火山石對(duì)高金屬耐受性鐵氧化菌的固定化表征

楊健，王偉東，王彥杰，晏磊

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

鐵氧化菌大多是革蘭氏陰性細(xì)菌，是一類以CO2作為碳源、嗜酸并且化能自養(yǎng)、推動(dòng)鐵循環(huán)的微生物[1-2]，能夠通過(guò)將Fe2+氧化成Fe3+獲得能量，其產(chǎn)能方程式為：2Fe2++1/2O2+2H+→2 Fe3++H2O+88.7KJ[3]。鐵氧化菌廣泛分布于礦區(qū)廢水、工業(yè)廢水、湖泊、溫泉、熱泉、火山堰塞湖等水環(huán)境中，在生物圈中無(wú)處不在。經(jīng)過(guò)研究學(xué)者分離純化，種類繁多鐵氧化菌被分離出來(lái)并獲得純培養(yǎng)菌株，其中較為常見(jiàn)的有銹鐵菌屬、纖毛鐵細(xì)菌屬、嗜酸性氧化亞鐵桿菌屬等[4]。鐵氧化菌作為重要的生物浸礦菌種，被廣泛應(yīng)用于銅，鎳，金，鈾等金屬的工業(yè)化生物浸出過(guò)程中[5-7]。在生物浸出過(guò)程中，鐵氧化菌的生物浸出能力通常會(huì)因環(huán)境條件的變化而受到影響。比如溫度的升高，pH的變化，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的減少及重金屬離子的出現(xiàn)和濃度升高等，這些浸出條件的變化不利于鐵氧化菌正常發(fā)揮其浸出功能，因此會(huì)極大降低鐵氧化菌的浸出活性和金屬回收率[8]。盡管研究表明，鐵氧化菌經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的生物浸出金屬礦石應(yīng)用后，鐵氧化菌對(duì)很多重金屬離子耐受能力逐漸提升，更加適合生物浸出金屬礦石中的金屬，具有極高的金屬浸出率[9-10]。但將鐵氧化菌用于生物浸出回收電路板中的金屬時(shí)，其應(yīng)用難度將增加。電路板與金屬礦石組成大不相同，電路板中主要有銅、鎳、鉻、鎘、鉛、金、銀等金屬，并且它們?cè)陔娐钒逯械暮科毡楦哂谠诘V石中的含量[11]，與生物浸出回收金屬礦石中的金屬相比，生物浸出回收電路板中的金屬更加依賴鐵氧化菌對(duì)多種重金屬的金屬耐受性。銅離子和鎳離子是電路板中含量較多的金屬，也是生物浸出電路板時(shí)最容易回收、最常出現(xiàn)的金屬[12]。當(dāng)銅和鎳離子含量相對(duì)于其他金屬離子含量較低時(shí)，對(duì)于鐵氧化菌的生物浸出能力的影響是極小的，對(duì)鐵氧化菌的生長(zhǎng)是低害或無(wú)害的，鐵氧化菌仍然會(huì)保持較高的亞鐵氧化活性和生物浸出能力，但是隨著生物浸出進(jìn)程的推進(jìn)，浸出液中內(nèi)銅鎳離子的含量不斷增加，就會(huì)逐漸表現(xiàn)出對(duì)鐵氧化菌細(xì)胞的毒害作用，鐵氧化菌的亞鐵氧化活性逐漸被抑制，生物浸出能力降低，鐵氧化菌的生物學(xué)活性受到影響，最終導(dǎo)致金屬回收率的降低[13]。

為此，很多研究借用固定化的方式避免金屬對(duì)鐵氧化菌的毒害。研究表明利用鐵氧化菌固定化細(xì)胞浸出電路板中金屬是可行的，并且綠色環(huán)保，節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本。作為一種常見(jiàn)的生物工程方法，固定化技術(shù)在廢水無(wú)害化處理、難降解物質(zhì)無(wú)害化處理、土壤改良等領(lǐng)域的應(yīng)用研究已取得了豐碩的成果[14]。固定化細(xì)胞有很多好處：首先固定化細(xì)胞容易制備，并且與菌種的活化和培養(yǎng)相比更加方便和實(shí)用；其次固定化細(xì)胞更加易于保存和使用，可以將固定化細(xì)胞保存在冰箱中，使用時(shí)固定化的菌種可以很快地在液體培養(yǎng)中恢復(fù)自由，能夠快速在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)繁殖。但目前固定化載體大多使用壽命有限，無(wú)法循環(huán)使用，而且價(jià)格較為昂貴。因此，一些廉價(jià)的固定化載體如紗布[15]、聚氨酯泡沫[16]、海藻酸鈉[17]小球逐漸被開(kāi)發(fā)應(yīng)用于固定化的過(guò)程中。但因固定化載體的限制仍存在對(duì)固定量少、固定時(shí)效短、固定效果差等問(wèn)題。

基于上述問(wèn)題，研究選用疏松多孔的火山石作為固定化材料，火山石相比其他固定化材料更廉價(jià)，組成結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，更容易獲得，依托黑龍江省五大連池火山群落天然地理優(yōu)勢(shì)，使得火山石發(fā)揮其獨(dú)特價(jià)值，具有極高的應(yīng)用價(jià)值[18]。在此基礎(chǔ)上選取高金屬耐受性鐵氧化菌YFS2—25，在前期試驗(yàn)中證實(shí)該菌株在10～30 mmol·L-1銅、鎳、鉻、鎘離子培養(yǎng)液中，均保持60%以上的Fe2+氧化率，因此選用該菌株作為火山石固定化菌株。同時(shí)在前期單因素研究基礎(chǔ)上，確定了影響火山石固定化鐵氧化菌效果顯著因素是火山石粒徑、固定化時(shí)間和搖床轉(zhuǎn)速。因此通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以火山石粒徑、固定化時(shí)間和搖床轉(zhuǎn)速為響應(yīng)變量，以Fe2+氧化率為響應(yīng)值，最終確定火山石固定化鐵氧化菌的最佳條件。在此基礎(chǔ)上，采用SEM表征火山石對(duì)鐵氧化菌的固定化能力。從而得到一種火山石固定高金屬耐受鐵氧化菌的固定化顆粒，為生物浸出及固定化領(lǐng)域開(kāi)發(fā)廉價(jià)可行的固定化材料和設(shè)計(jì)方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

試驗(yàn)中所用高金屬耐受性鐵氧化菌YFS2—25菌株由黑龍江省寒區(qū)環(huán)境微生物與農(nóng)業(yè)廢棄物資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鐵氧化菌菌種資源庫(kù)提供。

1.1.2 試劑

硫酸銨；三水磷酸氫二鉀；七水硫酸鎂；氯化鉀；硝酸鈣；七水硫酸亞鐵；98%硫酸；98%磷酸；二苯胺磺酸鈉；重鉻酸鉀。

1.1.3 儀器

恒溫振蕩器（HZQ-C，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）、磁力攪拌器（JB-5，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）、pH計(jì)（PHB-4，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）、高壓蒸汽滅菌鍋（MLS-3781LPC，松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社），掃描電子顯微鏡（S4800，株式會(huì)社日立制作所）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基方案

研究所使用的培養(yǎng)基配方為改良的9K培養(yǎng)基[19]，其組成為：（NH4）2SO43 g·L-1，KCl 0.1 g·L-1，K2HPO40.5 g·L-1，MgSO4x 7H2O 0.5 g·L-1，Ca（NO3）20.01 g·L-1，室溫條件下使用5 MH2SO4調(diào)節(jié)pH至2.0，高壓蒸汽滅菌后，使用0.22 μm濾膜過(guò)濾加入40 g·L-1的Fe－SO4x 7H2O。

1.2.2 火山石對(duì)高金屬耐受性鐵氧化菌固定化條件的優(yōu)化

在前期研究中，以Fe2+氧化率為目標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)探究了溫度（20、25、30、35、40℃）、火山石粒徑（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 cm）、固定化時(shí)間（12、24、36、48、60 h）、搖床轉(zhuǎn)速（40、60、80、100、120 rpm）對(duì)于固定化效果的影響。結(jié)果表明，火山石粒徑、固定化時(shí)間、搖床轉(zhuǎn)速對(duì)于固定化效果影響最為顯著。因此在前期單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面Design-Expert 12.0軟件中的Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面模型，考察固定化條件對(duì)Fe2+氧化率的影響，其中響應(yīng)變量設(shè)定為火山石粒徑（X1）、固定化時(shí)間（X2）、搖床轉(zhuǎn)速（X3），以Fe2+氧化率（Y）為響應(yīng)值，從而獲得最佳固定化條件。表1是響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Response surface test factor level table

固定化所采用的火山石采集自五大連池火山群落。固定化試驗(yàn)前，將需要使用的火山石用25%硫酸浸泡12 h，然后使用清水沖洗火山石至無(wú)雜質(zhì)，挑選50 g形態(tài)較完整的火山石滅菌后備用。

配制90 mL改良的9K培養(yǎng)基放入250 mL錐形瓶?jī)?nèi)，將火山石放入改良的9K培養(yǎng)基中，按照10%（v/v）接種培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的鐵氧化菌菌液，置于恒溫振蕩器培養(yǎng)，每組試驗(yàn)以不接菌的做空白對(duì)照，固定化試驗(yàn)完成后。將鐵氧化菌火山石固定化顆粒更換新的培養(yǎng)液培養(yǎng)100 h后，測(cè)定培養(yǎng)液中亞鐵氧化情況。每組實(shí)驗(yàn)結(jié)果跟空白作比較。Fe2+濃度的測(cè)定采用重鉻酸鉀滴定法[20]。

1.2.3 氧化亞鐵硫桿菌的固定化表征

火山石固定化效果采用SEM進(jìn)行表征，SEM（S-4800，HITACHI，日本）的工作電壓為2.0 kV，放大倍數(shù)為8.99 mm×10.0 K，采用壓片法對(duì)火山石的固定化能力進(jìn)行表征。方法如下：取樣品置于粘有導(dǎo)電膠的樣品臺(tái)上，按壓緊實(shí)，自然風(fēng)干；左低右高進(jìn)入機(jī)器；設(shè)備進(jìn)行抽真空操作，待抽真空完成后，開(kāi)啟電鏡觀察；在不同的倍數(shù)下尋找需要觀察的目標(biāo)，調(diào)節(jié)視野；找到目標(biāo)后，聚焦，拍照，對(duì)需要能譜分析的目標(biāo)進(jìn)行分析；完成后，將圖譜輸出。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

使用IBM SPSS（Version 20，IBM SPSS，Statistics 20.0）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用Origin Pro（Version 2019b.Originlab Corporation，Northampton，MA.USA）進(jìn)行繪圖，通過(guò)Design Expert 12.0（Version 12.0.3.0，1300 Godward Street Northeast，Suit 6400 Minneapolis，MN 55413）進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 火山石對(duì)高金屬耐受性鐵氧化菌固定化條件的優(yōu)化

2.1.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

采用Box-Benhnker模型對(duì)固定化條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and response values

續(xù)表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continued table 2 Box-Behnken experimental design and response values

2.1.2 模型方程的建立及方差分析

通過(guò)Design Expert 12.0軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得回歸方程：Y=Ln[（ferrous oxidation rate-1.00）/（100.00-ferrous oxidation rate）]。其方差分析見(jiàn)表3。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis table of regression model

回歸方差分析顯著性表明，此回歸模型顯著（P<0.05），C、AC、A2、C2對(duì)Y值影響也很顯著（P<0.05）。各因素對(duì)Fe2+氧化率的影響順序依次是B>A>C，即固定化時(shí)間對(duì)Fe2+氧化率的影響最大，其次是火山石粒徑，最后是搖床轉(zhuǎn)速。交互項(xiàng)AB相對(duì)其他交互項(xiàng)相對(duì)顯著，表明火山石粒徑與固定化時(shí)間存在顯著交互作用，各影響因素對(duì)Fe2+氧化率的影響為非線性關(guān)系。根據(jù)圖1可看出，模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值十分接近，線性擬合相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到95.91，R2ADJ為90.66。結(jié)果表明，該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好。

圖1 Fe2+氧化率理論值與實(shí)際值分布圖Fig.1 Distribution diagram of theoretical value and actual value of ferrous oxidation rate

2.1.3 Fe2+氧化率的單因子響應(yīng)分析

如圖2所示火山石粒徑A，固定化時(shí)間B、搖床轉(zhuǎn)速C，3個(gè)因子對(duì)Fe2+氧化率影響曲線的合成圖，將其它2個(gè)因子固定在中等水平時(shí)，每個(gè)獨(dú)立因子對(duì)響應(yīng)變化的影響。以Fe2+氧化率為縱坐標(biāo)，三因子的取值范圍為橫坐標(biāo)，并采用編碼替代三因素的實(shí)際值：-1～0～1代表火山石粒徑0.5～1.0～1.5 cm或固定化時(shí)間30～42～54 h，或者搖床轉(zhuǎn)速40～80～120 rpm，三個(gè)自變量因子的中間值即1.0，42和80。為研究其中任單一因變化時(shí)的固定取值，如研究火山石粒徑對(duì)Fe2+氧化率的影響時(shí)，固定化時(shí)間和搖床轉(zhuǎn)速分別固定為42 h和80 rpm。圖2中各單因子的擾動(dòng)對(duì)響應(yīng)值變化趨勢(shì)可看出，A和B兩個(gè)因子在區(qū)間[-1，1]內(nèi)Y值的變化是先增大后減小，A因子在1.000水平附近達(dá)到最大值；B因子在1.000水平附近達(dá)到最大值；C因子在[-1，1]內(nèi)Y值變化逐漸升高，在1.000水平附近達(dá)到最大值。

圖2 火山石粒徑（A）、固定化時(shí)間（B）、搖床轉(zhuǎn)速（C）的單因子曲線圖Fig.2 Single factor curves of particle size（a），immobilization time（b）and ratation speed（c）of volcanic rocks

2.1.4 響應(yīng)面分析

利用Design Expert 12.0軟件繪出兩兩自變量為坐標(biāo)的等高線圖，從圖3中可以看出，火山石粒徑與搖床轉(zhuǎn)速的響應(yīng)曲面近似橢圓形，證明火山石粒徑與搖床轉(zhuǎn)速對(duì)Fe2+氧化率的交互作用相對(duì)于其他因素相對(duì)較強(qiáng)，而火山石粒徑與固定化時(shí)間以及搖床轉(zhuǎn)速和固定化時(shí)間的等高線圖則顯示其交互作用并不明顯。通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，確定火山石固定化鐵氧化菌YFS2—25的最佳條件為：火山石粒徑1.5 cm，固定化時(shí)間42 h，搖床轉(zhuǎn)速為120 rpm。通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果與模型結(jié)果非常接近，證實(shí)所得模型是可行的。

圖3 火山石粒徑、固定化時(shí)間、搖床轉(zhuǎn)速對(duì)Fe2+氧化率影響的等高線圖（a～c）Fig.3 Contour map（a～c）of effects of particle size，immobilization time and rotation speed of shaking size on ferrous oxidation rate

2.1.5驗(yàn)證試驗(yàn)

為進(jìn)一步驗(yàn)證該模型的準(zhǔn)確性和有效性，根據(jù)最優(yōu)條件進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果得到的Fe2+氧化率分別為97.02、96.62和96.52，平均Fe2+氧化率為96.72±0.14，與預(yù)測(cè)的Fe2+氧化率96.58無(wú)顯著差異，表明該模型較準(zhǔn)確。

2.2 SEM表征高金屬耐受性鐵氧化菌的火山石固定化

基于響應(yīng)面試驗(yàn)的最優(yōu)固定化條件，以鐵氧化菌YFS2-25為固定化菌株，火山石為固定化載體進(jìn)行高金屬耐受性鐵氧化菌的火山石固定化試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，由圖4a、e可以觀察到未固定的火山石表面有孔隙，固定之后，細(xì)菌附著在火山石表面，細(xì)菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物等在火山石表面形成生物膜，火山石表面變得光滑；從圖4b、f中可以看出大量的鐵氧化菌附著在火山石的表面，并且數(shù)量極多；隨著顯微鏡放大倍數(shù)的增加，從圖4c、g可見(jiàn)越來(lái)越多的鐵氧化菌吸附在火山石表面，火山石的孔洞、裂隙中也存在著大量的鐵氧化菌；從圖4e、h中可以觀察到固定化鐵氧化菌后，火山石表面由原來(lái)的覆蓋有密集的球狀突起變?yōu)楦采w著一層致密的鐵氧化菌，鐵氧化菌包裹著這些密集的球狀凸起，并且連接成片，形成一個(gè)內(nèi)陷的小孔。由此可見(jiàn)，火山石作為高耐受性鐵氧化菌的固定化載體是可行的。

圖4 掃描電鏡下的火山石表面（a，b，c，d：固定化前；e，f，g，h：固定化后）Fig.4 Surface of volcanic rocks under SEM（a，b，c，d：before immobilization；e，f，g，h：after immobilization）

3 討論

目前由于鐵氧化菌能夠?qū)嗚F離子氧化成三價(jià)鐵離子的特性，將鐵氧化菌廣泛應(yīng)用于生物浸出中，結(jié)合多種固定化載體，使其更加適用于生物浸出當(dāng)中，使鐵氧化菌在尾礦治理、生物冶金等領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用價(jià)值[21]。但是，固定化載體的材料大多存在造價(jià)昂貴，攜帶菌體量少，材料毒性大，不適于鐵氧化菌生長(zhǎng)等問(wèn)題。導(dǎo)致載體成為了鐵氧化菌固定化細(xì)胞應(yīng)用于生物浸出的關(guān)鍵因素。研究主要以實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的高金屬耐受性鐵氧化菌YFS2-25為固定化菌株出發(fā)，采用響應(yīng)面分析法對(duì)火山石固定化高金屬耐受性鐵氧化菌的條件進(jìn)行優(yōu)化，選擇Box-Behnken設(shè)計(jì)以火山石粒徑、固定化時(shí)間和搖床轉(zhuǎn)速為響應(yīng)因素，以Fe2+氧化率為響應(yīng)值，得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件，火山石粒徑1.5 cm、固定化時(shí)間42 h和搖床轉(zhuǎn)速為120 rpm。同時(shí)通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，證明在該條件下，可以得到最高的Fe2+氧化率。

以SEM表征火山石固定化鐵氧化菌的能力，正如結(jié)果所示，火山石在與鐵氧化菌共培養(yǎng)后，在SEM下觀察到火山石表明有明顯的菌落痕跡。在SEM下，火山石表面出現(xiàn)鐵氧化菌的堆積，又因?yàn)榛鹕绞氖杷啥嗫捉Y(jié)構(gòu)，因此火山石相比其他固定式載體，可固定攜帶更多對(duì)的微生物細(xì)胞。細(xì)胞固定化后，利用培養(yǎng)液對(duì)固定化細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，雖然生長(zhǎng)比較緩慢，但在試驗(yàn)周期內(nèi)，一直處于不斷的生長(zhǎng)階段，表明固定化細(xì)胞具有較長(zhǎng)的生長(zhǎng)周期，這對(duì)于構(gòu)建生物反應(yīng)器，從中獲取有價(jià)值的活性物質(zhì)是十分有利的。

迄今為止，大多數(shù)固定化細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用還處于實(shí)驗(yàn)室研究水平，工業(yè)化的投入發(fā)展離不開(kāi)高效固定化生物反應(yīng)器的研制，同時(shí)部分常用的固定化細(xì)胞載體對(duì)細(xì)胞酶活存在著一定的毒性，聚丙烯酰胺、明膠等常用固定化材料也依然存在價(jià)格較高的問(wèn)題。因此，開(kāi)發(fā)新型高效、無(wú)毒、廉價(jià)的固定化材料仍是目前固定化細(xì)胞技術(shù)發(fā)展的主要方向。相信在材料學(xué)及生物學(xué)高速發(fā)展的當(dāng)今，固定化技術(shù)能夠得到不斷創(chuàng)新，并應(yīng)用于更多大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域。

4 結(jié)論

以高金屬耐受性鐵氧化菌為固定化菌株，以Fe2+氧化率為衡量指標(biāo)，通過(guò)利用火山石做為固定化載體對(duì)鐵氧化菌進(jìn)行固定化，用響應(yīng)面軟件對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得出最優(yōu)固定化條件：在最佳固定化條件山石粒徑1.5 cm、固定化時(shí)間42 h和搖床轉(zhuǎn)速為120 rpm下，可以得到最高的Fe2+氧化率。在此基礎(chǔ)上，以火山石作為固定化載體固定化高金屬耐受性的鐵氧化菌取得了極好的固定化效果，火山石作為固定化載體將成為生物浸出的極大助力，不僅可以降低成本，同時(shí)組成穩(wěn)定，攜帶鐵氧化菌數(shù)量多，相比常見(jiàn)的固定化載體，火山石做為固定化載體的實(shí)用性更強(qiáng)，固定化能力更好。