添加不同生物益生菌對(duì)木薯塊根青貯品質(zhì)和微生物菌群多樣性的影響

潘佳慧，喻 珊，蔡 杰，李開(kāi)綿，歐文軍，王志勇

（1. 熱帶特色林木花卉遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 海南大學(xué)林學(xué)院 熱帶作物學(xué)院，海南 ?？?570228；2. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 ?？?571101）

木薯(Manihot esculenta)為大戟科木薯屬植物，其塊根富含淀粉且產(chǎn)量較高、價(jià)格低廉，可代替玉米(Zea mays)等能量飼料，在我國(guó)南方可作為地源性飼料進(jìn)行綜合利用[1]。但鮮木薯塊不易保存且含有有害物質(zhì)氫氰酸，不能直接供動(dòng)物大量采食。青貯作為一種不消耗能量且能最大限度保存飼料營(yíng)養(yǎng)的一種低成本處理方法，能夠有效去除氫氰酸[2-3]，同時(shí)青貯可以分解大分子蛋白質(zhì)及難消化的纖維類物質(zhì)，提高消化利用率，改善飼料適口性并延長(zhǎng)保存時(shí)間[4-5]，而添加優(yōu)良的菌種則是提高青貯品質(zhì)和縮短青貯時(shí)間的關(guān)鍵[6-7]。

微生物在青貯過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，其菌群群落構(gòu)成及豐度變化直接影響到青貯品質(zhì)，同時(shí)青貯品質(zhì)也受到添加菌劑類型、環(huán)境條件等因素的影響[8-9]。因此，研究添加生物益生菌對(duì)木薯塊根青貯后微生物多樣性的影響具有重要意義。目前有關(guān)木薯青貯的研究主要集中在木薯莖葉[10-12]、木薯渣[13-15]等木薯副產(chǎn)物的加工利用，缺乏對(duì)木薯塊根青貯后的微生物變化及其對(duì)青貯品質(zhì)的影響和二者間相關(guān)性的分析。市場(chǎng)上微生物菌種及酶發(fā)酵劑產(chǎn)品豐富多樣，但針對(duì)南方地區(qū)專用的木薯青貯生物益生菌菌劑種類較少。

因此，本研究以鮮木薯塊根為青貯原料，通過(guò)添加不同生物益生菌產(chǎn)品和直接青貯的比較試驗(yàn)，利用常規(guī)營(yíng)養(yǎng)分析方法和二代測(cè)序法，對(duì)木薯塊根青貯后的青貯品質(zhì)和微生物菌群結(jié)構(gòu)及二者間相關(guān)性進(jìn)行分析，篩選適合南方地區(qū)鮮木薯塊根青貯的添加菌劑以獲得高品質(zhì)木薯青貯飼料，為我國(guó)南方地區(qū)的無(wú)抗飼料生產(chǎn)、健康養(yǎng)殖及木薯綜合利用提供實(shí)踐應(yīng)用和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)品種選用華南9 號(hào)木薯(SC9)，2019 年3 月20 日在海南省文昌縣田尾基地(110°75′ E，19°61′ N)，將長(zhǎng)10 cm 左右的木薯種莖下端呈45°～65°斜插種植于壟中5～7 cm，株行距1.0 m × 1.0 m，采取常規(guī)田間管理。于2020 年10 月9 日收獲木薯塊根。將木薯塊根(帶皮)清洗干凈后，用粉碎機(jī)(195 汽油機(jī)動(dòng)力)粉碎為1 cm 左右的小塊，供青貯后分析使用。青貯材料干物質(zhì)(dry matter，DM)含量為31.26%，可溶性糖(water soluble carbohydrates，WSC)含量為25.51%，粗蛋白(crude protein，CP)含量為2.33%，中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)含量為14.73%，酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)含量為5.38%。

添加的生物益生菌分別為微生物發(fā)酵菌劑(芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌，濰坊生益生物公司)、高效復(fù)合菌酶制劑(芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌、酶，中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所)和生物飼料發(fā)酵劑(芽孢桿菌、乳酸桿菌、酵母菌，海南盛旭生物科技有限公司)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)以新鮮木薯塊根單獨(dú)青貯作為對(duì)照(CK)，試驗(yàn)組分別添加微生物發(fā)酵菌劑(C1)、高效復(fù)合菌酶制劑(C2)和生物飼料發(fā)酵劑(C3)共4 個(gè)處理，每個(gè)處理組3 個(gè)重復(fù)。嚴(yán)格按照各生物益生菌菌劑的使用方法在樣品中加入菌劑，C1在鮮樣中的添加量為5 g·kg?1，C2為 1 g·kg?1，C3為 2 g·kg?1，以10 mL·kg?1蒸餾水溶解，CK 組添加等量的蒸餾水。

1.3 青貯飼料制作

以粉碎后1 cm 左右的木薯塊根為原料，按處理分組添加不同菌劑后充分混勻，裝入30 cm × 20 cm的聚乙烯青貯袋中，每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每袋300 g，用真空打包機(jī)抽真空后密封。在室溫 (27 ± 3) ℃條件下遮光貯藏。于青貯第30 天后開(kāi)封進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、發(fā)酵品質(zhì)及微生物多樣性的測(cè)定。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 青貯飼料營(yíng)養(yǎng)成分及發(fā)酵品質(zhì)的測(cè)定

青貯30 d 后的木薯塊根開(kāi)袋取樣，65 ℃烘干48 h，粉碎過(guò)0.425 mm 篩，然后進(jìn)行各指標(biāo)測(cè)定。干物質(zhì)采用烘干法測(cè)定[16]；粗蛋白采用凱氏定氮法(海能k1100 全自動(dòng)凱氏定氮儀)測(cè)定[17]；可溶性糖采用蒽酮-硫酸法測(cè)定[18]；中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維采用改進(jìn)后的濾袋分析法用纖維分析儀(SonnenF10 型自動(dòng)纖維儀)進(jìn)行測(cè)定[19]。

開(kāi)袋后，將發(fā)酵飼料混勻，稱取20 g 樣品放入250 mL 三角瓶中，加入70 mL 蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?，? ℃恒溫冰箱中浸泡 24 h 搖勻后依次用4 層紗布和中速定量濾紙過(guò)濾，所得浸提液用pH 計(jì)測(cè)定發(fā)酵飼料的pH[20]；氨態(tài)氮(ammonia nitrogen, AN)采用苯酚-次氯酸鈉比色法測(cè)定[21]，并計(jì)算氨態(tài)氮占總氮的比例(ammonia nitrogen/total nitrogen, AN/TN)；有機(jī)酸采用液相色譜分析儀測(cè)定[22]，浸提液先后抽濾到10 mL 離心管并使用0.22 μm 尼龍有機(jī)濾膜過(guò)濾，用島津LC-20A 液相色譜儀加載Venusil XBP C18 柱(250 mm × 4.6 mm)進(jìn)行二元梯度洗脫，在15%甲醇與85% NaH2PO4·H2O (pH 2.65，0.1 mol·L?1)中，總流速1 mL·min?1，單次25 min，柱溫30 ℃，波長(zhǎng)210 nm 下測(cè)定乳酸(lactic acid, LA)、乙酸(acetic acid, AA)、丙酸(propionic acid, PA)和丁酸(butyric acid, BA)。

1.4.2 微生物多樣性分析

二代測(cè)序每組青貯樣本按青貯袋充分混合，取3 個(gè)重復(fù)樣品，使用 E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit 的試劑盒(OMEGA，美國(guó))提取樣品的總DNA，利用前引物341F (ATGCGTAGCCGACCTGAGA)與后引物805R (CGTCAGACTTTCGTCCATTGC)獲取細(xì)菌 Ⅴ3～Ⅴ4 高變異區(qū)16S rRNA 基因。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化利用Qubit3.0 DNA 檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA 精確定量，采用Illumina 公司的Tru Seq TM DNA Sample PrepKit 制備測(cè)序文庫(kù)。使用MiSeq測(cè)序儀進(jìn)行2 × 300 bp 的雙端測(cè)序并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。Illumina HiSeq 測(cè)序和結(jié)果分析測(cè)序及序列物種信息由生工生物工程(上海)股份有限公司協(xié)助完成。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2013 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析，用SPSS軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析及營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)指標(biāo)的顯著性檢驗(yàn)，用Duncan 法對(duì)平均值進(jìn)行多重比較(P< 0.05)。將各處理組干物質(zhì)、可溶性糖、粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、pH、乳酸、乙酸、氨態(tài)氮/全氮共9 個(gè)指標(biāo)采用模糊數(shù)學(xué)的隸屬函數(shù)理論[23]，對(duì)其青貯品質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

式中：xi為當(dāng)前指標(biāo)測(cè)定值，xmax和xmin為指標(biāo)最大值和最小值；其中中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、pH 和氨態(tài)氮/全氮為反隸屬函數(shù)，其他均為正隸屬函數(shù)。隸屬函數(shù)均值越大，說(shuō)明其品質(zhì)越好。

二代測(cè)序得到的PE reads 首先根據(jù)overlap 關(guān)系進(jìn)行拼接，區(qū)分樣本后對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾，然后進(jìn)行OTU 聚類(ASV 去噪)分析和物種分類學(xué)分析?；贠TU 聚類(ASV 去噪)分析結(jié)果，用Usearch、QIIME 以及 Mothur 等軟件進(jìn)行深入的統(tǒng)計(jì)學(xué)和可視化生物信息學(xué)分析，利用R 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加不同生物益生菌對(duì)木薯塊根青貯營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)的影響

與CK 組相比，添加菌劑后3 組的干物質(zhì)均顯著提高(P< 0.05) (表1)，但3 組間無(wú)顯著差異(P>0.05)；添加菌劑后3 組處理可溶性糖含量與CK 組差異均不顯著，但C2和C3組顯著高于C1組；C2組粗蛋白顯著低于CK 組；中性洗滌纖維各組間差異均不顯著；C1和C3組酸性洗滌纖維顯著低于CK組，且兩組間無(wú)顯著差異。

表1 添加不同生物益生菌對(duì)木薯塊根青貯營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)的影響Table 1 Effect of adding different biological probiotics on the nutrient composition and fermentation quality of cassava root silage

所有組的pH 均低于4.2，其中C3組顯著低于CK 組(P< 0.05)，C2顯著高于CK 組；添加菌劑的3 組處理乳酸均顯著高于CK 組，其中C1組最高，且C1組乙酸顯著高于CK 組；乳酸/乙酸各組間無(wú)顯著差異；所有組均檢測(cè)到少量丙酸且組間無(wú)顯著差異(P> 0.05)；各組均未檢測(cè)到丁酸。所有組氨態(tài)氮/總氮均小于10%，其中C2組顯著高于其余各組。

添加不同生物益生菌后，隸屬函數(shù)平均值結(jié)果(表2)顯示，C3理組的綜合表現(xiàn)最優(yōu)，平均值為0.79，C1組表現(xiàn)較優(yōu)，平均值為0.70，C2組隸屬函數(shù)值最低，低于CK 組。

表2 添加不同生物益生菌木薯塊根青貯品質(zhì)的隸屬函數(shù)值Table 2 Affiliation function values of cassava tuber silage quality under different bio-probiotic treatments

2.2 添加不同菌劑對(duì)木薯塊根青貯微生物多樣性的影響

2.2.1 木薯塊根青貯細(xì)菌OTUs 基礎(chǔ)分析

由木薯塊根青貯細(xì)菌OTUs 基礎(chǔ)分析(圖1)可知，4 個(gè)處理組共獲得174 個(gè)OTUs，其中共有的OTUs為146 個(gè)，CK 組和C1組獨(dú)有的均為2 個(gè)，C2和C3組均沒(méi)有獨(dú)有的，CK、C1、C2和C3組的OTUs 數(shù)目分別為165、163、164 和165 個(gè)。說(shuō)明4 組處理間物種分布差異不顯著(P> 0.05)。

圖1 木薯塊根青貯物種分布韋恩圖Figure 1 Venn diagram of cassava root tuber silage species distribution

2.2.2 Alpha 多樣性分析

木薯塊根青貯開(kāi)封后的微生物Alpha 多樣性指數(shù)(表3)表明，測(cè)序樣本序列數(shù)量較大，且各處理組的覆蓋度均大于0.99，說(shuō)明基本覆蓋了樣本中所有微生物的核心組成；相較于CK 組，各添加菌劑組的Chao 指數(shù)和Ace 指數(shù)均有所降低，表明菌群的豐度降低；Shannon 指數(shù)的降低和Simpson 指數(shù)的增高說(shuō)明生物菌群多樣性降低，其中C3最低；Shannoneven指數(shù)的降低說(shuō)明菌群分配的均勻程度降低。綜上可知，添加生物益生菌可以影響木薯塊根青貯飼料中微生物群落的多樣性。

表3 不同樣本的Alpha 多樣性指數(shù)Table 3 Alpha diversity analysis of different samples

2.2.3 木薯塊根青貯后基于門水平的微生物群落結(jié)構(gòu)

根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每個(gè)樣品在門分類水平上豐度大于1%的菌種，分析各青貯樣品在門分類水平上相對(duì)豐度較高的物種及其比例(表4)。基于門水平的木薯塊根青貯微生物群落結(jié)構(gòu)表明，各處理組的優(yōu)勢(shì)菌門均為厚壁菌門和變形菌門，這兩個(gè)在青貯中占主導(dǎo)作用的菌門均占菌群分類的95%以上。除此之外，藍(lán)藻細(xì)菌門、未分類細(xì)菌及其他細(xì)菌有少量存在。C1、C2和C3組厚壁菌門的相對(duì)豐度相較于CK 組(76.76%)均顯著增加(P< 0.05)，分別達(dá)到81.20%、79.59%和82.30%，同時(shí)變形菌門的相對(duì)豐度相較于CK 組(19.12%)分別降低至17.04%、18.63%和15.58%，其中C3組顯著降低，且藍(lán)藻細(xì)菌門、未分類細(xì)菌和其他細(xì)菌豐度均顯著降低。這說(shuō)明添加菌劑可提高木薯塊根青貯飼料中厚壁菌門所占比例，降低變形菌門所占比例，減少其他細(xì)菌產(chǎn)生。

表4 基于門水平的木薯塊根青貯微生物群落結(jié)構(gòu)比例Table 4 Microbial community structure of cassava tuber silage based on phylum level

2.2.4 木薯塊根青貯后基于屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)

根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每個(gè)樣品在屬分類水平上豐度大于1%的菌種，分析各青貯樣品在屬分類水平上相對(duì)豐度較高的物種及其比例(表5)?；陂T水平的木薯塊根青貯微生物群落結(jié)構(gòu)表明，4 個(gè)處理組的優(yōu)勢(shì)菌屬均為乳桿菌屬、乳球菌屬、未分類屬腸桿菌和沙雷菌屬。其中CK 組的4 種菌屬相對(duì)豐度分別為56.28%、14.10%、10.85%和6.93%；相較于CK 組，各處理組有益菌屬表現(xiàn)為乳桿菌屬和乳球菌屬有所增高，其中C1、C3組乳桿菌屬相對(duì)豐度顯著增高至60.19%、59.33% (P< 0.05)；C2、C3組乳球菌屬的相對(duì)豐度顯著增高，分別為16.30%和16.86%；C1組腸球菌屬顯著降低；鏈球菌屬、明串珠菌屬相對(duì)豐度各添加菌劑組組均顯著降低；魏斯氏菌屬相對(duì)豐度各間均無(wú)顯著差異(P> 0.05)。各處理組有害菌屬和雜菌表現(xiàn)為：與CK 相比，C3未分類屬腸桿菌顯著降低，為9.42%；C1、C2和C3組沙雷菌屬相對(duì)豐度均顯著降低，分別為5.45%、6.04%和5.09%；未分類細(xì)菌相對(duì)豐度均顯著降低；不動(dòng)桿菌屬、未分類乳酸桿菌屬和其他菌屬相對(duì)豐度較CK組無(wú)顯著差異。

表5 基于屬水平的木薯塊根青貯微生物群落結(jié)構(gòu)比例Table 5 Microbial community structure of cassava tuber silage based on genus level

2.2.5 微生物多樣性與環(huán)境相關(guān)性

利用Spearman 相關(guān)系數(shù)研究青貯木薯塊根細(xì)菌菌群相對(duì)豐度與pH、發(fā)酵代謝產(chǎn)物之間的相關(guān)性，得到兩兩之間的相關(guān)性系數(shù)和顯著性?；陂T水平青貯品質(zhì)指標(biāo)與細(xì)菌菌群相關(guān)性分析熱圖(圖2)表明，厚壁菌門與LA、AA 顯著正相關(guān)(P< 0.05)，與pH、ADF 顯著負(fù)相關(guān)(P< 0.05)；變形菌門與pH、ADF 顯著正相關(guān)(P< 0.05)，與LA 顯著負(fù)相關(guān) (P<0.05)；藍(lán)藻細(xì)菌門與CP 極顯著正相關(guān)(P< 0.01)。

圖2 基于門水平青貯品質(zhì)指標(biāo)與細(xì)菌菌群相關(guān)性分析熱圖Figure 2 Heat map of correlation analysis between silage quality indicators and bacterial flora based on phylum level

基于屬水平青貯品質(zhì)指標(biāo)與細(xì)菌菌群相關(guān)性分析熱圖(圖3)表明，乳桿菌屬與ADF 極顯著負(fù)相關(guān)(P< 0.01)；乳球菌屬與環(huán)境因子相關(guān)性不顯著(P>0.05)；沙雷菌屬與pH 顯著正相關(guān)(P< 0.05)，與ADF極顯著正相關(guān)(P< 0.01)，與LA 極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；鏈球菌屬與CP 極顯著正相關(guān)(P< 0.01)，與DM 顯著負(fù)相關(guān)(P< 0.05)，明串珠菌屬與CP 顯著正相關(guān)(P< 0.05)，與DM 顯著負(fù)相關(guān)(P< 0.05)；魏斯氏菌屬與LA 極顯著正相關(guān)(P< 0.01)，與AA 顯著正相關(guān)(P< 0.05)；腸球菌屬與DM 顯著負(fù)相關(guān)(P< 0.05)；不動(dòng)桿菌屬與ADF 顯著正相關(guān)(P< 0.05)，與DM 顯著負(fù)相關(guān)(P< 0.05)。

圖3 基于屬水平青貯品質(zhì)指標(biāo)與細(xì)菌菌群相關(guān)性分析熱圖Figure 3 Heat map of correlation analysis between silage quality indicators and bacterial flora based on genus level

3 討論與結(jié)論

3.1 添加不同菌劑對(duì)木薯塊根青貯營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)的影響

本研究結(jié)果顯示，添加菌劑對(duì)木薯塊根的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和發(fā)酵效果有著不同程度的影響。與CK 組相比，添加菌劑后3 個(gè)處理組的干物質(zhì)均顯著提高(P<0.05)，可能是可溶性糖含量較高情況下，添加菌劑加速乳酸產(chǎn)生，減少了有害微生物的含量，從而減少了干物質(zhì)的損失[24]；中性洗滌纖維和可溶性糖含量差異均不顯著(P> 0.05)，與陸永祥等結(jié)果相似[25]；C1和C3組酸性洗滌纖維顯著低于CK 組(P< 0.05)，可能是由于較低pH 構(gòu)成的酸性環(huán)境促進(jìn)了細(xì)胞壁成分的酸解作用[26]；粗蛋白的降解會(huì)影響飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，C2組粗蛋白含量顯著低于CK 組(P< 0.05)，可能存在某些降解蛋白的菌促進(jìn)蛋白的分解[27]。

pH、有機(jī)酸是衡量青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的重要指標(biāo)，品質(zhì)優(yōu)良的青貯飼料的pH 在4.2 以下[28]。本研究4 個(gè)處理組的pH 均在3.6 左右，發(fā)酵效果極好，主要是由于木薯本身干物質(zhì)、可溶性糖含量較高，添加菌劑后為發(fā)酵提供了更多底物，使其迅速發(fā)酵產(chǎn)生乳酸降低pH，這與Zhang 等[29]在濕玉米麩皮和玉米秸稈混合飼料中加入乳酸菌菌劑后pH 比不添加任何菌劑的對(duì)照組更低的研究結(jié)果一致。添加生物益生菌處理組的乳酸相較于CK 組均顯著提高(P< 0.05)，其中C1組乙酸的含量顯著高與CK 組(P<0.05)，可能是添加的菌劑主成分均為乳酸菌菌種，提高了產(chǎn)乳酸能力，與王丹丹[30]在玉米(Zea mays)中加入微生物添加劑后乳酸和乙酸有顯著增高的研究一致。丁酸是蛋白質(zhì)和乳酸被腐敗菌分解所產(chǎn)生，本研究中各組均未檢測(cè)出丁酸，只檢測(cè)到少量丙酸，說(shuō)明飼料發(fā)酵品質(zhì)較高[31]。乳酸/乙酸始終高于3，說(shuō)明木薯塊根青貯發(fā)酵過(guò)程主要以同型乳酸發(fā)酵為主。本研究中各組氨態(tài)氮/總氮均小于10%，達(dá)到優(yōu)質(zhì)青貯飼料標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明氨基酸和蛋白質(zhì)分解較少[32]，而C2組的氨態(tài)氮/總氮顯著高于CK 組(P<0.05)，這主要是由于C2組pH 較CK 組高，導(dǎo)致一些以蛋白質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)的有害微生物增殖，產(chǎn)生相對(duì)較多的氨態(tài)氮。

本研究中的4 個(gè)處理組青貯品質(zhì)均達(dá)到優(yōu)質(zhì)青貯飼料標(biāo)準(zhǔn)，但添加菌劑增加干物質(zhì)和可溶性糖等發(fā)酵底物含量和產(chǎn)酸能力，并降低酸性洗滌纖維等不易被動(dòng)物吸收的物質(zhì)含量。將各項(xiàng)營(yíng)養(yǎng)和發(fā)酵指標(biāo)通過(guò)模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法進(jìn)行綜合分析，各指標(biāo)平均隸屬函數(shù)值越高則代表青貯品質(zhì)越好，對(duì)比可以看出C3組的綜合表現(xiàn)最優(yōu)，其次為C1組，C2組則排在最后，所以在不同生物益生菌處理中的木薯塊根青貯品質(zhì)為C3> C1> C2。

3.2 添加不同菌劑對(duì)木薯塊根青貯微生物多樣性的影響

復(fù)雜的微生物在青貯過(guò)程中存在共生且有著相互作用的關(guān)系，微生物多樣性也與青貯品質(zhì)有著一定的相關(guān)性[8]。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)添加不同生物益生菌菌劑的木薯塊根青貯后微生物菌群群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，從豐度、結(jié)構(gòu)等定義微生物的多樣性。從木薯塊根青貯細(xì)菌OTUs 基礎(chǔ)分析結(jié)果來(lái)看，添加生物益生菌菌劑對(duì)物種分布差異影響不大；但由Alpha 多樣性分析結(jié)果顯示，木薯塊根青貯后微生物的多樣性有一定的影響，相較于CK 組，菌群的豐度、多樣性和分配的均勻程度均降低，這種變化可能是受群落里優(yōu)勢(shì)菌屬的影響，有研究表明優(yōu)勢(shì)菌屬越豐富，細(xì)菌群落的多樣性越少[33]，Wang 等[34]在辣木(Moringa oleifera)乳酸菌接種青貯飼料中發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌的高豐度導(dǎo)致細(xì)菌多樣性低與本研究結(jié)果相似。上述結(jié)果說(shuō)明添加生物益生菌菌劑會(huì)影響木薯塊根青貯飼料微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性。

根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果在門水平上分析核心菌群，4 個(gè)木薯塊根青貯處理組在菌群組成上并無(wú)明顯差異，各組的優(yōu)勢(shì)菌門均為厚壁菌門和變形菌門。其中厚壁菌門與LA、AA 含量顯著正相關(guān)(P<0.05)，與pH、ADF 顯著負(fù)相關(guān)(P< 0.05)，是因?yàn)楹癖诰T中多是參與乳酸發(fā)酵的菌群，其豐度增加提高了產(chǎn)酸能力導(dǎo)致pH 降低，并對(duì)酸性洗滌纖維進(jìn)行進(jìn)一步分解，從而提高發(fā)酵品質(zhì)[35]；本研究中各添加菌劑組的厚壁菌門相對(duì)豐度相較于CK 組均顯著提高(P< 0.05)，其中C3組的相對(duì)豐度最高，其次是C1、C2組。變形菌門與pH、ADF 顯著正相關(guān)(P<0.05)，與LA 顯著負(fù)相關(guān)(P< 0.05)，是由于變形菌門部分菌屬能進(jìn)行脫氨反應(yīng)生成氨，使pH 的降低減緩的同時(shí)可與乳酸菌競(jìng)爭(zhēng)可溶性糖的利用，對(duì)酸性洗滌纖維的分解和乳酸的產(chǎn)生起到不利的影響，這與閆晶等[36]發(fā)現(xiàn)變形菌門與pH 呈正相關(guān)關(guān)系的研究結(jié)果相同；本研究中添加菌劑后變形菌門相對(duì)豐度均降低，其中C3相對(duì)豐度顯著降低，其次是C1、C2組。添加益生菌后藍(lán)藻細(xì)菌門和其他菌均顯著降低，且藍(lán)藻細(xì)菌門與CP 極顯著正相關(guān)(P< 0.05)，說(shuō)明處理組CP 含量降低可能與此菌門豐度降低有一定關(guān)聯(lián)。綜上，添加生物益生菌能增加厚壁菌門所占比例，減少變形菌門和其他菌類占比，與王麗學(xué)等[37]在苜蓿(Medicago sativa)中添加乳酸菌改善細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果基本一致。

在屬水平上分析核心菌群，各處理組的優(yōu)勢(shì)菌屬均為乳桿菌屬、乳球菌屬，其次為未分類腸桿菌屬和沙雷菌屬。乳桿菌屬是青貯發(fā)酵的主要菌屬，在pH 較低環(huán)境下可以正常生長(zhǎng)，是導(dǎo)致本研究中厚壁菌門微生物含量多的直接原因[38]，乳球菌屬占比相對(duì)較少則是因?yàn)椴蝗缛闂U菌屬耐酸[39]；魏斯氏菌屬為異型發(fā)酵乳酸菌，有較強(qiáng)耐酸堿性，與LA、AA 有正相關(guān)關(guān)系[40]；鏈球菌屬和明串珠菌相對(duì)豐度在接種生物益生菌后顯著減少(P< 0.05)，可能是因?yàn)樯镆嫔奶砑訉?dǎo)致發(fā)酵環(huán)境中的酸堿度快速下降，從而降低了這類不耐酸菌屬的豐度，這與Yang 等[41]發(fā)現(xiàn)低pH 是酸性環(huán)境中微生物多樣性有限的主要因素和Wang 等[42]在辣木中接種乳酸菌后乳酸桿菌增強(qiáng)，腸桿菌、腸球菌和豌豆球菌的相對(duì)豐度則降低等研究結(jié)果相似。且CP 含量與其存在正相關(guān)關(guān)系，DM 與其存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，所以C2組的CP 含量降低和3 個(gè)處理組的DM 含量增高可能與其豐度降低有關(guān)；沙雷菌屬及其主要發(fā)酵產(chǎn)物與酸化環(huán)境有關(guān)，或至少在這種條件下維持[43]，其與pH 和ADF 正相關(guān)，與LA 負(fù)相關(guān)，是因?yàn)樯忱拙鷮?、未分類腸桿菌屬和不動(dòng)桿等菌屬等為變形菌門下菌屬。正是由于發(fā)酵過(guò)程中乳桿菌屬、乳球菌屬、魏斯氏菌屬、明串珠菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬等有益乳酸菌群占據(jù)優(yōu)勢(shì)主導(dǎo)地位，生成一定量的乳酸使pH 快速下降，才使得上述腐敗菌被有效抑制，從而更好地保證飼料的發(fā)酵品質(zhì)。綜上，添加生物益生菌菌劑后乳桿菌屬、乳球菌屬豐度增高，未分類腸桿菌、沙雷菌屬豐度的降低，可以說(shuō)明木薯塊根青貯中添加生物益生菌菌劑可以增強(qiáng)產(chǎn)酸能力強(qiáng)的乳酸菌菌種的豐度，且抑制有害菌群的繁殖，從而提高發(fā)酵飼料品質(zhì)。

綜上，添加生物益生菌菌劑對(duì)木薯塊根青貯的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和發(fā)酵品質(zhì)有不同程度的改善，從菌群結(jié)構(gòu)看，添加菌劑能提高木薯塊根青貯飼料中厚壁菌門下乳酸菌菌種的豐度，降低變形菌門下沙雷菌屬和不動(dòng)桿菌屬等菌屬的豐度，減少雜菌產(chǎn)生，且菌群結(jié)構(gòu)的改變與青貯品質(zhì)指標(biāo)有一定相關(guān)性。其中，厚壁菌門菌群豐度為C3> C1> C2，變形菌門菌群豐度為C3< C1< C2，其各菌門下各菌屬菌群豐度與此趨勢(shì)相同。所以綜合各項(xiàng)指標(biāo)及微生物群落結(jié)構(gòu)的分析判斷，木薯塊根 青貯效果表現(xiàn)為C3> C1> C2。