酯酶提取阿魏酸的方法。植物細胞壁中的游離阿魏酸能被阿魏酸酯酶釋放出來，此方法相對溫和，具有特異性高、反應速度快以及對環(huán)境友好等優(yōu)點，已被大家廣泛重視[5]。

6.2 生物法生產酒精

阿魏酸酯酶被認為是生成生物乙醇等產品時輔助木質纖維素水解所必需的酶。將其與氧化酶和水解酶結合使用，改善植物材料的分解，提高可發(fā)酵碳水化合物的利用率[46]，在發(fā)酵酒精時，添加適量的阿魏酸酯酶提高其產率，還能去除異味并提高酒精的香氣，通過發(fā)酵水解富含半纖維素的副產物可提高乙醇產量，應用于大規(guī)模生產[24]。

6.3 在食品及醫(yī)藥領域的應用

阿魏酸酯酶通過水解酯鍵從植物細胞壁釋放游離的阿魏酸，阿魏酸具有抗菌消炎、促進傷口愈合、抗糖尿病以及清除自由基等功效，是保護神經和治療心腦血管疾病等藥品的原料，阿魏酸還具有功能性因子等作用，可利用這一特性開發(fā)成功能性食品。阿魏酸也可作為VC和VE的載體，具有很強的親脂性，能更好地滲入角質層中[47-49]。在生產環(huán)節(jié)，阿魏酸酯酶產生的阿魏酸可作為前體合成天然香蘭素，具有無毒、無害、安全性能高等特點，值得信賴[50]。

6.4 在造紙工業(yè)中的應用

決定木漿能否生產出高品質紙張的關鍵是白度。傳統(tǒng)方法是采用除去木質素和氯化物化學漂白，這種方法所使用的化學品價格昂貴，影響水質，容易造成環(huán)境污染[5]。而利用阿魏酸酯酶的生物學方法進行漂白，此過程中不僅能增加紙張亮度，降低制漿廢水的化學需氧量值以及能耗，還能減少對環(huán)境造成的污染[51]。

6.5 在飼料工業(yè)中的應用

在飼料中濫用抗生素會損害動物免疫細胞的功能、產生耐藥性菌株、藥物殘留以及環(huán)境污染等危害，威脅著人類的健康[10]。阿魏酸酯酶有望取代部分抗生素作為飼料添加劑，促進畜禽健康生長。畜禽養(yǎng)殖業(yè)已逐步向開發(fā)安全、無公害的抗生素替代品發(fā)展[52]。此外，動物飼料的重要指標之一是纖維消化率。消化不良會造成飼料資源部分浪費，不能被機體完全吸收利用，從而抑制動物機體生長[11]。因此，在飼料中適當添加阿魏酸酯酶可達到加速降解植物細胞壁的效果，使飼料結構變得疏松，從而提高植物營養(yǎng)素的纖維消化以及動物對飼料的消化程度，促進動物機體生長，減少免疫應激[33]。

7 展望

阿魏酸酯酶具有廣泛的應用前景，目前已被應用于現代生物技術改良產阿魏酸酯酶菌株的基因中。在已有研究的基礎上，找出生產過程中各工序的關鍵點，對工藝參數進行分析、構建、優(yōu)化和創(chuàng)新，使阿魏酸在工業(yè)生產上得到充分的應用[11]。產阿魏酸酯酶菌株在生物加工、食品、醫(yī)藥、造紙、飼料等領域有巨大的應用潛力，這些應用領域需要不同類型的阿魏酸酯酶。因此，獲得適應性更廣、生產能力更強、生產應用規(guī)模更大的阿魏酸酯酶菌株是今后研究的方向和重點。目前，距離實際的工業(yè)化生產還有很長的路要走，仍然需要對其進行更深的研究。