淺談復合氨基酸溶液HPLC檢測及分析

劉初亮 劉鑠佳 劉佳華

廣東百試特生物技術研究院有限公司 廣東 揭陽 515527

在生命科學研究當中，氨基酸分析是十分關鍵的一項技術[1]。1958年國外學者先提出了采用離子交換色譜和柱后茚三酮相互結合的方法分析蛋白質水解所形成的氨基酸，提出了早期的氨基酸自動分解技術。在之后的不斷發(fā)展當中，傳統(tǒng)氨基酸分析方法隨著高效液相技術、柱載體化學技術等的發(fā)展也得到了提升。尤其是在近些年以來，RP-HPLC技術和各種柱前衍生技術相互結合進程的加快，形成了適用性范圍更加廣泛的氨基酸分析技術。本次研究當中采用HPLC技術檢測復合氨基酸溶液中的成分，為后續(xù)研究提供參考。大多數(shù)的氨基酸不具備熒光發(fā)射和吸收特性，采用標準的折射探測儀，在檢測氨基酸當中的靈敏度也不夠。為了讓檢測靈敏度得到提升和選擇特性分析，通常會把氨基酸衍生化，分為柱前衍生和柱后衍生方法。

1 實驗材料及儀器

1.1 樣品

所使用到的復合氨基酸溶液樣品為廣東百試特生物技術研究院有限公司自制，共有三批。

1.2 儀器

高效液相色譜儀為全自動Agilent1200，另外還有超聲波清洗器、電子天平等。

1.3 試劑

氨基酸對照品為中國藥品生物制品鑒定所提供，其他的化學試劑屬于分析純。

2 方法和結果

2.1 方法

色譜柱為4.6mm×250mm，5μm；流動相為A相為1mol/L乙酸鈉水溶液；流動相B相為50%乙腈水溶液。所采用的梯度洗脫模式，流速為1.0ml·min-1，所設定的檢測波長為360nm，確定的進樣量為20μl，柱溫確定為27℃。

2.2 制備樣品和對照品

制備對照品時按照樣品的處方來進行配置，對照品的計量必須要精密稱取，加入適量的水進行超聲溶解。選取1ml的量放置到10ml的瓶中，依次加入1ml濃度為0.05mol/L的碳酸氫鈉溶液和1ml的1%2-4二硝基氟苯，放入到60℃的水浴中1小時，冷卻到室溫之后，再使用水進行稀釋，達到刻度后，搖晃均勻。在進樣之前使用0.45μm的微孔濾膜進行過濾。

制備樣品溶液，選擇復合氨基酸溶液2ml，分別放置在200ml的量瓶當中，其余的流程和對照品的制備一樣。制備空白溶液，按照處方來稱取除了氨基酸之外的其他相關組分，按照樣品溶液制備的方式完成制備。

2.3 結果

（1）標準曲線的制備。分別在不同的劑量下開展實驗分析，對色譜圖情況進行記錄。峰面積為y，進樣量為x，開展線性回歸，線性關系良好，相關系數(shù)達到0.999。

（2）精密度試驗結果

精密吸取對照品溶液，需要20μl的進樣量，重復進樣5次，對色譜圖情況進行記錄。最終得到的氨基酸峰面積RSD值在0.1%到1.2%之間，說明方法精密度良好。

試驗結果為：L-脯氨酸的RSD為0.1%，L-絲氨酸的RSD為0.2%，L-門冬氨酸為0.2%，L-丙氨酸為0.1%，L-精氨酸為0.1%，L-苯丙氨酸為0.1%，L-絲氨酸為0.2%。

（3）衍生物穩(wěn)定性試驗結果。精密稱取適量樣品衍生物溶液置于100ml量瓶中，加適量水振搖使其溶解，加水到刻度，搖勻過濾后測定，結果顯示RSD值不超過3.4%，樣品衍生物溶液室溫24h內(nèi)狀態(tài)穩(wěn)定。

（4）重復性試驗結果。分別制備5份復合氨基酸溶液，在規(guī)定的色譜條件下完成測定。再結合標準曲線法來計算樣品當中各種氨基酸的含量，所測量的RSD值也在0.8%到1.8%之間，說明方法的重復性良好。

（5）加樣回收試驗結果。根據(jù)已知含量的復合氨基酸溶液，需要精密選擇25ml的劑量。放置到100ml的量瓶當中，按照準備方法得到的2ml的對照品溶液，進樣選擇為20μL，做好色譜圖的記錄工作。按照平均峰面積標準曲線法來計算，測量氨基酸的回收率。結果顯示回收率在97.0%到100.3%之間，RSD值在2.0%之內(nèi)。

3 討論

第一，氨基酸測量當中，衍生化試劑計量的選擇必須要合理。所確定的衍生化劑和總氨基酸計量之間的摩爾濃度確定為4∶1，衍生化試劑進樣的總濃度應當控制在1mg·ml-1之內(nèi)，否則可能會導致衍生化出現(xiàn)不完全情況或讓基線受到干擾，對最終的分析結果會產(chǎn)生比較不利的影響。

第二，測定L-色氨酸的含量情況。因為色氨酸本身就可以吸收紫外，而且還會和衍生化試劑之間發(fā)生反應，出現(xiàn)淬滅導致沒有辦法吸收。所以在測定色氨酸的過程中，需要使用到直接紫外分光光度測量方法。

第三，需要選擇合適的柱溫。柱溫對于氨基酸最終的分離結果會產(chǎn)生直接的影響，對于組氨酸和苯丙氨酸這些分離難度比較大的成分而言產(chǎn)生的影響更大。

4 結束語

當前國內(nèi)通常采用定氮法來對氨基酸含量進行測定，專屬性比較差，對于產(chǎn)品質量的控制能力十分有限。在復合氨基酸溶液當中采用HPLC的方式進行氨基酸檢測整體效果比較好，但是在實際檢測當中具體使用哪種檢測方法，還是需要結合檢測方法的簡便程度、衍生速度以及靈敏度和分析結果的速度、重復性以及干擾因素等多個方面考慮，做出更好地選擇。