ERα基因單核苷酸多態(tài)性與乳腺癌內(nèi)分泌治療藥物引發(fā)子宮內(nèi)膜病變相關(guān)性*

盛佳鈺，李春陽(yáng)，江科，薛曉紅

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院乳腺病科，上海 200437)

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤之一，50%～60%乳腺癌患者屬于激素依賴型[1]，該類型乳腺癌患者保留全部或部分激素受體及其功能，其發(fā)生和發(fā)展受內(nèi)分泌的影響及調(diào)控。針對(duì)激素受體陽(yáng)性的乳腺癌患者，內(nèi)分泌治療是常見的治療方式。作為一線內(nèi)分泌治療藥物——選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)藥(selective estrogen receptor modulators，SERMs)，他莫昔芬(tamoxifen)、枸櫞酸托瑞米芬(toremifene)在抑制雌激素受體(estrogen receptor，ER)陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)，卻刺激ER陽(yáng)性的子宮內(nèi)膜細(xì)胞增生，子宮內(nèi)膜腺體表現(xiàn)囊性擴(kuò)張樣水腫或形成息肉，間質(zhì)膠原豐富，而腺上皮細(xì)胞萎縮或化生，使子宮內(nèi)膜呈現(xiàn)出了息肉-增生-惡性變等多樣的變化[2]。對(duì)于內(nèi)分泌治療藥物引起的子宮內(nèi)膜病變，臨床常采用診斷性刮宮治療，目前尚缺乏有效而無創(chuàng)的治療方法，往往導(dǎo)致患者治療依從性差。在臨床實(shí)踐中，筆者發(fā)現(xiàn)同期應(yīng)用內(nèi)分泌藥物治療的乳腺癌患者，其子宮內(nèi)膜病變表現(xiàn)參差不齊。

雌激素主要通過與α受體結(jié)合發(fā)揮作用，雌激素受體α(ERα)的基因多態(tài)性可以改變雌激素受體的表達(dá)水平及功能，從而影響雌激素的生物學(xué)效應(yīng)。眾多研究均表明[3-5]，ERα基因(主要是第一內(nèi)含子上兩個(gè)限制性片段rs9340799、rs2234693)多態(tài)性與發(fā)生子宮內(nèi)膜病變的風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。因此，本研究將探索 rs9340799、rs2234693位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNPs)與他莫昔芬引起的子宮內(nèi)膜病變的相關(guān)性，試圖從中篩選出容易發(fā)生藥物性子宮內(nèi)膜病變的基因類型，以盡早預(yù)防乳腺癌內(nèi)分泌治療藥物引起的子宮內(nèi)膜病變的發(fā)生并為絕經(jīng)前乳腺癌患病群體的精準(zhǔn)治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1臨床資料 所有病例來自上海中藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院乳腺病科2018年3—9月期間門診及住院的乳腺癌患者，共164例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①長(zhǎng)期居住在長(zhǎng)三角地區(qū)組患者之間無親緣關(guān)系；②符合乳腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)病理細(xì)胞學(xué)診斷證實(shí)；③進(jìn)行他莫昔芬或托瑞米芬藥物治療>1年的患者；④完成知情同意及相關(guān)告知。排除標(biāo)準(zhǔn)：①無明確乳腺癌病理診斷者；②子宮、卵巢切除者或使用促黃體生成素釋放激素類似物者；③合并子宮內(nèi)膜基礎(chǔ)疾病者及心血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病者；④曾經(jīng)發(fā)生過子宮內(nèi)膜不良事件者；⑤未完成知情同意及相關(guān)告知。164例患者平均年齡(46.85±5.90)歲；接受內(nèi)分泌治療1～2年、>2～3年、>3～4年、>4～5年及>5年分別有68，46，23，18，9例；其中病理診斷為浸潤(rùn)性癌的139例，原位癌25例；使用他莫昔芬78例，枸櫞酸托瑞米芬86例。各基因型組臨床資料基線均衡，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2ERα基因SNPs 位點(diǎn)檢測(cè) 所有入組對(duì)象均抽取清晨空腹外周靜脈血2 mL，置于無菌無酶的乙二胺四乙酸抗凝試管，存放于-20 ℃環(huán)境。引物均由生工生物工程(上海)有限公司設(shè)計(jì)并合成，如下：rs9340799-FO 5′-GCAGGCTGGGCTCAAACTA-3′，rs9340799-RO 5′-CTTTCATTACCTCTTGCCGTCT-3′，rs2234693-F 5′-ATCCAGGGTTATGTGGCAAT-3′，rs2234693-R 5′-CTAATAGACTTAATGTTTTTGCAGG-3′。

對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中基因組DNA模板1 μL，巢式引物Fi 0.5 μL，巢式引物Ri 0.5 μL，dNTP混合物(10 mmol·L-1)0.5 μL，Taq反應(yīng)緩沖液2.5 μL，Taq酶(5 U·μL-1) 0.2 μL，水20 μL。PCR反應(yīng)體系首先在95 ℃預(yù)變性3 min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增(每個(gè)循環(huán)包括 94 ℃變性30 s、58 ℃退火 30 s、72 ℃ 延伸30～60 s)，循環(huán)完畢后進(jìn)行72 ℃ 修復(fù)延伸 10 min。

PCR產(chǎn)物送于生工(上海)生物工程有限公司進(jìn)行單向測(cè)定，測(cè)序儀型號(hào)為 3730XL (美國(guó) ABI)，結(jié)果使用Chromas 軟件分析，見圖 1。

圖1 ERα基因位點(diǎn)測(cè)序圖 Fig.1 Sequencing map of ERα gene site

1.3子宮內(nèi)膜病變觀察 B超檢查觀察子宮內(nèi)膜厚度，統(tǒng)計(jì)行陰道診刮患者例數(shù)，計(jì)算子宮內(nèi)膜診刮率。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 21.0版 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用PLINK -doc -1.04 對(duì)患者測(cè)序結(jié)果進(jìn)行 Hardy -Weinberg 遺傳基因分布平衡檢驗(yàn)。各基因亞型組間的計(jì)量和計(jì)數(shù)資料差異比較采用方差分析和卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1ERα基因rs9340799、rs2234693位點(diǎn)基因型和等位基因分布 164例患者中，ERα基因rs9340799位點(diǎn)，A、G等位基因的分布頻率分別為79%和21%；其中A/A型實(shí)際頻數(shù)106例，A/G型48例，G/G型10例(P>0.05)。ERα基因rs2234693位點(diǎn)中C、T等位基因的分布頻率為42% 和 58%； 其中C/C型實(shí)際頻數(shù)為32例、C/T型為74例、T/T型為58例(P>0.05)，說明樣本具有群體代表性。

2.2ERα基因SNPs與子宮內(nèi)膜厚度及內(nèi)膜診刮比例的關(guān)系 比較 ERα基因rs9340799位點(diǎn)各基因型患者間子宮內(nèi)膜厚度的差異，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的3種基因型(A/A、A/G、G/G)組間子宮內(nèi)膜厚度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.382 0，P<0.05)；在G顯性模式下，即A/G、G/G基因型患者子宮內(nèi)膜厚度[(9.63±3.53) mm、(9.00±0.89) mm]均高于A/A基因型患者[(7.73±3.04) mm]。而A/G基因型比A/A基因型患者子宮內(nèi)膜更厚(F=3.614 0，P<0.05)。比較 ERα基因rs2234693位點(diǎn)各基因型患者間子宮內(nèi)膜厚度的差異，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的3種基因型(C/C、C/T、T/T)組間子宮內(nèi)膜厚度值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 ERα基因SNPs與子宮內(nèi)膜厚度的關(guān)系 Tab.1 Relationship between SNPs of ERα gene and endometrial thickness

比較 ERα基因rs9340799位點(diǎn)各基因型患者間子宮內(nèi)膜診刮比例的差異，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的3種基因型(A/A、A/G、G/G)組間子宮內(nèi)膜診刮比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.750 0，P<0.05)。其中，A/G基因型患者子宮內(nèi)膜診刮比例(45.83%)高于A/A及G/G基因型患者(15.09%，0.00%)(χ2=16.800 0，7.384 0，P<0.01)。 較ERα基因rs2234693位點(diǎn)各基因型患者間子宮內(nèi)膜診刮比例的差異，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的3種基因型(C/C、C/T、T/T)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 ERα基因 SNPs 與子宮內(nèi)膜診刮比例的關(guān)系 Tab.2 Relationship between SNPs of ERα gene and endometrial diagnostic curettage rate

2.3ERα基因SNPs 與不同內(nèi)分泌藥物治療患者子宮內(nèi)膜厚度及內(nèi)膜診刮比例的關(guān)系 根據(jù)患者服用藥物不同，將患者分為他莫昔芬組和枸櫞酸托瑞米芬組，比較 ERα基因rs9340799位點(diǎn)及rs2234693位點(diǎn)各基因型患者間子宮內(nèi)膜厚度及診刮比例的差異是否與服用的內(nèi)分泌藥物種類有關(guān)。發(fā)現(xiàn)同一基因型患者，不同藥物組間無論是子宮內(nèi)膜厚度還是診刮次數(shù)均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

但是，在接受枸櫞酸托瑞米芬治療的患者中，子宮內(nèi)膜厚度與 rs9340799位點(diǎn)SNPs存在相關(guān)性，A/G基因患者的子宮內(nèi)膜厚度較純合基因型A/A、G/G型厚(F=1.553 0，P<0.05)，見表3。且無論是他莫昔芬還是枸櫞酸托瑞米芬組，rs9340799 位點(diǎn)SNP與內(nèi)膜診刮率均呈顯著相關(guān)性(χ2=13.690 0，16.850 0，P<0.01)，見表4。

表3 ERα基因 SNPs 與不同內(nèi)分泌藥物子宮內(nèi)膜厚度的關(guān)系 Tab.3 Relationship between SNPs of ERα gene and endometrial thickness in patients treated with different endocrine drugs

表4 ERα基因 SNPs 與不同內(nèi)分泌藥物治療患者子宮內(nèi)膜診刮率的關(guān)系 Tab.4 Relationship between SNPs of ERα gene and endometrial scraping rate in patients treated with different endocrine drugs

2.4ERα基因SNPs與首次子宮內(nèi)膜診刮時(shí)間的關(guān)系 根據(jù)接受內(nèi)分泌藥物治療發(fā)生首次子宮內(nèi)膜診刮時(shí)間將受試者分為1年以下、1年及以上兩組，分別分析首次發(fā)生子宮內(nèi)膜診刮的時(shí)間與ERα基因SNPs的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)首次子宮內(nèi)膜診刮時(shí)間與rs9340799位點(diǎn)SNPs存在顯著相關(guān)性(χ2=27.160 0，P<0.01)。同一基因型患者間比較，A/G基因型患者1年內(nèi)出現(xiàn)內(nèi)膜診刮事件數(shù)明顯多于1年以上者(χ2=4.724 0，P<0.05)，見表5。

表5 ERα基因SNPs與首次子宮內(nèi)膜診刮時(shí)間的關(guān)系 Tab.5 Relationship between SNPs of ERα gene and the time of first endometrial scraping

3 討論

他莫昔芬及枸櫞酸托瑞米芬在抑制ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)，也刺激ER陽(yáng)性子宮內(nèi)膜細(xì)胞增生。有研究報(bào)道[6]，乳腺癌患者手術(shù)后口服他莫昔芬引起子宮內(nèi)膜息肉及子宮內(nèi)膜增生的發(fā)病率分別為5%～35%及4.7%～16%，而子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率為0.8%～5%。由此可見，SERMs對(duì)不同靶器官具有不同的作用，在乳腺腫瘤組織中發(fā)揮抗雌激素作用，而對(duì)子宮內(nèi)膜則表現(xiàn)為弱雌激素樣作用，能引起一系列子宮內(nèi)膜病變。對(duì)于此類乳腺癌內(nèi)分泌治療引起的藥物性子宮內(nèi)膜病變，孕激素治療的安全性仍存疑慮，因此，臨床上絕大多數(shù)的患者和醫(yī)生都會(huì)選擇通過暫時(shí)停止內(nèi)分泌治療及刮宮來明確診斷并降低子宮內(nèi)膜厚度[7]。在近10年的內(nèi)分泌藥物治療過程中，許多乳腺癌患者常常需經(jīng)歷數(shù)次的刮宮治療，有創(chuàng)性操作嚴(yán)重影響患者內(nèi)分泌治療的依從性。

然而并不是每一例服用SERMs藥物的乳腺癌患者均會(huì)發(fā)生子宮內(nèi)膜病變，即使發(fā)生內(nèi)膜病變，在內(nèi)分泌藥物使用時(shí)間相同的情況下，患者內(nèi)膜增厚及病變的程度也差異巨大。早期將這種情況的解釋歸于個(gè)體對(duì)于內(nèi)分泌調(diào)節(jié)功能的差異，近年來，遺傳因素受到人們的重視和認(rèn)可。雌激素主要通過與α受體結(jié)合發(fā)揮作用，ERα的基因多態(tài)性可以改變雌激素受體的表達(dá)水平及功能，從而影響雌激素的生物學(xué)效應(yīng)。本研究探索他莫昔芬或枸櫞酸托瑞米芬內(nèi)分泌治療(>1年)的乳腺癌患者ERα基因 rs9340799、rs2234693位點(diǎn) SNPs 與藥物引起的子宮內(nèi)膜病變的相關(guān)性，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ERα基因rs9340799位點(diǎn)3個(gè)亞型(A/A、A/G、G/G)患者的子宮內(nèi)膜厚度值及陰道診刮比例比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，A/G基因型患者子宮內(nèi)膜平均厚度和陰道診刮比例均高于A/A及G/G基因型患者(P<0.05)。而ERα基因rs2234693位點(diǎn)的3個(gè)基因亞型(T/T、C/T、C/C)患者的子宮內(nèi)膜厚度及陰道診刮比例均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。進(jìn)一步本研究還發(fā)現(xiàn)，他莫昔芬和枸櫞酸托瑞米芬兩種不同的SERMs藥物所引起的子宮內(nèi)膜增厚及陰道診刮比例并無明顯差異。但是，在接受枸櫞酸托瑞米芬治療的受試者中，子宮內(nèi)膜厚度與 rs9340799位點(diǎn)SNPs存在相關(guān)性(P<0.05)。且無論是他莫昔芬組還是枸櫞酸托瑞米芬組，rs9340799 位點(diǎn)SNPs與內(nèi)膜診刮數(shù)均呈顯著相關(guān)性(P<0.01)?？梢姡珽Rα基因rs9340799位點(diǎn)A/G亞型患者時(shí)子宮內(nèi)膜病變的高發(fā)人群。此外，還發(fā)現(xiàn)首次子宮內(nèi)膜診刮時(shí)間與rs9340799位點(diǎn)SNPs存在顯著相關(guān)性(P<0.01)。同一基因型患者間比較，A/G基因型患者1年內(nèi)出現(xiàn)內(nèi)膜診刮事件數(shù)明顯多于1年以上者(P<0.05)。由此可見，他莫昔芬和枸櫞酸托瑞米芬引起的子宮內(nèi)膜病變基本相同，因此，臨床上當(dāng)患者出現(xiàn)子宮內(nèi)膜增厚的情況時(shí)，進(jìn)行兩種藥物間的更換意義不大。而攜帶有子宮內(nèi)膜病變易感型基因——A/G基因的患者，其子宮內(nèi)膜事件發(fā)生時(shí)間較早(多在1年內(nèi))，臨床可以針對(duì)該部分患者進(jìn)行中醫(yī)藥的預(yù)防干預(yù)，或者提前予以卵巢去勢(shì)。

既往研究主要集中于自然內(nèi)分泌失調(diào)導(dǎo)致雌激素水平異常的女性人群[3，8]，鮮少涉及藥物引起雌激素水平改變所致的子宮內(nèi)膜病變與ERα基因多態(tài)性的關(guān)系，它與自然雌激素水平改變所導(dǎo)致的子宮內(nèi)膜病變是否存在差異也無從考證。本研究發(fā)現(xiàn)，ERα基因rs9340799位點(diǎn)A/G亞型患者是SERMs藥物引起子宮內(nèi)膜病變的高發(fā)人群。但與GEORGOPOULOS等[9]的研究結(jié)果不一致。進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，針對(duì)不同人群開展的研究，其結(jié)果也存在諸多不一致[3]。分析原因，主要考慮由于人種及地區(qū)的差異導(dǎo)致的雌激素受體基因表達(dá)呈現(xiàn)明顯的差異。所以本研究將目標(biāo)人群限定為長(zhǎng)期生活在長(zhǎng)三角地區(qū)的無親緣關(guān)系的乳腺癌患者，從一定程度上規(guī)避了因人種、地區(qū)差異引起的基因改變。但在整個(gè)研究過程中，有32例患者月經(jīng)不定期，甚至長(zhǎng)期不來潮，行婦科B超檢查的時(shí)間較難把握，可能造成子宮內(nèi)膜厚度檢測(cè)的偏差。由于本次研究所收集的病例數(shù)較少，不適合進(jìn)行分層分析，下一步研究中，將擴(kuò)大樣本量，按月經(jīng)情況進(jìn)行分層分析，將進(jìn)一步消除由于婦科B超檢測(cè)時(shí)間造成的誤差。