苜?；ㄈ~病毒和白三葉草花葉病毒復合侵染對本氏煙中5 種激素含量的影響

岳 陽，梁巧蘭，魏列新，何 輝，孟秀鵬，姜玉玲，藺 珂，陳應娥

（甘肅農業(yè)大學植物保護學院 / 甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070）

植物激素(plant hormone)是植物自身代謝產生的、在極低濃度下可對植物的生命活動起調控作用的有機物質，水楊酸(salicylic acid, SA)、獨腳金內酯(strigolactone, SLs)和油菜素內酯(brassinolide, BR)均可促進植物的光合作用、提高葉綠素含量、維持植物的直立與葉片形態(tài)、促進植物生長和分蘗[1-7]；而茉莉酸(jasmonic acid, JA)通過調控乙烯(ethylene,ETH)含量變化調節(jié)植物生長和葉片脫落、誘導卷須卷曲、促進氣孔關閉[8]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)生物脅迫和非生物脅迫均會引起植物體內激素的變化[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，玉米褪綠斑駁病毒(maize chlorotic mottle virus, MCMV)侵染玉米(Zea mays)后會導致寄主新葉縮小，老葉皺縮萎蔫，誘導SA、JA、SLs 和BR 積累[9-10]。其中SA 作為信號分子，可提高植株體內可溶性糖、蛋白和游離脯氨酸等滲透調節(jié)物質的含量以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化物酶(peroxide, POD)和過氧化氫酶(catalase, CAT) 3 種抗氧化酶活性，保護葉綠體，提高氣孔導度和降低丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量[3]；而JA 會誘導蛋白酶抑制劑、苯丙氨酸轉氨酶等與抗性有關的基因表達以提高植物抗逆性[11]；SLs 在逆境下可消除活性氧自由基對植物的危害，其合成基因的表達水平受到SA、JA 和ETH 的調控，與SA 協(xié)同抑制病毒可進行自我復制，減少病毒數(shù)量，阻礙病毒在細胞間的傳播[2,5,9]；BR則在植物生長過程中能夠增加有機物的合成、促進核酸和蛋白質的代謝，維持受到病毒脅迫后葉片的平展[12]；ETH 合成受到SA、BR 的調控，與SA 和JA 介導的信號途徑發(fā)生協(xié)同作用，共同激活由SA、JA 和ETH 信號途徑組成的協(xié)同防御系統(tǒng)，調控脂肪氧化酶(lipoxygenase, LOX)、CAT、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)活性和H2O2含量，誘導產生病程相關蛋白(pathogenesis-related protein, PR)等抗病蛋白，使植物系統(tǒng)獲得系統(tǒng)獲得性抗性(systematic acquired resistance, SAR)[13-14]。因此，這5 種激素可共同抵御病毒等病原物侵染危害[1]。

植物在生長過程中常常會受到不同病毒的多次侵染或復合侵染，這種現(xiàn)象十分普遍。據(jù)報道，在馬鈴薯(Solanum tuberosum) X 病毒與馬鈴薯Y 病毒、大豆花葉病毒(soybean mosaic virus, SMV)與菜豆莢斑駁病毒(bean pod mottle virus, BPMV)、小麥線條花葉病毒(wheat streak mosaic virus, WSMV)與玉米矮花葉病毒(maize dwarf mosaic virus, MDMV)、甘薯羽狀斑駁病毒(sweet potato feathery mottle virus, SPFMV)與甘薯褪綠矮化病毒(sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)之間存在復合侵染現(xiàn)象，這些病毒在侵染寄主后發(fā)生協(xié)生作用，導致寄主出現(xiàn)比其中任意一種病毒侵染更加嚴重的癥狀[15-16]。引起苜蓿(Medicago sativa)病毒病的主要病原苜蓿花葉病毒(alfalfa mosaic virus, AMV)是苜?；ㄈ~病毒屬中寄主最多的植物病毒，可以侵染包括苜蓿、白三葉草(Trifolium repens)、 豇豆(Vigna unguiculata)、 煙草(Nicotiana tabacum)、 辣椒 (Capsicum annuum)等51 科430 多種植物[17]，常常在苜蓿、三葉草、豇豆和煙草等植物中與白三葉草花葉病毒(white clover mosaic virus, WCMV)、菜豆黃花葉病毒(bean yellow mosaic virus, BYMV)、豇豆花葉病毒(cowpea mosaic virus, CPMV)、紅三葉草明脈花葉病毒(red clover vein mosaic virus, RCVMV)、煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus, TMV)、黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus, CMV)、大豆花葉病毒等發(fā)生復合侵染，同樣加重病害發(fā)生[18-19]；其中，AMV 與WCMV 復合侵染白三葉草的田間復合侵染率高達83.3%[20]，在復合侵染的寄主體內2 種病毒的含量分別是單獨侵染寄主體內病毒含量的5.897 和3.515 倍[21]；復合侵染苜蓿后使葉片中與抗病性相關的多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)、過氧化物酶(peroxidase, POD)和苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL) 3 種防御酶活性顯著升高、葉綠素和可溶性蛋白含量均降低，AMV 和WCMV 復合侵染苜蓿、三葉草等豆科牧草后，嚴重影響牧草的生長，使牧草產量降低[22]。

但是，有關AMV 和WCMV 復合侵染后，隨著時間的延長是否會通過誘導寄主植物中SA、JA、SLs、BR 和ETH 的積累或減少來影響植物的正常生長，以及各激素之間的協(xié)同關系等問題尚未見系統(tǒng)報道。為此，本研究以提純的AMV、WCMV 和不同比例混合的AMV、WCMV 病毒液接種本氏煙(Nicotiana benthamiana)，通過測定不同時間下5 種激素的含量及變化，旨在明確AMV 和WCMV 復合侵染對寄主中SA、JA、SLs、BR 和ETH 等激素含量的影響，這對進一步從植物內源激素變化方面揭示AMV 和WCMV 復合侵染寄主的致病機理具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料

本氏煙：2020 年秋季種植于發(fā)光二極管(light emitting diode, LED)頂置人工氣候箱中，溫度25 ℃、16 h/8 h(L/D)、相對濕度60%、光照8 000 lx，共120株，備用。

AMV 和WCMV 病毒：保存于?80 ℃冰箱中，濃度300 pg·mL?1，備用。

AMV 和WCMV DAS-ELISA 定量檢測試劑盒購自江蘇晶美生物科技有限公司；SA、JA、SLs、BR、ETH ELISA 定量檢測試劑盒 購自江蘇晶美生物科技有限公司。

0.02 mol·L?1磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution, PBS)：pH 7.0、pH 7.2。

1.1.2 供試儀器設備

試驗設備：立式高壓蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)、電熱恒溫水浴鍋(上海躍進醫(yī)療器械有限公司)、高速冷凍離心機(德國Eppendorf 公司)。

試驗儀器：酶標儀(美國Biotek 公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 病毒接種處理

分別將AMV 和WCMV 按照體積比1 ? 0、0 ? 1、1 ? 1、1 ? 3、3 ? 1 混合，然后取各病毒液1 mL 分別加PBS 緩沖液(pH 7.0) 4 mL，稀釋成5 倍病毒液，從上述種植的本氏煙中選取60 株健康的、長勢一致、4～5 片葉的幼苗，使用摩擦接種法，接種前用滅菌水沖洗接種葉，待葉片干凈后輕輕灑少許金剛砂，并滴加0.1 mL 病毒液，用指腹小心摩擦接種[22]，每株接種3 片葉，以只接種0.1 mL 0.02 mol·L?1PBS 緩沖液(pH 7.0)的本氏煙為對照，每個處理重復接種10 株，接種后用蒸餾水沖洗葉片上多余的病汁液，然后將幼苗置于人工氣候箱中，定時定量澆灌營養(yǎng)液培養(yǎng)，并觀察發(fā)病情況，待發(fā)病后進行帶毒檢測及病毒含量測定。

1.2.2 接種的本氏煙病毒含量檢測

2 種病毒含量標準曲線制作：設空白孔和標準孔，分別取AMV 和WCMV 檢測試劑盒中提供的AMV、WCMV 標準品，使用試劑盒提供的標準品稀釋液將AMV 標準品稀釋至15、30、60、120、240 pg·mL?1，將WCMV標準品稀釋至12.5、25、50、100、200 pg·mL?1，然后分別取稀釋好的不同濃度的2 種病毒標準品分別加入各自配套的酶標板上的不同標準孔內，每孔加標準品50 μL；按照AMV、WCMV 檢測試劑盒的產品說明書操作步驟進行，反應完成后每孔加反應終止液50 μL 終止反應，以空白孔調零，用酶標儀在15 min內測定各孔450 nm 下的吸光值，以AMV、WCMV標準品不同濃度為橫坐標x，以不同濃度下450 nm處吸光值為縱坐標y，在Excel 2010 中制作標準曲線y=ax+b。

接種幼苗病毒含量檢測：取上述接種病毒72 h后的幼苗葉片，去葉脈后稱取0.5 g，放入冰凍的研缽后，以1 ? 4 的比例加入PBS 緩沖液(pH 7.0)冰浴研磨后于4 ℃下2 000 r·min?1離心20 min，取上清液備用；在酶標板上設置陰性對照孔、陽性對照孔、空白對照孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑)和待測樣品孔；陰性對照孔、陽性對照孔中分別加入陰性對照、陽性對照50 μL，待測樣品孔中先加入樣品稀釋液40 μL，再加入離心后的上清液10 μL，不同處理做不同標記，每個處理重復3 次；然后按照AMV、WCMV 檢測試劑盒的產品說明書操作步驟進行。反應終止后以空白對照孔調零，利用酶標板在450 nm 處測定OD 值，當陽性對照孔平均值≥ 1.00、陰性對照孔平均值 ≤ 0.10 即可判定試驗有效；計算臨界值(臨界值 = 陰性對照孔平均值 +0.15)；當樣品孔的OD 值 ≥ 臨界值即為AMV 或WCMV 陽性；并將測得的OD 值代入制作好的標準曲線中，求出x值，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品中病毒濃度。

1.2.3 接種AMV 和WCMV 的本氏煙中5 種激素含量測定

5 種激素含量標準曲線制作：從5 種激素的檢測試劑盒中取出5 種激素標準品，按照各試劑盒說明書進行稀釋，樣品稀釋液取自各試劑盒。SA 標準品稀釋至75、150、300、600、1 200 pmol·L?1，JA 標準品稀釋至62.5、125、250、500、1 000 pmol·L?1，SLs 標準品稀釋至3、6、12、24、48 ng·L?1，BR 標準品稀釋至7.5、15、30、60、120 ng·L?1，ETH 標準品稀釋至20、40、80、160、320 ng·L?1，并設空白對照孔，每個處理重復3 次；然后分別按照各激素檢測試劑盒說明書的操作步驟進行，待反應完成后加入終止液，在15 min 內用酶標儀測定450 nm 處的吸光值，以5 種激素標準品濃度為橫坐標x，以不同激素不同濃度對應的吸光值為縱坐標y，使用Excel 2010 制作標準曲線y=ax+b。

5 種激素樣品液提?。悍謩e于不同接種處理72、144、216、360、432、504、576、648、720 h 時剪去本氏煙葉片(去葉脈)，稱取0.2 g，立即放入?20 ℃冷凍的研缽中，加入少許石英砂和0.8 mL 0.02 mol·L?1的PBS 緩沖液(pH 7.2)冰浴研磨后轉入1.5 mL 尖底離心管中，于4 ℃下2 500 r·min?1離心20 min，將上清液小心轉移到滅菌離心管中，即為5 種激素樣品提取液，立即轉移至冰浴中，備用。

激素含量的測定：取上述提取的樣品液10 μL加入試劑盒提供的對應樣品稀釋液(40 μL)中(稀釋5 倍)，每種激素各設空白對照孔、樣品孔，按照產品說明書步驟進行5 種激素含量的測定，于450 nm處測得吸光值后，將待測樣品吸光值代入各激素標準曲線回歸方程中，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品中各激素的實際濃度，將各激素濃度換算為每克鮮葉中的激素含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 25.0 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和方差分析，用平均值和標準誤描述測定結果，對同一時間不同處理的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，并用Duncan 法對所得數(shù)據(jù)進行多重比較；采用Excel 2010 進行標準曲線繪制、數(shù)據(jù)整理及制圖。

2 結果與分析

2.1 本氏煙幼苗AMV 和WCMV 帶毒檢測

2.1.1 AMV 和WCMV 濃度標準曲線

DAS-ELISA 定量檢測AMV 的標準曲線為y=226.63x?10.162(r= 0.999 2)；WCMV 的標準曲線為y=145.17x+6.281 3(r= 0.992 6)。

2.1.2 本氏煙幼苗AMV 和WCMV 檢測

采用DAS-ELISA 方法檢測接種72 h 的本氏煙葉片中AMV、WCMV 帶毒情況及濃度，結果表明2 種病毒按1 ? 1、1 ? 3 和3 ? 1 混合接種和單獨接種處理的10 株幼苗葉片， 均表現(xiàn)為AMV 和WCMV 陽性及AMV 或WCMV 陽性，帶毒檢出率均為100%。3 個不同比例接種2 種病毒混合液的處理中1 ? 1 比例時AMV、WCMV 濃度分別為178.65、153.72 pg·mL?1，1 ? 3 比例時AMV、WCMV 濃度分別為138.83 和152.60 pg·mL?1，均低于AMV、WCMV 單獨接種的病毒濃度(328.28 和270.94 pg·mL?1)。AMV 和WCMV 以3 ? 1 比例接種后本氏煙葉片中2 種病毒濃度分別為344.97、216.61 pg·mL?1，其中AMV 濃度高于單獨接種AMV 的本氏煙葉片中AMV 濃度(表1)。

表1 接種72 h 后本氏煙葉片中AMV 和WCMV 病毒的濃度Table 1 Concentration of AMV and WCMV in Nicotiana benthamiana leaves after 72 hours of inoculation pg·mL?1

接種病毒720 h 后，復合侵染癥狀明顯重于單獨侵染，其中AMV 和WCMV (3 ? 1)混合液復合侵染本氏煙葉片癥狀最明顯，出現(xiàn)了嚴重花葉、明脈的癥狀；AMV 和WCMV (1 ? 1)混合液侵染本氏煙葉片表現(xiàn)出明脈、斑駁癥狀；AMV 和WCMV (1 ? 3)混合液侵染本氏煙葉片表現(xiàn)出較嚴重的皺縮、輕微斑駁花葉；AMV 單獨侵染后本氏煙葉片出現(xiàn)斑駁花葉、明脈癥狀；WCMV 單獨侵染后本氏煙葉片則出現(xiàn)輕花葉癥狀；對照(CK)表現(xiàn)健康、無癥狀(圖1)。

圖1 AMV 和WCMV 復合侵染720 h 時本氏煙葉片癥狀表現(xiàn)Figure 1 Symptoms on leaf inoculated with AMV and WCMV at 720 h in Nicotiana benthamiana

2.2 接種AMV 和WCMV 對本氏煙葉片5 種激素含量的影響

2.2.1 5 種激素含量標準曲線制作

通過DAS-ELISA 方法對5 種激素不同濃度標準品的OD 值進行測定，建立的標準曲線分別為：

2.2.2 水楊酸含量的變化

測定接種病毒后本氏煙葉片中的SA 含量(圖2)發(fā)現(xiàn)，接種AMV 和WCMV 混合液及單獨接種AMV或WCMV 后本氏煙葉片中SA 含量均高于健康植株(CK)，并且SA 含量隨著接種時間的增加表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，在接種兩種病毒混合液(3 ? 1、1 ? 1、1 ? 3) 72 h 時SA 含量值最低，比單獨接種WCMV 的本氏煙中SA 含量分別降低了12.33%、38.98%和14.69%，AMV 和WCMV 接種比例為3 ? 1和1 ? 3 的比單獨接種AMV 的本氏煙中SA 含量分別提高了2.82%和0.70%，AMV 和WCMV 接種比例為1 ? 1 處理的SA 含量低于單獨接種AMV 處理，高于CK；SA 含量在接種AMV 和WCMV 混合液(3 ? 1、1 ? 1、1 ? 3) 360 h 時達到最高值，分別為5.22、4.40 和3.89 ng·g?1，比單獨接種AMV 的本氏煙葉片中SA 含量分別高61.61%、36.22%和20.43%，比單獨接種WCMV 的本氏煙葉片中SA 含量分別高63.13%、37.50%和21.56%，比CK 分別高92.62%、62.36%和43.54%；144～720 h 時，AMV 和WCMV接種比例為3 ? 1 和1 ? 1 的本氏煙中SA 含量顯著高于單獨接種AMV、WCMV 和CK (P< 0.05)；在不同測定時間，各接種處理植株葉片的SA 含量之間均存在明顯差異。

圖2 接種AMV 和WCMV 對本氏煙葉片中水楊酸含量的影響Figure 2 Effects of inoculation with AMV and WCMV on salicylic acid (SA) content in Nicotiana benthamiana leaves

2.2.3 茉莉酸含量的變化

測定接種病毒后本氏煙葉片中JA 含量(圖3)發(fā)現(xiàn)，接種AMV 和WCMV 混合液及單獨接種AMV 或WCMV 后本氏煙葉片中JA 含量除648 和720 h 外均低于健康植株(CK)，并且JA 含量隨著接種時間的增加表現(xiàn)出先降低后升高的趨勢，其中在接種兩種病毒混合液(3 ? 1、1 ? 1、1 ? 3) 360 h時本氏煙葉片中JA 含量降至最低，分別為0.54、0.72 和1.10 ng·g?1，比單獨接種AMV 本氏煙葉片中JA 含量分別低59.09%、45.45%和16.67%，比單獨接種WCMV 本氏煙葉片中JA 含量分別低61.43%、48.57%和21.43%，比CK 分別低66.46%、55.28%和31.68%；JA 含量在接種兩種病毒混合液(3 ? 1、1 ? 1、1 ? 3) 720 h 時本氏煙葉片中達到最大，分別為2.44、2.34 和2.25 ng·g?1，除了以1 ? 3 比例接種外，接種其余兩個比例混合液均使得本氏煙葉片中JA 含量高于單獨接種AMV和WCMV、 CK， 比單獨接種AMV 分別高11.93%和7.34%，比單獨接種WCMV分別高8.93%和4.46%， 比CK 分別高5.17%和0.86%；接種兩種病毒混合液(3 ? 1、1 ? 1、1 ? 3) 72 h時的本氏煙葉片中JA 含量僅次于720 h，高于其余接種時間的JA 含量，分別為1.91、2.03 和2.07 ng·g?1，比單獨接種AMV 和WCMV 均高30.19%以上；接種時長在576 和720 h 時，所有處理之間均無顯著差異，除此之外，其余接種時間下各接種處理間差異明顯。

圖3 接種AMV 和WCMV 對本氏煙葉片中茉莉酸含量的影響Figure 3 Effects of inoculation with AMV and WCMV on jasmonic acid (JA) content in Nicotiana benthamiana leaves

2.2.4 獨角金內酯含量的變化

測定接種病毒后本氏煙葉片中SLs 含量(圖4)發(fā)現(xiàn)，接種AMV 和WCMV 混合液及單獨接種AMV或WCMV 后本氏煙葉片中SLs 含量除720 h 接種比例3 ? 1 處理外均高于健康植株(CK)，并且SLs 含量隨著接種時間的增加表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，其中SLs 含量在AMV 和WCMV 接種比例為3 ? 1 處理360 h 時達到最大，為1.39 ng·g?1，此時，其比單獨接種AMV 和WCMV、CK 分別高36.27%、39.00%和69.51%；SLs 含量在接種兩種病毒混合液(3 ? 1、1 ? 1、1 ? 3) 72 h 時降到最小，分別為0.61、0.53 和0.44 ng·g?1，其中，AMV 和WCMV 的接種比例為3 ? 1 的處理比單獨接種AMV、WCMV 和CK 中的SLs 含量分別高10.91%、12.96%和56.41%，而接種比例分別為1 ? 1 和1 ? 3 的處理中SLs 含量均低于單獨接種AMV、 WCMV 處理， 但高于CK； 在216～648 h 接種時間內，接種比例為3 ? 1 和1 ? 1 的處理與其余處理植株葉片的SLs 含量之間存在明顯差異。

圖4 接種AMV 和WCMV 對本氏煙葉片中獨腳金內酯含量的影響Figure 4 Effects of inoculation with AMV and WCMV on strigolactones (SLs) content in Nicotiana benthamiana leaves

2.2.5 油菜素內酯含量的變化

測定接種病毒后本氏煙葉片中BR 含量(圖5)發(fā)現(xiàn)，接種AMV 和WCMV 混合液及單獨接種AMV或WCMV 后本氏煙葉片中BR 含量除處理648 h 外其余處理時間均高于健康植株(CK)，并且BR 含量隨著接種時間的增加表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，其中BR 含量在接種兩種病毒混合液(3 ? 1、1 ? 1、1 ?3) 360 h 時的本氏煙葉片中達到最大，分別為3.73、3.15 和2.64 ng·g?1，比單獨接種AMV 處理分別高63.60%、38.16%和15.79%，比單獨接種WCMV 處理分別高60.78%、35.78%和13.79%，比CK 分別高81.95%、53.66%和28.78%；BR 含量在AMV 和WCMV接種比例為3 ? 1 處理 720 h 時降至最小，為1.27 ng·g?1，此時，其比單獨接種AMV 和WCMV 處理分別低19.69%和16.54%，比CK 高30.93%；在360 和504 h 接種時間下各接種處理植株葉片的BR 含量之間有明顯差異。

圖5 接種AMV 和WCMV 對本氏煙葉片中油菜素內酯含量的影響Figure 5 Effects of inoculation with AMV and WCMV on brassinolide (BR) content in Nicotiana benthamiana leaves

2.2.6 乙烯含量的變化

測定接種病毒后本氏煙葉片中ETH 含量(圖6)發(fā)現(xiàn)，接種AMV 和WCMV 混合液及單獨接種AMV 或WCMV 后本氏煙葉片中ETH 含量均高于健康植株(CK)，并且ETH 含量隨著接種時間的增加表現(xiàn)出先升高、后降低、再升高、再降低的趨勢，其中ETH 含量在接種兩種病毒混合液(3 ? 1、1 ? 1、1 ? 3) 648 h 時達到最大，分別為8.32、7.19 和6.51 ng·g?1，此時，3 個處理分別比單獨接種AMV 處理高66.07%、43.51%和29.94%，分別比單獨接種WCMV處理高63.46%、41.26%和27.90%，分別比CK 高108.52%、80.20%和63.16%；ETH 含量在接種兩種病毒混合液(3 ? 1、1 ? 1、1 ? 3) 360 h 時的本氏煙葉片中略低于648 h，分別為6.26、5.69、5.19 ng·g?1，此時，3 個處理分別比單獨接種AMV 處理高38.50%、25.89%和14.82%，分別比單獨接種WCMV 處理高31.51%、 19.54%和9.03%， 分別比CK 高65.17%、50.13%和36.94%；ETH 含量在AMV 和WCMV 接種比例為3 ? 1 處理72 h 時降至最小，為1.60 ng·g?1，此時，比單獨接種AMV 和WCMV 分別低30.63%和35.00%，比CK 高10.35%；72～720 h 不同接種時間下各接種處理植株葉片的ETH 含量之間差異明顯。

圖6 接種AMV 和WCMV 對本氏煙葉片中乙烯含量的影響Figure 6 Effects of inoculation with AMV and WCMV on ethylene (ETH) content in Nicotiana benthamiana leaves

3 討論與結論

本研究發(fā)現(xiàn)，接種AMV 和WCMV 混合液(3 ? 1)后復合侵染的本氏煙葉片癥狀明顯重于接種AMV和WCMV 混合液(1 ? 1、1 ? 3)及單獨接種AMV 或WCMV 本氏煙癥狀；而且在接種72 h 后，接種葉中AMV 濃度明顯高于其他處理，WCMV 濃度除了略低于單獨接種WCMV 的濃度外均高于其他處理。接種AMV 和WCMV 混合液的本氏煙葉片中SA、JA、SLs、BR 和ETH 含量分別在144～432 h、72～504 h、360～432 h、360～504 h 和288～648 h 與單獨接種AMV、WCMV 及健康植株葉片中的含量之間有明顯差異。接種AMV 和WCMV 混合液(3 ? 1)的本氏煙葉片中SA、SLs、BR 和ETH 4 種激素的含量分別在360、360、360、648 h 達到最高，顯著高于單獨接種AMV、WCMV 和健康植株(CK)，與單獨接種AMV 和WCMV、CK 本氏煙葉片中4 種激素含量相比，SA 含量分別提高了61.61%、63.13%、92.62%，SLs 含量分別提高了36.27%、39.00%和69.51%，BR含量分別提高了63.60%、60.78%和81.95%，ETH 含量分別提高了66.07%、63.46%和108.52%；72～504 h 時，接種AMV 和WCMV 混合液(3 ? 1)的本氏煙葉片中JA 含量均明顯低于單獨接種AMV、WCMV和健康植株(CK)，其中接種360 h 時分別降低了59.09%、61.43%和66.46%。

SA 和JA 是植物體內重要的信號分子，在植物防御病原菌入侵過程中扮演著重要角色[23]。SA 化學名為鄰羥基苯甲酸，是植物體內的小分子酚類物質，參與活體或半活體營養(yǎng)型病原菌引發(fā)的抗病并誘發(fā)植物的系統(tǒng)獲得性抗性。JA 化學名稱為3-氧-2-(2’-戊烯基)-環(huán)戊烷乙酸，是一種脂肪酸類的信號分子，參與死體營養(yǎng)型病原菌及其昆蟲誘導的抗病并激發(fā)植物的誘導系統(tǒng)抗性(induced systemic resistance, ISR)。大量研究表明，當植物受到病原侵染后，體內SA、JA 和ETH 等信號分子將引起一系列的抗病信號傳導，調控SLs 和BR 等相關激素的合成，最終激活病程相關基因(pathogenesis-related genes, PR)的表達[14]。

據(jù)報道，生物脅迫會導致寄主植物激素水平發(fā)生變化，植物響應逆境條件時，可以通過調節(jié)自身的激素合成量來增強抗逆性。病毒脅迫會導致寄主植物葉片中的SA、JA 和BR 積累并觸發(fā)病原物相關分子模式觸發(fā)式免疫(pattern-triggered immunity,PTI)[7,10,24-26]。擬南芥(Arabidopsis thaliana)感染AMV后，會通過調節(jié)JA 和SA 的合成相關基因來減輕病毒侵染對自身活力的影響[27]，在病原菌脅迫下SLs 相關基因能夠在維管組織和輸導組織中大量表達，促進可阻礙病原菌在胞間連絲中傳導的胼胝質的生成[9]；同時在逆境脅迫下各激素間表現(xiàn)為協(xié)同或拮抗作用，組成抗脅迫網(wǎng)絡，抵抗病害的發(fā)生；而ETH 含量隨著SA 和BR 含量的升高而升高，SA 和BR 可促進ETH 的合成。有研究表明，SA 和JA 之間表現(xiàn)為拮抗作用[23]。玉米在抗MCMV 脅迫時SA 和BR 表現(xiàn)為協(xié)同作用，而與JA 之間表現(xiàn)為拮抗作用[10]；寄主植物的癥狀表現(xiàn)也與激素水平的變化有關[28]，出現(xiàn)植物組織變色、壞死、畸形等癥狀的根本原因就是病毒入侵寄主后對寄主激素代謝水平產生了一定的干擾[14]。5 種激素中，SA、SLs 和BR 均可以促進植物的光合色素合成和氣孔關閉、提高光合速率、維持植株生長[1,4,6]，JA、ETH 可以延緩植株生長、促進葉片衰老和脫落[11-12]。本研究也發(fā)現(xiàn)，接種AMV 和WCMV 兩種病毒混合液(3 ? 1、1 ? 1)后，可提高本氏煙葉片中SA (144～720 h)、SLs(216～648 h)、BR (288、360、504 h)和ETH (216～360 h、504～648 h)含量，其含量均明顯高于接種單個病毒處理和對照，JA 含量則是在216～504 h 低于接種單個病毒處理和對照，而且?guī)追N激素的相互作用使本氏煙葉片表現(xiàn)出重花葉、斑駁輕花葉、明脈、皺縮等不同的癥狀類型，產生不同程度的過敏反應，當復合接種發(fā)病的本氏煙中病毒含量越大、癥狀越嚴重時葉片中SA、SLs、BR 和 ETH 含量越大，而JA 含量越?。?32～720 h 時ETH 含量先隨著SA、SLs 和BR 含量的降低而降低，之后受到JA 的促進作用，與JA 一起大量合成、積累[29]，植株葉片變小、生長速度降低，導致了本氏煙植株的衰亡。

本研究僅針對AMV、WCMV 復合侵染本氏煙中5 種激素含量變化進行了檢測，證明了AMV、WCMV 復合侵染存在協(xié)生作用，提高了寄主植物葉片內病毒濃度并加重了癥狀表現(xiàn)，明確了AMV 和WCMV 復合侵染對本氏煙720 h 內5 種激素含量影響的變化規(guī)律。但是，由于苜蓿葉片較小、表面具絨毛、采用摩擦接種病毒發(fā)病慢，故只選擇使用模式作物本氏煙來進行試驗；有關AMV 和WCMV 復合侵染苜蓿后葉片中激素含量變化與兩種病毒復合侵染致病機理之間的關系、AMV 和WCMV 復合侵染本氏煙與苜蓿后5 種激素之間的協(xié)同關系以及對寄主光合色素合成及光合速率、苜蓿品質的影響等問題尚未涉及，還有待進一步的研究。