CGF在種植中促進(jìn)成骨的研究探討及應(yīng)用進(jìn)展

李 佳 何東寧

隨著種植技術(shù)的不斷發(fā)展，種植已經(jīng)成為修復(fù)牙列缺損的主要方式之一。在牙齒缺失后，牙周組織受損，骨板血運(yùn)系統(tǒng)重建并發(fā)生吸收，軟硬組織會(huì)造成不同程度的缺損。種植手術(shù)時(shí)自體骨移植供區(qū)受限，創(chuàng)傷及并發(fā)癥是其最大缺點(diǎn)，而移植材料存在誘導(dǎo)不一、吸收延遲、成本高、宿主應(yīng)答不良等缺陷［1］。再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展使種植修復(fù)硬組織缺損更加多元化，以移植材料為支架，生長(zhǎng)因子為誘導(dǎo)，可以實(shí)現(xiàn)更加穩(wěn)定的美學(xué)效果。

1.CGF的發(fā)展及生物學(xué)特性

1.1 CGF 的發(fā)展史及制取 富血小板血漿（platelet-rich plasma,PRP）有促進(jìn)血管生成、止血、成骨以及抗感染作用，但需兩次離心以及需要添加凝血酶，可能造成凝血系統(tǒng)紊亂及傳染病的傳播，安全性遭到質(zhì)疑［2］。PRF 是第二代血小板濃縮物，無需添加抗凝劑，通過恒速離心得到的一種可降解的生物支架。隨著制備程序的優(yōu)化,又開發(fā)了加強(qiáng)型血小板纖維蛋白（advanced PRF,APRF）和注射型血小板纖維蛋白（injection PRF,IPRF）。新型的PRF 基質(zhì)中富含白細(xì)胞和血小板,結(jié)構(gòu)更加疏松多孔。CGF 是通過差速離心得到的最新一代血小板濃縮物，幾乎含有離心血液內(nèi)全部的生長(zhǎng)因子，網(wǎng)格結(jié)構(gòu)更加致密，與PRF相比，具有更大的抗張強(qiáng)度、凝集塊及粘稠度，其緩慢釋放生長(zhǎng)因子的過程更接近組織愈合的自然過程。

CGF的制取的設(shè)備尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，目前使用最多的是通過CGF 離心機(jī)中按照CGF 程序離心，離心后血液從上至下明顯分為3 層：1）最上部是貧血小板血清層；2）中間是纖維蛋白凝膠層（CGF 層）；3）底部為含大量紅細(xì)胞的紅細(xì)胞層［3］。

1.2 CGF 的組成及生物學(xué)特性CGF 是一種包含血小板及各種高濃度生長(zhǎng)因子的纖維蛋白網(wǎng)狀支架，其中有血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet-derived growthfactor，PDGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endonthelial growth factor，VEGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）、轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子-β（tranfer growth factor-β，TGF-β）、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、類胰島素生長(zhǎng)因子（insulin-like growth factor，IGF)［4］。有研究表示：基質(zhì)、血小板定位于近端表面及其下方，TGF-β1 集中在血漿蛋白層的另一個(gè)表面，大多數(shù)白細(xì)胞被定位在血漿蛋白層，PDGF-BB 在CGF基質(zhì)中呈彌散分布［5］。

PDGF 是一種含五種以上異/同型二聚體的蛋白家族East-2型聚合物的蛋白質(zhì)［6］，促進(jìn)停滯成骨細(xì)胞有絲分裂；還可促進(jìn)成骨細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+濃度的增加，誘發(fā)鈣振蕩，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的分化與凋亡。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)PDGF 可以趨化細(xì)胞聚集，激活PDGF-RB 受體，促進(jìn)MC3T3-E1 細(xì)胞的成骨分化和礦化結(jié)節(jié)形成［7，8］。

TGF-β 是一類多功能蛋白多肽，［9］經(jīng)典的TGF-β 通路通過細(xì)胞膜上特定的兩種受體的跨膜異二聚體復(fù)合物來傳遞信號(hào)，促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖與早期分化［10］，并刺激成纖維細(xì)胞形成膠原蛋白，促進(jìn)骨頭和軟骨的形成［11］。IGF-1 是一種單鏈多聚蛋白，可以正向調(diào)控大多數(shù)細(xì)胞的增殖和分化。VEGF、FGF 以及EGF 都與軟組織的愈合及再生有著密切關(guān)系。VEGF 調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖和分化，在促進(jìn)血管生成中發(fā)揮著重要作用。

BMPs家族有40多種成員，其中BMP-2 是TGF-13 超家族中的多功能細(xì)胞因子，可促進(jìn)細(xì)胞增殖，提高AKP 活性，是公認(rèn)的與成骨密切相關(guān)的基因。［12］

CGF 中還檢測(cè)到白細(xì)胞和CD4+細(xì)胞［13］，炎癥反應(yīng)主要是白細(xì)胞遷移至受損區(qū)域，單核巨噬細(xì)胞取代白細(xì)胞，淋巴細(xì)胞與漿細(xì)胞參與特異性免疫反應(yīng)。但到目前為止，尚未見關(guān)于CGF 中CD34+細(xì)胞的臨床應(yīng)用，尚需要進(jìn)一步的研究。

2.CGF促進(jìn)成骨的潛能及影響因素

2.1 CGF促進(jìn)成骨的實(shí)驗(yàn)研究 有學(xué)者在兔子顱骨中制造15mm×10mm 大小的缺陷，分別用濃縮生長(zhǎng)因子（CGF）充填和空白組對(duì)照比較，術(shù)后從影像學(xué)和組織形態(tài)學(xué)分析缺損處新生骨質(zhì)密度和骨量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的骨密度和骨量均高于對(duì)照組［1］。這說明CGF 有一定的成骨能力，但另一實(shí)驗(yàn)［14］將CGF 填入種植體-骨間隙中，結(jié)果顯示對(duì)新骨再生有極小的促進(jìn)作用。因此，并不推薦將CGF單獨(dú)應(yīng)用于成骨。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，以CGF 混合骨替代品與單純使用骨替代品作比較，結(jié)果顯示，CGF 混合骨替代品新骨形成時(shí)間早、成骨率高、骨結(jié)合時(shí)間短。

2.2 促進(jìn)成骨的影響因素

2.2.1 CGF的使用形式 濃縮生長(zhǎng)因子可直接使用，也可將其制作成適當(dāng)直徑的顆粒，單獨(dú)或與其它材料混合使用，還可將其壓制成濃縮生長(zhǎng)因子膜來使用。不同壓膜方法并不顯著影響生長(zhǎng)因子釋放及降解［15］。另外，CGF液可能也具有促進(jìn)成骨效果。有學(xué)者比較了CGF 液聯(lián)合骨替代材料與單獨(dú)使用骨替代材料應(yīng)用于前牙區(qū)引導(dǎo)骨組織再生的效果［16］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者可形成更多的骨量。當(dāng)然，這一實(shí)驗(yàn)樣本量不夠大，觀察時(shí)間不足，結(jié)論仍需進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，但也給臨床手術(shù)中CGF 的使用提供一個(gè)可行方案。

2.2.2 CGF 的降解問題CGF 發(fā)揮作用主要是依靠釋放生長(zhǎng)因子，其釋放基本在應(yīng)用后的28d內(nèi)完成，TGF-β1、b-FGF 和C5a 在14d 時(shí)明顯上升，其余生長(zhǎng)因子則在28d 內(nèi)緩慢上升［17］。在一體外降解實(shí)驗(yàn)中，將CGF 制成膜狀及塊狀，分別浸泡于人工唾液中，結(jié)果表明，膜狀比塊狀降解速率快［18］。而另一實(shí)驗(yàn)?zāi)M相同性狀下CGF 的降解速率，結(jié)果顯示，在模擬唾液中的降解速率高于在模擬體液中［19］。因此，濃縮生長(zhǎng)因子的降解速率主要和其纖維蛋白含量及環(huán)境有關(guān)，但具體機(jī)制仍不明確，且CGF 降解的研究均局限于模擬環(huán)境中，無法反映在人體內(nèi)CGF真實(shí)降解過程。

2.2.3 CGF 的劑量問題 在一些研究中，考慮到CGF 中TGF-β、IGF、VEGF 和PDGF 的含量較高對(duì)細(xì)胞增殖和分化有重要影響，這些研究大多報(bào)告了細(xì)胞的增殖以劑量依賴的方式。然而，研究表明，高劑量的CGF 并沒有產(chǎn)生積極的效果。在Honda 等［20］人的研究中，濃度為1-10%的CGF 提取物對(duì)細(xì)胞增殖有積極作用且以劑量依賴的方式分化，而高濃度（20%）有抑制作用。Chen等［21］人通過研究5%、10%、20%和40%的CGF的作用，證明在10%CGF 中有更多的增殖和分化。但是目前，在臨床使用中，仍沒有對(duì)CGF 的劑量問題做出統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

2.2.4 外源刺激因素 在CGF 的產(chǎn)生過程中，體外外源性刺激容易損傷血小板。有研究表明，采集試管的組成和形狀可能影響CGF。實(shí)驗(yàn)分別采用無菌真空管、圓底玻璃管、錐底玻璃管制備CGF。結(jié)果表明：使用玻璃管可以獲得更大、更重、更厚的CGF，而圓底和錐底得到的差別不大，這可能是由于纖維蛋白募集量的增加，從而導(dǎo)致更廣泛的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)和更多的血漿捕獲在玻璃管中，血液在采集后幾乎立即開始凝結(jié)，因此樣本應(yīng)迅速地離心，以避免纖維蛋白的擴(kuò)散聚合［22］。另外，如采血時(shí)間過長(zhǎng)、抖動(dòng)程度、放置時(shí)間過長(zhǎng)等，所有這些都會(huì)影響濃度的有效生長(zhǎng)。因此在制備CGF 時(shí)應(yīng)迅速，避免抖動(dòng)，及時(shí)制備與使用。

3.種植硬組織增量中的應(yīng)用

3.1 在種植窩預(yù)備中的應(yīng)用 微粗糙表面的種植體可以提高種植體穩(wěn)定系數(shù)（implant stability quotient，ISQ）ISQ 值，多年來，大量研究已經(jīng)探討了結(jié)合生長(zhǎng)因子的種植體表面設(shè)計(jì)，結(jié)果各異。一些研究表明，利用細(xì)胞黏附因子或BMP 能增加成骨細(xì)胞的分化和功能性骨結(jié)合，并提高BIC 種植體骨結(jié)合率（bone-implant contact，BIC）值。CGF可以在傷口及種植窩洞內(nèi)提供血小板和白細(xì)胞，并在局部釋放生長(zhǎng)因子，通過吸收未分化的內(nèi)皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞加速受損部位愈合。Pirpir［23］等將在種植體的植入時(shí)先襯CGF膜，可提高ISQ值。說明濃縮生長(zhǎng)因子可有效促進(jìn)骨結(jié)合，維護(hù)種植體穩(wěn)定性。另外，有研究報(bào)告［24］表明，在種植體表面涂布PRF 液，可在愈合早期增加ISQ 值，但目前還未有將CGF 液涂布在種植體表面的研究，這也為以后CGF的進(jìn)一步研究提高新思路。

3.2 引導(dǎo)骨再生術(shù) 引導(dǎo)性骨增量術(shù)是種植中獲得骨增量的一種重要手段，其關(guān)鍵因素為骨代材料和屏障膜。一個(gè)臨床試驗(yàn)［25］中，40例頜骨缺損患者被分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組：試驗(yàn)組采用CGF 聯(lián)合Bio-Oss 骨粉，對(duì)照組單獨(dú)使用Bio-Oss 骨粉。結(jié)果顯示試驗(yàn)組骨鈣素水平均顯著高于對(duì)照組、骨缺損區(qū)骨密度也明顯高于對(duì)照組。在另一GBR 實(shí)驗(yàn)［26］中，比較實(shí)驗(yàn)組（濃縮生長(zhǎng)因子+骨粉+膠原膜）和對(duì)照組（骨粉+膠原膜），研究結(jié)果顯示CGF可獲得更高的一期愈合率和良好的新骨形成。但是CGF的成骨效果有限，Durmu?lar等［27］的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CGF 與骨移植物聯(lián)合使用，可增強(qiáng)成骨相關(guān)基因的表達(dá)，最終促進(jìn)種植體周圍直徑約2.37mm 的骨再生。因此，建議將CGF 和骨移植材料聯(lián)合應(yīng)用于骨缺損直徑＜2.37mm 種植位點(diǎn)引導(dǎo)骨再生。比較脫細(xì)胞真皮基質(zhì)及CGF 在引導(dǎo)骨再生中的效果，結(jié)果顯示CGF 對(duì)于骨密度的改善明顯更佳［17］。

3.3 上頜竇提升術(shù) 在解決上頜后牙區(qū)種植骨量嚴(yán)重不足時(shí)，上頜竇提升術(shù)是一種常用手段。Sohn 等［28］將CGF 單獨(dú)用于上頜竇提升術(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上頜竇內(nèi)新骨形成，骨密度較好。在上頜竇牙槽骨剩余骨高度（2mm-4mm）嚴(yán)重不足時(shí)，CGF應(yīng)用于改良上頜竇竇底抬高并同時(shí)進(jìn)行短種植體植入，結(jié)果顯示可以得到良好的臨床效果，也為上頜竇牙槽骨剩余骨量嚴(yán)重不足的病例提供一個(gè)更加優(yōu)異的方案［29］。

3.4 治療種植體周圍炎CGF內(nèi)含有大量生長(zhǎng)因子，可刺激成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的活性，加速血管生成，可有效促進(jìn)種植體周圍軟、硬組織的再生。采用CGF+牛多孔骨礦（BPBM）或單獨(dú)應(yīng)用BPBM 處理牙周炎骨缺損。術(shù)后1年評(píng)估探查深度、臨床附著水平，CGF+BPBM 在降低探診深度和臨床附著水平增加方面比BPBM 更有效。CGFs的加入顯著提高了BPBM 治療牙周炎缺損的臨床療效，但需要更多的研究來更好地驗(yàn)證這種效果［30］。

濃縮因子作為最新一代的血小板濃縮物，用于口腔種植的硬組織增量中，可以增強(qiáng)骨結(jié)合率，提高ISQ 值，建議與骨替代材料聯(lián)合使用。但是目前在臨床中，CGF 的制取并沒有一個(gè)恒定的標(biāo)準(zhǔn)，不同的制取方式以及在CGF 的使用中一些人為的差異均可影響其促進(jìn)成骨的效果。關(guān)于CGF 的很多研究依然是在模擬環(huán)境中，與口腔真實(shí)環(huán)境還有較大差異。另外，關(guān)于CGF 促進(jìn)成骨效果的樣本量不足，缺乏關(guān)于長(zhǎng)期效果類的臨床實(shí)驗(yàn)，這些依然需要我們進(jìn)行進(jìn)一步探究。