基于CRISPR-Cas9構(gòu)建樹突狀細胞相關C型凝集素-1基因敲除小鼠模型

陳 潔 謝葉文 潘 潔 丁 駿

江蘇省常州市第二人民醫(yī)院中心實驗室，江蘇常州 213000

樹突狀細胞相關性C型凝集素-1（dendritic cellassociated C-type lectin-1，Dectin-1）是屬于ⅡC 型凝集素受體 （C-type lectin receptors，CLR） 家族成員之一，由CLEC7a基因編輯。主要表達于巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞等多種細胞表面[1]，同時在肺、胸腺等多個器官中也高表達，其主要作用是模式識別受體，Dectin-1可通過識別CD4+、CD8+T細胞表面的內(nèi)源性受體，從而促進T細胞的增值[2]，Dectin-1在免疫預防與免疫監(jiān)視中均起到重要的作用。

樹突狀細胞（dendritic cell，DC）是機體功能最強的抗原遞呈細胞（antigen-presenting Cell，APC），現(xiàn)已被應用到多種腫瘤治療中[3]。Dectin-1是最早發(fā)現(xiàn)在DC 上的模型識別受體，Dectin-1 可以識別 β-（1，3）-葡聚糖與其結(jié)合刺激樹突狀細胞誘導Th1和Th17細胞分化[4-5]，啟動機體的獲得性免疫，同時也能通過識別真菌細胞壁上的β-葡聚糖，驅(qū)動宿主細胞對真菌吞噬和黏附，并以這種方式開啟機體的天然免疫。這明確了Dectin-1在腫瘤免疫中的機制，同時也是把Dectin-1作為腫瘤免疫治療的新靶點的依據(jù)。

CRISPR-Cas9是古細菌和細菌在演化過程中產(chǎn)生的一種適應性免疫防御[6]，其作用是抵御外界侵入細菌的DNA或外源DNA，CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)是基因敲入技術中最高效的一種方法，其能夠準確識別外來的DNA，并將其雙鏈進行特異性切割，應用CRISPR-Cas9系統(tǒng)，通過設計靶向目的基因的sgRNA實現(xiàn)Cas9蛋白對DNA雙鏈的特異性切割。哺乳動物中，DNA雙鏈斷裂后會發(fā)生非同源末端連接介導的非同源末端連接修復，DNA雙鏈在重新連接的同時引入隨機的堿基缺失或增加，造成基因序列移碼突變，蛋白功能缺失（圖1，封三）[7-9]。本研究通過CRISPRCas9技術敲除小鼠體內(nèi)Dectin-1基因，進一步研究Dectin-1對β-葡聚糖抗腫瘤的影響，為Dectin-1在腫瘤免疫中的作用機制研究提供實驗基礎。

圖1 CRISPR-Cas9基因編輯技術圖（見內(nèi)文第41頁）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 3～4周齡的C57BL/6野生型小鼠；購買于常州卡文斯實驗動物有限公司[SCXK（蘇）2016-0010]，并飼養(yǎng)于此公司。飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級，濕度（55±10）%，溫度（22±4）℃，飼養(yǎng) 1 周。

1.1.2 實驗試劑及儀器 二甲基亞砜（fimethyl sulfoxide，DMSO），來自sigma 公司（D2650）；mMESSAGE mMA CHINE T7 kit（AM1344）和 MEGAclear kit（AM1908）均購自Life Technologies公司；QIAQuick PCR純化試劑盒購自 Qiagen 公司（28104）；T7-Cas9（39994）和T7-sgRNA（68463）均購自Addgene公司；人絨毛促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG），KSOM，血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）。SZX7 立體顯微鏡（Olympus，SZX7），二氧化碳培養(yǎng)箱（英國 Thermo，3111）和倒置熒光顯微鏡（Olympus，IX71）。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 從NCBI基因組查詢數(shù)據(jù)得到C57BL/6野生型小鼠的Clec7a基因總長為11189bp，在6號染色體上有6個外顯子，在外顯子2的功能區(qū)前端和后端分別設計兩對引物，上游引物和下游引物見表1。

1.2.2 Cas9 mRNA及sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄和純化 引物序列通過PCR進行擴增，將T7啟動序列添加到Cas9的編輯區(qū)域中（表1）。用TEA緩沖液配置1%的瓊脂糖凝膠，進行PCR實驗用來檢測T7-Cas的特異性和長度（T7-Cas大小約為4.3 kB）。使用QIAQuick PCR純化試劑盒，對T7-Cas9 PCR產(chǎn)物進行純化。使用mMESSAGE mMACHINE T7試劑盒，把純化后的產(chǎn)物作為模板，進行Cas9mRNA體外轉(zhuǎn)錄。使用MEGA-clear試劑盒，用50 μl洗脫緩沖液進行洗脫，根據(jù)試劑盒操作步驟對Cas9 mRNA進行純化。純化后，用無RNase的水將Cas9 mRNA稀釋至500 ng/μl，并用TEA緩沖液配置2%的瓊脂糖凝膠，進行質(zhì)量檢測。

引物通過PCR進行擴增，將T7啟動序列添加到sgRNA的模板中。用TEA緩沖液配置2%的瓊脂糖凝膠，進行PCR實驗用來檢測sgRNA的特異性和長度，PCR檢測其長度為100 pb。使用QIAQuick PCR純化試劑盒，根據(jù)其操作步驟，對T7-sgRNA PCR產(chǎn)物進行純化。

1.2.3 受精卵準備 選取12～15只（3～4周齡）的C57BL/6小鼠，在第1天給小鼠注射PMSG，劑量為5 U，48 h后向C57BL/6雌小鼠腹腔注射HCG，劑量為每只5 U。HCG注射之后將雌性小鼠與C57BL/6雄性小鼠過夜。在第4天，收集帶有栓的雌性小鼠，并將沒有栓的雌性小鼠實施安樂死，進行受精卵制備。HCG注射后20～21 h，對見栓的雌性小鼠實施安樂死，從輸卵管處收集卵丘細胞復合體。將卵丘細胞復合體移入HTF+Hy培養(yǎng)基中，然后在HTF培養(yǎng)基中洗滌幾次后將胚胎置于KSOM培養(yǎng)基（加礦物油覆蓋）中，放置37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將受精卵轉(zhuǎn)移至HTF+CB培養(yǎng)基中，放置于顯微鏡下用顯微注射針向原核胚胎內(nèi)注射混合物[注射混合：Cas9（50 ng/μl）+sgRNA（50 ng/μl）+ssDNA（100 ng/μl）；混合液成分：加入 0.5 μl Cas9、0.5 μl sgRNA、0.5 μl ssDNA 以及0.5 μl無核酸酶水；目的：使HDR點突變]。觀察細胞質(zhì)是否腫脹，腫脹證明注射成功，將胚胎繼續(xù)培養(yǎng)24 h至產(chǎn)生2個細胞胚胎。

1.2.4 胚胎移植及Dectin-1小鼠的獲得 注射當天將發(fā)情的ICR雌性小鼠和結(jié)扎的雄性小鼠交配來準備假孕代孕母鼠。隔天選擇見栓0.5 d的雌鼠，將胚胎移植到代孕母鼠的輸卵管中，或者交配后2.5 d之后將胚胎直接移植到代孕母鼠的子宮內(nèi)，代孕母鼠在交配19.5 d之后生下F0小鼠。出生后3周，將雌性F0小鼠和雄性F0小鼠分籠飼養(yǎng)。

1.2.5 體內(nèi)實驗及分組情況 構(gòu)建野生型小鼠及Dectin-1敲基因小鼠的乳腺癌模型，待皮下腫瘤可觸及時，給予口服β-葡聚糖（beta-gulcan）治療并分為野生型小鼠組、野生小鼠+beta-gulcan組、Dectin-1敲基因小鼠組、Dectin-1敲基因小鼠+beta-gulcan組。首次治療時開始測量腫瘤大小，每2天測量1次，并繪制腫瘤生長曲線，待腫瘤達到規(guī)定大小體積時（最長直徑不大于15 mm），處死小鼠。

1.3 觀察指標及評價標準

剪取出生后三周的小鼠尾巴0.5～1 cm并編號，并將其剪碎放置1.5或2 ml的離心管中。加入試劑對樣本進行酶解反應，離心吸取上清液，獲得小鼠的基因組DNA。用PCR技術對基因敲除情況進行驗證，驗證序列見表2，PCR擴增體系見表3，PCR反應條件為95℃，預變性 5 min；按照循環(huán)程序（95℃ 30 s；58℃30 s；72℃ 30 s） 進行 40 個循環(huán)，72℃延伸 5 min，根據(jù)說明書使用QIAQuick PCR試劑盒純化PCR產(chǎn)物。使用TA Cloning試劑盒來測試序列驗證突變。將成功敲除Dectin-1基因的雌性和雄性小鼠進行交配獲得下代小鼠，對下代小鼠進行基因鑒定，刪選繼續(xù)交配直到F3代小鼠，用PCR技術對F3代小鼠進行基因鑒定，驗證序列見表4，以確定建立Dectin-1敲除小鼠。

表2 基因引物序列

表3 PCR擴增體系

1.4 統(tǒng)計學方法

采用Graph prism 8.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 F0代小鼠獲得

本研究通過顯微鏡操作向原核胚胎內(nèi)注射混合物，成功種植的胚胎移植到代孕母鼠體內(nèi)，代孕母鼠在交配19.5 d之后生下F0小鼠。據(jù)觀察F0代小鼠狀態(tài)良好，外觀與C57BL/6野生型小鼠無差異。

2.2 Dectin-1小鼠基因鑒定結(jié)果

DNA測序結(jié)果顯示F0代小鼠中Dectin-1基因的部分序列缺失并產(chǎn)生移碼突變（-13bp）（圖2，封四）。通過設計位于移碼缺失區(qū)外的引物（P1-P2）和移碼缺失區(qū)內(nèi)的引物（P3-P4），PCR檢測發(fā)現(xiàn)，僅P1-P2引物可以擴增出目的條帶（圖3），提示從F3開始，已獲得Dectin-1敲基因小鼠。

圖3 PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.3 Dectin-1缺失抑制β-葡聚糖誘導的小鼠抗腫瘤能力

本研究構(gòu)建野生型小鼠及Dectin-1敲基因小鼠的乳腺癌模型，口服β-葡聚糖進行治療，觀察其腫瘤生長情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在第14天Dectin-1敲基因小鼠腫瘤體積大于野生型小鼠，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）（圖4，封四）。體內(nèi)實驗表明Dectin-1缺失可抑制β-葡聚糖誘導的抗腫瘤能力，同時證明Dectin-1敲基因小鼠構(gòu)建成功。

3 討論

伴隨著分子生物學、免疫學、腫瘤學的不斷發(fā)展和相互深入研究，腫瘤免疫治療應運而生[10]。隨著對人體免疫機制研究的不斷深入，腫瘤免疫治療也被越來越多的人所關注[11]，腫瘤免疫治療就是利用再次啟動免疫循環(huán)來清除體內(nèi)沒有被正常免疫系統(tǒng)所識別的腫瘤細胞[12]，來達到清除和控制腫瘤的目的。近幾年，腫瘤免疫治療在非小細胞肺癌、黑色素瘤等多種實體瘤治療中，療效顯著，但是目前腫瘤免疫治療的各種方法還不夠完善。本實驗通過構(gòu)建免疫相關基因的敲除鼠，研究其在腫瘤免疫中的作用，從而為更多的臨床試驗提供動物模型。

自1973年Siteinman[10]發(fā)現(xiàn)DC以來，樹突狀細胞是目前機體中最強的抗原遞呈細胞，而Detin-1是最早在樹突狀細胞上被發(fā)現(xiàn)的，目前對于研究樹突狀細胞在腫瘤免疫中的應用和機制，大部分相關研究報道都集中在Dectin-1受體和Dectin-2受體上[4-5]。但由于Dectin-2在樹突狀細胞上并沒有像Dectin-1一樣高表達，所以目前相關研究以Dectin-1為主。有文獻報道發(fā)現(xiàn)Dectin-1可以通過不同途徑，激活機體的特異性免疫和非特異性免疫進行腫瘤免疫[12]。因此，本實驗通過構(gòu)建Dectin-1基因敲除小鼠，研究Dectin-1在抗腫瘤免疫中的作用。

在基因敲除方法中，CRISPR-Cas9技術因其操作簡單、高效率、成本低等優(yōu)點被科研工作者作為基因編輯的首選方法[13]，在腫瘤免疫治療中也發(fā)揮著重要的作用[14-15]。所以本研究利用CRISPR-Cas9技術對小鼠Dectin-1基因進行敲除，經(jīng)過培養(yǎng)、手術、鑒定獲得F0代小鼠，并通過PCR擴增及測序鑒定的陽性F0代小鼠與C57BL/6J小鼠交配獲得6只陽性F1代小鼠。

β-葡聚糖是一種天然碳水化合物，它主要存在于植物、細菌、真菌的細胞壁上，是Dectin-1的特異性識別受體，Dectin-1通過識別β-葡聚糖，從而誘導免疫受體酪氨基酸活化基序 （immunoreceptor tyrosinebased activation motif，ITAM）激發(fā)細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導，使自身免疫細胞產(chǎn)生一系列的細胞反應，如產(chǎn)生多種炎性因子、趨化因子，這些因子可以促進B細胞、T細胞的體液免疫應答和細胞免疫應答加強[17]，從而增強機體抗腫瘤[18]及抗感染[19-20]能力。本研究通過β-葡聚糖來檢測Dectin-1敲基因小鼠的抗腫瘤能力，結(jié)果顯示，Dectin-1敲基因小鼠口服β-葡聚糖后，其抗腫瘤生長能力低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。由此證明Dectin-1敲基因小鼠構(gòu)建成功，為腫瘤免疫治療臨床試驗提供動物模型，同時有助于臨床更好的研究Dectin-1在腫瘤免疫中的作用機制。

綜上所述，利用CRISPR-Cas9技術構(gòu)建Dectin-1敲基因小鼠模型建立動物模型有利于腫瘤免疫治療方法的完善，同時對Dectin-1在免疫腫瘤治療中的影響及作用奠定了一定的實驗基礎。