無創(chuàng)產(chǎn)前檢測技術(shù)在胎兒染色體拷貝數(shù)變異中的應(yīng)用

譚玲瓏 黃婷婷 黎俏 鄒永毅 劉艷秋

江西省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，江西省出生缺陷防治管理中心，江西省出生缺陷防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（南昌 330006）

據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國新生兒出生缺陷發(fā)生率約為5.6%，隨著出生人口的增加及孕婦高齡化，缺陷出生兒的病例總數(shù)也在逐年上升，其中染色體異常是導(dǎo)致新生兒出生缺陷的重要原因之一。目前臨床上應(yīng)用廣泛的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測（non-invasive prenatal test，NIPT）技術(shù)可以在產(chǎn)前篩查出染色體異常胎兒，對降低出生缺陷率有很大的幫助。NIPT 是通過抽取母體外周血，對孕婦血漿中胎兒游離DNA 進(jìn)行高通量測序的技術(shù)，用于篩查胎兒21 三體、18 三體、13 三體綜合征的臨床價(jià)值已得到肯定，可較好避免部分異常胎兒的出生［1］。隨著NIPT技術(shù)的發(fā)展，臨床上NIPT可篩查出其他染色體的非整倍體變異及拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNVs）［2］，當(dāng)NIPT 提示胎兒CNVs 時(shí)建議行羊膜腔穿刺術(shù)和染色體分析進(jìn)一步明確診斷。最常用的方法主要是染色體微陣列分析技術(shù)（chromosomal microarray analysis，CMA），CMA 技術(shù)可以檢測全基因組水平染色體拷貝數(shù)變異［3］，還可檢測嵌合體、雜合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）及部分單親二倍體（uniparental disomy，UPD）等，較傳統(tǒng)染色體核型分析可額外發(fā)現(xiàn)6%～15%的染色體微小變異［4］。本研究通過對NIPT 提示胎兒染色體拷貝數(shù)變異的孕婦行羊膜腔穿刺術(shù)，提取羊水細(xì)胞同時(shí)行染色體核型分析及CMA 驗(yàn)證NIPT 結(jié)果［5］，以確定染色體是否異常及異常片段大小，從而探討NIPT 在胎兒染色體拷貝數(shù)變異中的應(yīng)用價(jià)值，并評估NIPT 篩查染色體微缺失、微重復(fù)的準(zhǔn)確性。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2019 年1 月至2021 年1 月在江西省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心就診，因NIPT 結(jié)果提示除21、18、13 號染色體及性染色體異常外其他染色體拷貝數(shù)變異的樣本114 例，均行羊膜腔穿刺手術(shù)，孕婦年齡20～43 歲，妊娠周數(shù)18～24 周，術(shù)前均簽署產(chǎn)前診斷知情同意書，明確手術(shù)流程、手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)及染色體核型分析技術(shù)、CMA技術(shù)的意義、局限性。所有標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行染色體核型分析和CMA 分析。根據(jù)檢測結(jié)果，部分夫婦行外周血染色體核型分析及CMA，與胎兒結(jié)果進(jìn)行比對。最后對所有孕婦妊娠結(jié)局進(jìn)行隨訪登記。

1.2 方法

1.2.1 NIPT 檢測孕婦簽署知情同意書后，采集外周血5 mL，分離血漿，按照SOP 操作要求提取游離DNA 后進(jìn)行文庫構(gòu)建和上機(jī)測序，最后進(jìn)行DNA 檢測與數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)結(jié)果判斷用Z 值來表示，Z 值在-3.0～3.0 表示低風(fēng)險(xiǎn)結(jié)果，Z 值≥3 提示高風(fēng)險(xiǎn)建議行羊膜腔穿刺術(shù)進(jìn)一步診斷。

1.2.2 羊膜腔穿刺術(shù)所有孕婦簽署手術(shù)知情同意書，行無菌消毒，于18～28 周在B 超引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)，術(shù)中對胎兒、胎盤進(jìn)行定位，避開損傷胎兒、胎盤的位置進(jìn)針，無菌抽取30 mL 羊水，其中20 mL 羊水進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，10 mL 羊水進(jìn)行CMA 檢測。

1.2.3 染色體核型分析羊水細(xì)胞培養(yǎng)后，收細(xì)胞，制片，G 顯帶。每例標(biāo)本計(jì)數(shù)20 個(gè)中期分裂象，分析5 個(gè)核型，當(dāng)發(fā)現(xiàn)嵌合體或異常核型時(shí)，加倍計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目。核型命名根據(jù)人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制（ISCN2016）標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 染色體微陣列分析采用美國Affy-metrix公司750K 芯片試劑盒及美國Clontech 公司DNA擴(kuò)增試劑盒，NspI 酶隨機(jī)消化DNA 為短片段，連接補(bǔ)齊消化后產(chǎn)物末端，PCR 擴(kuò)增，利用磁珠法純化、片段化，將產(chǎn)物標(biāo)記，與芯片雜交后洗片、染色，掃描獲取數(shù)據(jù)。并進(jìn)一步采用Chas v4 軟件進(jìn)行分析及結(jié)果判讀。

2 結(jié)果

2.1 NIPT 結(jié)果本研究選取的114 個(gè)病例中，NIPT 提示胎兒拷貝數(shù)缺失45 例，拷貝數(shù)重復(fù)65例，拷貝數(shù)缺失合并重復(fù)4 例。染色體缺失、重復(fù)片段大小方面，CNVs ＞10 Mb 77 例（67.54%），CNVs ≤10 Mb 37例（32.46%）。見表1。

表1 NIPT 篩查染色體缺失、重復(fù)的片段大小Tab.1 Segment size of chromosome deletion and duplication screened by NIPT例

2.2 羊水細(xì)胞染色體核型分析結(jié)果在114例行羊水細(xì)胞染色體核型分析病例中，確診異常17 例，異常檢出率為14.9%（17/114）。其中，染色體核型分析結(jié)果與CMA 結(jié)果比較，另檢出3 例異常，1 例（例24）為染色體復(fù)雜平衡易位；1 例（例23）核型47，XN，+9［4］/46，XN［59］為低比例嵌合；1 例（例25）為21 號染色體隨體延長考慮多態(tài)性。見表2～5。

表2 胎兒染色體核型分析和CMA 均為異常結(jié)果比較Tab.2 Chromosome karyotype analysis and CMA were abnormal results

表3 胎兒染色體核型分析異常結(jié)果和CMA 正常結(jié)果比較Tab.3 Comparison of abnormal results of fetal chromosome karyotype analysis and normal results of CMA

表4 胎兒CMA 意義不明結(jié)果分析Tab.4 Analysis of fetal CMA with unknown significance

表5 胎兒染色體核型分析正常結(jié)果和CMA 異常結(jié)果比較Tab.5 Comparison of normal results of fetal chromosome karyotype analysis and abnormal results of CMA

2.3 羊水細(xì)胞CMA 檢測結(jié)果114 例NIPT 提示染色體拷貝數(shù)變異的孕婦，CMA 檢測確診異常34 例，符合率29.82%（34/114），其中致病性變異21 例，可能致病變異1 例，意義不明確變異12 例，見表2～5。

2.4 后期隨訪結(jié)果對114 例行產(chǎn)前診斷孕婦進(jìn)行了隨訪，21 例CMA 結(jié)果提示致病性變異，其中19 例夫妻雙方經(jīng)知情同意后選擇了引產(chǎn)，2 例已正常出生，家長代述均生長發(fā)育正常；1 例CMA 結(jié)果提示為可能致病變異胎兒已正常出生；12 例CMA 結(jié)果提示為臨床意義不明確變異，其中2 例胎兒已引產(chǎn)，8 例胎兒已出生，家長代訴孩子體檢均未見異常，2 例正常妊娠中，四維彩超、后期超聲均未提示異常；1 例CMA 結(jié)果提示正常而染色體核型結(jié)果提示平衡易位攜帶者已正常出生；1 例CMA 結(jié)果提示正常而染色體核型結(jié)果提示9 號染色體低比例嵌合最終選擇引產(chǎn)；1 例CMA 結(jié)果提示正常而染色體核型結(jié)果提示21 號染色體隨體延長已正常出生。其他77 例CMA 檢測結(jié)果正常胎兒目前未發(fā)現(xiàn)其他異常。

2.5 遺傳性胎兒染色體片段缺失或重復(fù)CMA提示胎兒染色體缺失或重復(fù)的病例中，有7 例明確來源，分別遺傳自母親或?yàn)樾掳l(fā)突變，見表6。

表6 遺傳性胎兒染色體片段缺失或重復(fù)Tab.6 Hereditable fetal chromosomal fragment deletion or duplication

3 討論

染色體微缺失微重復(fù)是除染色體非整倍體外的一類常見的染色體異常，是導(dǎo)致新生兒出生缺陷的原因之一［6-7］，有研究［8］顯示CNVs 導(dǎo)致的微缺失、微重復(fù)綜合征占所有新生兒先天性異常的1%～2%。目前臨床上應(yīng)用廣泛的NIPT 技術(shù)在產(chǎn)前篩查胎兒的常見染色體異常（如21 三體、18 三體、13 三體綜合征等）時(shí)有較高的準(zhǔn)確性。隨著NIPT技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究［9］發(fā)現(xiàn)NIPT 也可篩查出其他染色體的非整倍體變異及CNVs。

羊水細(xì)胞染色體核型分析是胎兒染色體異常診斷的金標(biāo)準(zhǔn)［10］。染色體核型分析可以檢測染色體數(shù)目異常、大的結(jié)構(gòu)異常、平衡易位、低比例嵌合等，但由于技術(shù)的局限性，僅能發(fā)現(xiàn)＞10 Mb 的染色體異常［11］，運(yùn)用高分辨率顯帶技術(shù)可以檢出4～5 Mb 以上的染色體異常［12］。本研究中檢出17例染色體核型異常與NIPT 結(jié)果相符，其中1 例胎兒為復(fù)雜平衡易位攜帶者、1 例胎兒9 號染色體低比例嵌合（6.3%）而CMA 結(jié)果提示正常、1 例提示胎兒21 號染色體隨體延長考慮多態(tài)性。

CMA 技術(shù)可以檢測全基因組CNVs，還可檢測嵌合體、雜合性缺失及部分單親二倍體等［13］，對于NIPT 提示胎兒CNVs，建議行染色體核型分析聯(lián)合應(yīng)用CMA，以提高染色體異常檢出率［14］。本研究中，114例NIPT 提示染色體拷貝數(shù)變異的孕婦行產(chǎn)前診斷，CMA 檢測確診異常34 例（29.82%），與姜楠、吳莉等［15-16］的數(shù)據(jù)報(bào)道較為一致。本研究中，經(jīng)CMA 診斷34 例異常中，29 例與NIPT 篩查結(jié)果基本一致，陽性符合率為85.3%（29/34），僅5 例不一致。NIPT 篩查染色體缺失、重復(fù)的片段大小比較，可以發(fā)現(xiàn)染色體片段越大，檢出率越高，有文章報(bào)道CNV ≥5 Mb 時(shí)，NIPT 檢出率達(dá)到90.9%，CNV ≤5 Mb 時(shí)，NIPT檢出率僅有14.3%［17］。分析染色體片段較小未被檢出，考慮可能與胎兒游離DNA濃度過低、胎盤限制性嵌合、測序深度不夠、測序數(shù)據(jù)量不足等因素有關(guān)［18］。CMA 34 例異常結(jié)果中檢出臨床意義不明確變異12 例，針對致病性不確定CNVs 病例，臨床上建議夫婦雙方抽血行CMA 與胎兒結(jié)果比對。本研究7對夫婦行CMA對照，其中6 例胎兒拷貝數(shù)變異與其母親一致（5 例已正常出生，1 例正常妊娠中），1 例為新發(fā)突變（選擇終止妊娠）。據(jù)此，可以考慮胎兒拷貝數(shù)不確定變異大多是遺傳自雙親，考慮臨床表現(xiàn)正常，但由于本研究夫婦比對樣本量較少，仍需進(jìn)一步驗(yàn)證［19］。

本研究對114 例行產(chǎn)前診斷孕婦進(jìn)行了隨訪，21 例CMA 結(jié)果提示致病性變異，其中19 例夫妻雙方經(jīng)知情同意后選擇了引產(chǎn)，2 例經(jīng)臨床咨詢現(xiàn)已出生，1 例22 號染色體q11.21 區(qū)段有2.83 Mb片段重復(fù)，夫婦CMA 比對結(jié)果顯示胎兒母親攜帶22q11.21 重 復(fù)；另1 例Xp22.31 有1.68 Mb 片 段 缺失，夫婦CMA 比對結(jié)果顯示胎兒母親攜帶Xp22.31缺失，經(jīng)臨床咨詢告知女性存在X 染色體失活，但男性異常X 染色體出現(xiàn)臨床表型。對12 例CMA結(jié)果提示臨床意義不明隨訪，8 例出生，2 例正常妊娠中，2 例胎兒終止妊娠，其中1 例11 號染色體q21q22.1 區(qū)段有6.41Mb 片段缺失，夫婦行CMA 比對，雙方結(jié)果均正常，臨床咨詢告知可能風(fēng)險(xiǎn)，最終選擇終止妊娠。其他77 例CMA 檢測結(jié)果正常胎兒目前已出生60 例，17 例正常妊娠中，均未發(fā)現(xiàn)其他異常。

綜上所述，NIPT 是一項(xiàng)無創(chuàng)傷、無流產(chǎn)、無感染、準(zhǔn)確率高、檢出率高并廣泛應(yīng)用于臨床的新技術(shù)。隨著胎兒拷貝數(shù)變異檢出率的不斷提高，染色體異常胎兒也隨之被檢出，因此，NIPT 對CNVs具有一定的預(yù)測價(jià)值。同時(shí)，對于NIPT 提示胎兒染色體微缺失、微重復(fù)，專家建議行產(chǎn)前診斷聯(lián)合應(yīng)用染色體核型分析及CMA 檢測技術(shù)以明確診斷，根據(jù)結(jié)果必要時(shí)行夫婦雙方染色體核型分析或CMA 比對，為臨床遺傳咨詢提供意見及依據(jù)。NIPT 檢測存在假陽性結(jié)果，這樣也導(dǎo)致了一部分不必要的產(chǎn)前診斷及增加了胎兒流產(chǎn)、感染等風(fēng)險(xiǎn)，故臨床應(yīng)用需謹(jǐn)慎?？傊琋IPT 具有廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值同時(shí)該檢測方法需要不斷優(yōu)化。