種植體骨結(jié)合中生物學(xué)過(guò)程與分子調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展*

張文靜 王亞楠 徐 欣

近年來(lái)，口腔種植技術(shù)憑借其無(wú)需損傷鄰牙且功能和美學(xué)效果好等優(yōu)點(diǎn),被越來(lái)越多的缺牙患者所接受，是目前一種重要的缺牙修復(fù)方式。這種臨床治療的成功在很大程度上依賴于牙槽骨內(nèi)種植體的穩(wěn)定結(jié)合和維護(hù)。種植體骨結(jié)合是指在光鏡下觀察，種植體和周?chē)墙M織緊密接觸，沒(méi)有任何纖維組織等非骨組織介入種植體和骨組織之間［1］。良好的骨結(jié)合是口腔種植重要的生物學(xué)基礎(chǔ)，其受到體內(nèi)微環(huán)境，如多種信號(hào)分子和細(xì)胞內(nèi)外基質(zhì)的影響，并處在骨形成和重塑的動(dòng)態(tài)過(guò)程中。通常情況下，種植體植入2h后，即可在傷口腔隙處觀察到由紅細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，單核/巨噬細(xì)胞及纖維蛋白等形成的血凝塊；4d后，血凝塊逐漸被肉芽組織取代，肉芽組織中富含由炎癥因子和生長(zhǎng)因子募集而來(lái)的間充質(zhì)干細(xì)胞及基質(zhì)成分等；1周后，間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量繼續(xù)增多，并在轉(zhuǎn)錄因子的作用下發(fā)生骨特異性基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，與沉積礦化的細(xì)胞外基質(zhì)共同形成編織骨；2-4周時(shí)，隨著編織骨數(shù)量的增加，它開(kāi)始逐漸被板層骨所取代，這進(jìn)一步增強(qiáng)了種植體的穩(wěn)定性；8-12周時(shí)，大部分編織骨被板層骨取代。同時(shí)，骨碎片及壞死骨的清除也在發(fā)生。因此種植體骨結(jié)合是一種動(dòng)態(tài)過(guò)程，骨形成和骨重塑共同維持骨穩(wěn)態(tài)的平衡［2］。

有研究［3］指出以大部分編織骨被板層骨替代的事件作為區(qū)分種植體骨結(jié)合早期和晚期的標(biāo)志，一般發(fā)生在植入種植體后的8-12周。雖然晚期階段具有相對(duì)成熟的骨組織并且與種植體表面的接觸度更高，但是種植體骨結(jié)合的早期涉及活躍的生物學(xué)行為及復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制，對(duì)于種植體初期穩(wěn)定性起著至關(guān)重要的作用，因而受到廣泛關(guān)注。目前很多研究嘗試通過(guò)調(diào)控鈦種植體表面的早期分子生物學(xué)反應(yīng)，進(jìn)而有針對(duì)性地改變種植體的表面形貌以提高種植體骨結(jié)合能力［4,5］。深入認(rèn)知參與骨結(jié)合早期階段的分子調(diào)控機(jī)制對(duì)于加速和加強(qiáng)骨結(jié)合過(guò)程，改善和擴(kuò)大牙科種植系統(tǒng)的臨床適應(yīng)征具有重要意義。本研究的目的是對(duì)種植體骨結(jié)合早期過(guò)程中涉及的生物學(xué)過(guò)程及分子調(diào)控機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)性綜述，以期為尋找改善種植體骨結(jié)合的分子靶點(diǎn)和擴(kuò)大種植修復(fù)臨床適應(yīng)征提供良好的理論依據(jù)。

1.骨免疫調(diào)節(jié)機(jī)制

鈦及其合金作為外科植入物材料具有良好的生物相容性，目前已廣泛應(yīng)用在口腔科、骨科、神經(jīng)外科等。但是在1992年Donath［6］就對(duì)鈦的生物惰性現(xiàn)象產(chǎn)生質(zhì)疑，他認(rèn)為鈦并非不會(huì)引起組織的任何不良反應(yīng)，反而能夠激發(fā)組織內(nèi)的免疫反應(yīng)。目前這種觀點(diǎn)已被許多研究者所證實(shí)，Trindade等［7-9］認(rèn)為商業(yè)純鈦種植體可以激活機(jī)體免疫反應(yīng)，而骨結(jié)合實(shí)際是一種異物反應(yīng)后的組織保護(hù)機(jī)制，即在鈦種植體周?chē)纬晒墙M織來(lái)穩(wěn)定種植體。

研究表明，多種炎癥細(xì)胞參與到種植體骨結(jié)合早期的免疫調(diào)控機(jī)制中，包括中性粒細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等等。在種植體植入后，血液中的中性粒細(xì)胞轉(zhuǎn)移到種植體表面，由單核-巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞分泌的白介素8（interleukin-8，IL-8）激活，進(jìn)而分泌單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）以及巨噬細(xì)胞炎癥因子1β（macrophage inflammatory protein-1β，MIP-1β）兩種細(xì)胞因子，以強(qiáng)力激活巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，從而介導(dǎo)不同的免疫反應(yīng)。其中由于巨噬細(xì)胞高度的可塑性及其在免疫反應(yīng)中的多重作用，逐漸被越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注［10-12］。

Shanbhag等［3］對(duì)早期種植體周?chē)怯系幕蚪M進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與炎癥密切相關(guān)的腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、干擾素（interferon，IFN）家族在種植體植入后3-4d顯著上調(diào)，到第7d時(shí)，與促炎細(xì)胞因子相關(guān)的基因白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素-1α（interleukin-1α，IL-1α）和有抑炎作用的趨化因子配體18（chemokine (c-c motif) ligand18，CCL18）、趨化因子配體22 (chemokine (c-c motif) ligand 22，CCL22）分別下調(diào)和上調(diào)［13］，而且這種抗炎反應(yīng)可由種植體的表面特性調(diào)節(jié)，比如［14］經(jīng)活性親水SLA(SLActive）處理的種植體與普通SLA種植體相比，其與炎癥細(xì)胞增殖相關(guān)的基因顯著下調(diào)的時(shí)間更早；相較于單純微粗糙表面處理方式，經(jīng)氫氟酸納米涂層處理的種植體周?chē)M織中與抗炎細(xì)胞因子相關(guān)的基因會(huì)顯著上調(diào)［15］。Biguetti等［16］在小鼠口腔種植體骨結(jié)合過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)大量炎性因子的表達(dá)水平在種植后第7d達(dá)到頂峰，其中精氨酸酶1（arginase，ARG1）和白介素10（interleukin-10，IL-10）兩種炎癥因子的表達(dá)正是M2型巨噬細(xì)胞對(duì)于創(chuàng)傷愈合做出的反應(yīng)。Trindade等［7］比較兔股骨鈦種植體組和假手術(shù)組不同時(shí)間點(diǎn)所激活的免疫系統(tǒng)的基因表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)在第10d時(shí)，ARG1在鈦種植體周?chē)@著上調(diào)，提示了M2巨噬細(xì)胞活化。Thalji等［13］采用全基因組微陣列分析發(fā)現(xiàn)雖然兩種處理方式種植體骨整合早期的分子表達(dá)在同一時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著差異，但第7d時(shí)與M2型巨噬細(xì)胞活化相關(guān)的標(biāo)志物較第3d時(shí)明顯上調(diào)，而炎癥反應(yīng)隨之下調(diào)，也提示了M2型巨噬細(xì)胞對(duì)于加速骨整合具有重要意義。Chen等［17］發(fā)現(xiàn)在LPS構(gòu)建的炎癥微環(huán)境中，含Zn涂層的鈦納米管種植體會(huì)使M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)增強(qiáng)，抑制M1型相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)。Li等［18］就發(fā)現(xiàn)硫酸軟骨素/聚多巴胺修飾聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯移植物可以調(diào)控M1型巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)變，促進(jìn)促修復(fù)細(xì)胞因白介素4（interleukin-4，IL-4）、IL-10分泌，通過(guò)改善局部免疫微環(huán)境，引導(dǎo)干細(xì)胞的行為，促進(jìn)新骨形成。

種植體骨結(jié)合早期的免疫反應(yīng)在一定程度上影響后期種植體周?chē)墓怯?，并且這種免疫反應(yīng)受到種植體表面特性的調(diào)控。因此，充分利用巨噬細(xì)胞的可塑性，并進(jìn)行合理的種植體表面修飾可能是改善種植體早期骨結(jié)合的潛在突破點(diǎn)。

2.成骨細(xì)胞基因表達(dá)

在胎兒期及出生后骨形態(tài)發(fā)生和發(fā)育過(guò)程中，可人為的將成骨分化途徑的細(xì)胞分為：未分化間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、成骨祖細(xì)胞、前成骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成熟骨細(xì)胞，但實(shí)際上它們之間并沒(méi)有明顯的區(qū)分界限［19］。在這一過(guò)程中大量細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子通過(guò)Ras/MAPK、TGF-β/BMP和經(jīng)典的Wnt/β-catenin在內(nèi)的一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［20,21］介導(dǎo)MSCs的募集和分化。它們通過(guò)激活runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）、鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子（osterix，Osx）、同源異形框（Dlx3、Dlx5、Msx1、Hox）等基因的表達(dá)促進(jìn)骨特異性基因的轉(zhuǎn)錄，并指導(dǎo)MSCs有序的成骨分化。其中轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osx被認(rèn)為具有“主開(kāi)關(guān)”的作用，是成骨細(xì)胞分化的絕對(duì)要求。

Monjo等［22］報(bào)道了具有中等粗糙表面的鈦種植體的拔出力和貼壁組織面積還有穩(wěn)定的成骨細(xì)胞標(biāo)記基因的mRNA水平呈正相關(guān)。Guo等［23］觀察大鼠脛骨種植體早期骨結(jié)合過(guò)程中的成骨基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)第3d時(shí)Runx2，堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，Alp）表達(dá)明顯上調(diào)，第7d時(shí)除了Runx2，Alp繼續(xù)上調(diào)外，骨涎蛋白（bone sialoprotein，Bsp）的水平也顯著升高。Du等［24］觀察到假手術(shù)組大鼠上頜骨的Alp、骨鈣蛋白（osteocalcin，Ocn）、Ⅰ型膠原（collagen1，Col1）在3-7d顯著上調(diào)，但是雌激素缺乏所致的骨質(zhì)疏松大鼠并沒(méi)有顯示出成骨基因表達(dá)的增加，表明雌激素缺乏在早期愈合反應(yīng)中干擾了成骨細(xì)胞的成骨能力；Bryington等［15］觀察人下頜種植體早期骨結(jié)合過(guò)程中成骨基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)第1d的時(shí)候沒(méi)有明顯骨誘導(dǎo)現(xiàn)象出現(xiàn)，第3d時(shí)骨形態(tài)發(fā)生蛋白6（bone morphogenetic protein6，Bmp6）、骨橋蛋白（osteopontin，Opn）和Osx水平就明顯升高，第7d時(shí)，雖然兩組均有成骨基因的表達(dá)，但酸蝕處理組Osx和Ocn的表達(dá)顯著高于噴砂組。Jimbo［25］也發(fā)現(xiàn)在兔脛骨種植體骨結(jié)合過(guò)程中，第4周時(shí)納米磷酸鈣涂層處理組種植體周?chē)M織中Alp和Ocn的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。Fang 等［26］則證實(shí)了應(yīng)用Ca-antimiR138復(fù)合物修飾種植體表面可使MSCs成骨誘導(dǎo)過(guò)程中ALP活性提高至10倍以上。并且大量研究［27］證實(shí)種植體的納米地貌具有引導(dǎo)MSCs向成骨方向分化的潛力。

也就是說(shuō)成骨細(xì)胞標(biāo)記基因在種植體周?chē)M織表達(dá)的時(shí)間過(guò)程不僅遵循成骨細(xì)胞分化過(guò)程中的時(shí)間基因表達(dá)模式，而且峰值表達(dá)時(shí)間點(diǎn)在一定程度上會(huì)受到種植體類型、材料和表面形貌的影響，其中表觀遺傳調(diào)控、翻譯和翻譯后修飾［28,29］從分子水平上解釋了不同種植體表面處理方式對(duì)成骨基因表達(dá)差異的原因。

3.成骨細(xì)胞外基質(zhì)的分子調(diào)控作用

完全分化的成骨細(xì)胞可分泌細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM)，ECM有利于新骨沉積，是早期骨形成的基礎(chǔ)［30］，主要成分包括各種膠原蛋白（Collegen，COL）和非膠原蛋白（OPN、骨粘連蛋白、OCN、BSP、骨膜蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白-1、層粘連蛋白、整合素等）。而且細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)可作為早期成骨活性的可靠指標(biāo)［31］評(píng)估種植體骨整合效果。

3.1 非膠原蛋白 骨橋蛋白是一種對(duì)于礦化十分重要的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，Donos等［14］發(fā)現(xiàn)其在SLActive種植體植入7d后的周?chē)M織中表達(dá)明顯升高。骨鈣蛋白具有骨特異性，是成骨分化晚期的標(biāo)志ECM蛋白，相較于微粗糙表面種植體，其在經(jīng)氫氟酸納米涂層表面處理的種植體周?chē)M織中表達(dá)更高［15］。Ozawa等［32］觀察到相比于種植體植入前，種植體的植入后會(huì)顯著升高ECM中骨粘連蛋白、骨涎蛋白和整合素的表達(dá)水平。

3.2 膠原蛋白 膠原蛋白約占ECM的90%，其中含量最多的是COL1。由膠原蛋白交聯(lián)而成的膠原纖維決定了骨的生物力學(xué)性能［33］。除膠原蛋白外，與膠原纖維形成、加工和翻譯后修飾相關(guān)的蛋白也與ECM的生成相關(guān)，影響種植體早期骨結(jié)合的機(jī)械強(qiáng)度。

Ozawa等［32］觀察到相比于種植體植入前，植入后會(huì)顯著升高Col1A1，Col3A1的基因表達(dá)水平。Thalji等［13］通過(guò)基因芯片技術(shù)對(duì)人的種植體骨結(jié)合早期分子表達(dá)進(jìn)行評(píng)估時(shí)發(fā)現(xiàn)，與3d時(shí)相比，第7d ECM中的Col1A1，Col1A2，Col3A1，Col6A1，Col6A3以及膠原纖維形成相關(guān)的基因，如熱休克蛋白-47（heat-shock protein-47，Hsp47）、前膠原蛋白c -內(nèi)肽酶增強(qiáng)劑（procollagen C-endopeptidase enhancer，Pcolce），表達(dá)量顯著升高。膠原蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓哪z原纖維需要經(jīng)過(guò)一系列翻譯后修飾，特別是發(fā)生在脯氨酸和賴氨酸殘基上，由脯氨酰4-羥化酶（prolyl-4-hydroxylases，P4H)，脯氨酰3-羥化酶（prolyl-3-hydroxylases，P3H)，或賴氨酰羥化酶（lysyl hydroxylases，LHs）介導(dǎo)的羥基化修飾對(duì)膠原交聯(lián)起著重要作用［34］，在這些生物合成步驟中涉及的任何蛋白質(zhì)都可能影響最終的骨結(jié)合效果。研究發(fā)現(xiàn)［35］編碼P3H的基因突變后會(huì)導(dǎo)致膠原蛋白缺乏羥基化修飾而引起嚴(yán)重的常染色體隱性骨形成不全癥，P4H的雜合錯(cuò)義突變會(huì)造成尖頭多指（趾）并指（趾）畸形［36］。Ogawa等［37］通過(guò)差異顯示PCR法篩選，P4H被鑒定為在種植體植入后顯著性上調(diào)的基因，Thalji等［13］發(fā)現(xiàn)種植體植入7d后編碼LHs的基因表達(dá)水平明顯升高，表明種植體誘導(dǎo)的P4H或LHs的上調(diào)可能有助于膠原交聯(lián)的增加，從而增加種植體周?chē)墙M織的硬度和剛度。表明了調(diào)節(jié)骨膠原基質(zhì)翻譯后修飾的基因網(wǎng)絡(luò)可能在改善種植體周?chē)堑牧W(xué)性能方面發(fā)揮重要作用。

因此成骨ECM蛋白不僅可以作為早期成骨活性的可靠指標(biāo)，而且膠原蛋白通過(guò)交聯(lián)形成的膠原纖維有利于早期骨的成熟，并保證成熟骨組織具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)、良好的強(qiáng)度和彈性。

4.破骨細(xì)胞活性與骨重塑

骨穩(wěn)態(tài)的維持需要成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收之間的平衡調(diào)節(jié)。種植體骨結(jié)合過(guò)程中，成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成作用如第2部分所述，破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收也同樣扮演著非常重要的作用。核因子κB受體活化因子/核因子κB受體活化因子配體/骨保護(hù)素（RANK/RANKL/OPG）是調(diào)控破骨細(xì)胞分化的重要信號(hào)通路，該信號(hào)通路激活時(shí)可以促進(jìn)破骨細(xì)胞向分化［38］。另外，成骨細(xì)胞可通過(guò)RANKL刺激破骨細(xì)胞的活化，還可通過(guò)分泌OPG密切調(diào)控這一過(guò)程［39］。一項(xiàng)采用全基因組微陣列分析人骨整合過(guò)程早期分子表達(dá)的研究［13］發(fā)現(xiàn)，與3d相比，7d時(shí)可降解多種細(xì)胞外基質(zhì)的基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）、破骨細(xì)胞活化標(biāo)志物組織蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）以及抗酒石酸酸性磷酸酶（type 5 acid phosphatase 5，ACP5）明顯升高。另外兩項(xiàng)體內(nèi)研究也報(bào)告了這三者的升高。同樣地，Biguetti等［16］在小鼠口腔種植體骨整合的骨重塑過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)MMPs（MMP1，MMP2，MMP9）、RANKL和OPG表達(dá)在植入種植體后逐漸上調(diào)并在第14d達(dá)到峰值，隨之破骨細(xì)胞數(shù)量逐漸增加。Lenneras等［40］在大鼠脛骨進(jìn)行的一項(xiàng)體內(nèi)研究關(guān)注到了，陽(yáng)極氧化種植體會(huì)比普通機(jī)械加工種植體更早地誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化和隨后更強(qiáng)地骨重塑，從而加速骨-種植體界面的成熟。但是，Thalji［13］同時(shí)發(fā)現(xiàn)MMP抑制劑（TIMP-2，TIMP-3）在種植體表面也有上調(diào)，表明了機(jī)體對(duì)骨吸收過(guò)程的控制。有體外研究［41］發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)人骨髓MSCs7d后，與SLA表面相比，SLActive表面破骨細(xì)胞相關(guān)基因顯著下調(diào)；另外有研究［42］證實(shí)具有槲皮素涂層的種植體具有良好的生物相容性和在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中降低破骨細(xì)胞形成的能力，可用于改善種植體的性能。

總之，這些數(shù)據(jù)證實(shí)了骨結(jié)合的早期階段骨吸收的動(dòng)態(tài)變化，并提出了種植體表面技術(shù)調(diào)節(jié)骨重塑的可能性。

5.總結(jié)

種植體骨結(jié)合早期過(guò)程中的免疫反應(yīng)、成骨相關(guān)基因的時(shí)空表達(dá)、成骨細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)控、破骨細(xì)胞活性改變及骨重塑等分子事件共同作用，形成了調(diào)控早期骨結(jié)合的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，在改善種植體-骨結(jié)合界面的獨(dú)特生物、物理特性方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。但除此之外的血管形成、神經(jīng)生成等骨代謝相關(guān)機(jī)制尚不明確，因此仍需要進(jìn)一步通過(guò)基因組篩選、組學(xué)研究和生物信息學(xué)分析等手段全面了解與種植體骨結(jié)合相關(guān)的分子網(wǎng)絡(luò)，以篩選出可用于改善種植體骨結(jié)合的治療靶點(diǎn)，為提升種植修復(fù)效果提供良好的理論依據(jù)。