脊髓背角神經(jīng)元STAT3/SDF-1 信號(hào)通路在大鼠術(shù)后慢性疼痛形成中的作用

孫揚(yáng) 張瓔 張海良 李靜 孫文艷

西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院1康復(fù)醫(yī)學(xué)科，2醫(yī)務(wù)處，3院辦，4耳鼻喉科（西安 710038）

隨著人類平均壽命逐年增加，惡性腫瘤、器官移植、復(fù)雜創(chuàng)傷等需要進(jìn)行手術(shù)治療的疾病發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。由于該類手術(shù)耗時(shí)較長(zhǎng)，術(shù)中固定牽拉較久，慢性術(shù)后疼痛綜合征（chronic postsurgical pain syndromes，CPSP）發(fā)生率非常高，主要臨床癥狀為操作部位及與其相鄰組織持續(xù)數(shù)月甚至數(shù)年的痛覺(jué)過(guò)敏或出現(xiàn)不同程度觸誘發(fā)痛情況［1-2］，當(dāng)前治療挑戰(zhàn)極大，相關(guān)的病理生理機(jī)制仍有待明確。皮膚肌肉切口牽拉術(shù)（skin/muscle incision and retraction，SMIR）可導(dǎo)致成年大鼠術(shù)后3～22 d 機(jī)械痛閾顯著下調(diào)，是一種術(shù)后急慢性疼痛轉(zhuǎn)化常用動(dòng)物模型［3］，可有助于揭示CPSP 的深層病理生理機(jī)制。

趨化因子家族成員基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）可介導(dǎo)多種因中樞神經(jīng)損傷、炎癥等導(dǎo)致的痛覺(jué)過(guò)敏的產(chǎn)生［4-5］。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，SMIR 手術(shù)可能通過(guò)上調(diào)脊髓背角SDF-1 的表達(dá)誘導(dǎo)中樞敏感化及痛覺(jué)過(guò)敏，提示脊髓背角SDF-1 上調(diào)可能具有潛在的干預(yù)價(jià)值［6］。然而，術(shù)后脊髓背角SDF-1 的上調(diào)機(jī)制尚不明確。近期研究顯示信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）參與介導(dǎo)SMIR 術(shù)后CX3CL1 上調(diào)和痛覺(jué)過(guò)敏［7］。以往研究表明，抑制STAT3 可以下調(diào)編碼趨化因子如CCL2 和CXCL5 的mRNA 的表達(dá)，提示STAT3 調(diào)節(jié)趨化因子的轉(zhuǎn)錄［8］?；诖耍P者推測(cè)脊髓背角STAT3 與SDF-1 可能在術(shù)后急慢性疼痛轉(zhuǎn)化過(guò)程中具有重要作用。本研究擬通過(guò)SMIR 大鼠模型明確脊髓背角STAT3 參與SDF-1 上調(diào)和疼痛過(guò)敏的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來(lái)源選用體質(zhì)量為220～240 g 的雄性SD 大鼠飼養(yǎng)于規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中。所有實(shí)驗(yàn)程序均已獲得第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)（SMMU，許可證號(hào)：2011023），全部實(shí)驗(yàn)步驟均按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理與應(yīng)用指南實(shí)施。

1.2 方法

1.2.1 分組將SD 大鼠分為sham（假手術(shù)）組、SMIR 組、SMIR+anti-SDFI 組和SMIR+S3I-201 組，每組12 只大鼠。

1.2.2 SMIR 模型構(gòu)建按規(guī)范建立大鼠皮膚肌肉切口牽拉術(shù)持續(xù)性疼痛模型［9］。sham（假手術(shù)）組除了不牽拉神經(jīng)，其余操作與SMIR 組相同。

1.2.3 鞘內(nèi)置管及給藥方法如先前所述進(jìn)行鞘內(nèi)注射［10］。在4%水合氯醛（0.4 g/kg，腹腔麻醉）下行椎板切除術(shù)。然后將聚乙烯10（PE-10）導(dǎo)管通過(guò)L4/L5 椎間隙植入蛛網(wǎng)膜下腔中，并將導(dǎo)管尖端置于腰膨大處。進(jìn)行SMIR手術(shù)之前，允許大鼠至少恢復(fù)7 d。SMIR+anti-SDFI 組和SMIR+S3I-201 組大鼠在SMIR 手術(shù)前30 min 分別在鞘內(nèi)給予SDF-1 中和性抗體（50 μg/10 μL，Torrey Pines Biolabs）和STAT3抑制劑S3I-201（100 μg/10 μL，Selleckchem），此后連續(xù)給藥10 d。

1.2.4 痛行為學(xué)監(jiān)測(cè)用up-down 法監(jiān)測(cè)大鼠撤足反射閾值有無(wú)變化，觀測(cè)大鼠痛閾改變情況與持續(xù)時(shí)間。用Von Frey hair（0.8、1.12、1.68、3.2、4.89、6.3、8.6、12.6 和20.2 g）刺激大鼠后爪底部皮膚。計(jì)算50%陽(yáng)性反應(yīng)閾值為大鼠的撤足反射閾值PWT［11］。前期實(shí)驗(yàn)提示，通常SMIR 后第10 天時(shí)測(cè)得大鼠痛閾最低，并能持續(xù)至第20 天，故該實(shí)驗(yàn)所確定取樣時(shí)間為術(shù)前1 d 及術(shù)后第1、5、10、20 天。

1.2.5 蛋白免疫印跡SMIR手術(shù)后第1、5、10、20天取大鼠脊髓，Western blot 方法檢測(cè)SDF-1 蛋白水平、磷酸化STAT3 水平及總蛋白水平。脊髓局部應(yīng)用SDF-1 中和性抗體及STAT3 抑制劑S31-201，觀察SDF-1 蛋白水平。操作如下：取脊髓背角組織，添加Tris 裂解緩沖液低溫下勻漿、破碎并低溫離心，取上清。BCA 法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。進(jìn)行SDS-PAGE 后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜后TBST 封閉液室溫下封閉1 h。4 ℃過(guò)夜孵育SDF-1 一抗（稀釋比例為1∶1 000）、STAT3（稀釋比例為1∶1 000）、磷酸化STAT3（稀釋比例為1∶1 500），第2 天用TBST 洗膜3 次，共30 min。用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，洗3次后進(jìn)行ECL顯色，暗室曝光拍照。

1.2.6 免疫組化免疫組化方法檢測(cè)SDF-1、STAT3表達(dá)的細(xì)胞類型。戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉大鼠，并在升主動(dòng)脈中灌注生理鹽水，然后在4 ℃下于0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.2～7.4）中加入4%多聚甲醛。取出L3/4 脊髓，在相同的固定劑中固定1 h 后轉(zhuǎn)移到30%的蔗糖中2 d。在低溫恒溫器（Leica CM1900）中切開(kāi)脊髓切片（25 μm），并使用SDF-1（1∶300，Abcam）、磷酸化STAT3（Tyr705）（1∶100，Abcam）、NeuN（1∶500，Chemicon）、GFAP（1∶800，Chemicon）、Iba1（1∶200，Abcam）或OX-42（1∶250，Chemicon）的一抗進(jìn)行免疫組化。4 ℃孵育過(guò)夜后，將切片與Cy3 偶聯(lián)和Alexa 488 偶聯(lián)的二抗在黑暗中于室溫孵育1 h。然后立即檢查熒光染色的切片，并使用熒光顯微鏡及共焦顯微鏡觀察。

1.2.7 染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）測(cè)定SMIR 手術(shù)后第1、5、10、20 和30 天取大鼠脊髓，染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）檢測(cè)STAT3 與SDF-1 啟動(dòng)子相互作用。使用ChIP 分析試劑盒（Thermo）進(jìn)行分析?？焖偃〕鯨3/4 脊髓背角并置于1%甲醛中2 min。通過(guò)超聲處理將DNA 片段化，并用微球菌核酸酶消化。加入ChIP 稀釋緩沖液后，將100 μL 樣品保存為輸入。然后將STAT3 抗體（R＆D 系統(tǒng)）8 μL添加到500 μL 預(yù)先清除的染色質(zhì)溶液中，并將樣品接種過(guò)夜。進(jìn)行“IgG”（Sigma）免疫沉淀作為陰性對(duì)照。然后捕獲、洗脫和反向交聯(lián)抗體/DNA 復(fù)合物。從復(fù)合物和輸入級(jí)分中純化DNA，沉淀并重懸于60 μL 無(wú)核酸酶的水中，用于PCR。計(jì)算ChIP/輸入比。引物5′-AGAAAGGCAATGGGAGTGTGTG-3′和5′-CTCAGTCCTGCCGATAGACC-3′被設(shè)計(jì)為擴(kuò)增SDF-1 啟動(dòng)子片段（-1181/-879），該片段包含預(yù)測(cè)的STAT3 結(jié)合位點(diǎn)（-1085/-1075）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。對(duì)于行為學(xué)分析，使用雙向或單向ANOVA，并進(jìn)行重復(fù)檢驗(yàn)，隨后進(jìn)行了Tukey 事后檢驗(yàn)。對(duì)于qPCR、蛋白印跡和免疫組化數(shù)據(jù)，使用了雙向ANOVA，然后進(jìn)行了Tukey 事后檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脊髓背角SDF-1的上調(diào)導(dǎo)致SMIR后痛覺(jué)過(guò)敏通過(guò)檢測(cè)觀測(cè)時(shí)間段大鼠撤足反射閾值，相較對(duì)照組，皮膚肌肉切口牽拉術(shù)組大鼠實(shí)驗(yàn)反射閾值顯著降低（P＜0.05），將中和SDF-1抗體注射于大鼠鞘內(nèi)可升高SMIR導(dǎo)致的大鼠疼痛閾值（圖1A）。SMIR后第5、10、20天大鼠脊髓背角SDF-1的mRNA（圖1B）及蛋白（圖1C）表達(dá)水平均顯著上調(diào)（均P＜0.01）。

圖1 SMIR 后不同時(shí)間大鼠痛閾及脊髓SDF-1 的表達(dá)Fig.1 Paw withdrawal threshold and expression of SDF-1 in spinal cord at different phases after SMIR

2.2 脊髓背角STAT3 在SMIR 術(shù)后慢性疼痛中的作用Western blot 結(jié)果顯示（圖2A），SMIR 手術(shù)后第5～20 天，大鼠脊髓背角p-STAT3 與總STAT3 蛋白的比值顯著增加（P＜0.01）；且鞘內(nèi)注射STAT3抑制劑S3I-201 可緩解SMIR 引起的大鼠痛閾的降低（P＜0.05，圖2B）。提示脊髓背角磷酸化的STAT3 參與SMIR 誘導(dǎo)的痛覺(jué)過(guò)敏。

圖2 脊髓背角STAT3 在SMIR 誘發(fā)的機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏中的作用Fig.2 The role of spinal dorsal horn STAT3 in SMIR-induced mechanical hyperalgesia

2.3 SMIR 手術(shù)后脊髓背角神經(jīng)中SDF-1 與p-STAT3 表達(dá)定位雙重免疫熒光染色結(jié)果表明，SDF-1 與Neun 陽(yáng)性神經(jīng)元共染，與GFAP 陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞不共染（圖3A）；p-STAT3 也與Neun 陽(yáng)性神經(jīng)元共染，與GFAP 陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞不共染（圖3B）。表明脊髓背角SDF-1 與p-STAT3 主要在Neun 陽(yáng)性神經(jīng)元中表達(dá)，而在GFAP 陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞中不表達(dá)，并且p-STAT3 可能調(diào)節(jié)SDF-1 的表達(dá)。

圖3 SMIR 手術(shù)后脊髓神經(jīng)中SDF-1 與p-STAT3 表達(dá)定位Fig.3 Expression and localization of SDF-1 and p-STAT3 in spinal nerves after SMIR

2.4 SMIR 促進(jìn)脊髓背角STAT3 與SDF-1 基因啟動(dòng)子的結(jié)合Western blot 結(jié)果顯示（圖4A），鞘內(nèi)注射STAT3 抑制劑S3I-201 顯著抑制了SMIR 術(shù)后脊髓背角SDF-1蛋白的表達(dá)（P＜0.01），表明脊髓背角STAT3 的激活可能介導(dǎo)了SMIR 誘導(dǎo)的SDF-1 的上調(diào)。與觀察到的脊髓背角SDF-1蛋白表達(dá)變化一致，定量PCR結(jié)果顯示（圖4B），S3I-201同樣抑制了SMIR 誘導(dǎo)的SDF-1 的mRNA 表達(dá)（P＜0.01），表明脊髓背角STAT3對(duì)SDF-1的調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。Jaspar 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)STAT3 可能與SDF-1 基因啟動(dòng)子區(qū)域-1085/-1075 區(qū)域發(fā)生結(jié)合，針對(duì)該區(qū)域所在的啟動(dòng)子（-1181/-879）設(shè)計(jì)引物。ChIP-PCR 顯示（圖4C），與假手術(shù)相比，SMIR 后第10 天STAT3與SDF-1 基因啟動(dòng)子的結(jié)合顯著增加（P＜0.01），提示脊髓背角STAT3 向SDF-1 基因啟動(dòng)子的募集可能會(huì)進(jìn)一步上調(diào)脊髓背角SDF-1 的表達(dá)并導(dǎo)致痛覺(jué)過(guò)敏。

圖4 脊髓背角STAT3 介導(dǎo)SMIR 術(shù)后SDF-1 的表達(dá)Fig.4 Spinal dorsal horn STAT3 mediates the expression of SDF-1 after SMIR

3 討論

CPSP發(fā)生率非常高，截至目前相關(guān)產(chǎn)生原因尚不明確，而常規(guī)使用各類鎮(zhèn)痛藥物效果不明顯［12］。明確手術(shù)導(dǎo)致痛覺(jué)過(guò)敏的機(jī)制，并進(jìn)一步探索治療模式，可有效減輕患者痛苦從而降低社會(huì)醫(yī)療支出具有顯著醫(yī)學(xué)價(jià)值與現(xiàn)實(shí)意義。FLATTERS等［9］首先成功構(gòu)建皮膚肌肉切口牽拉動(dòng)物模型，該模型在保有外周神經(jīng)正常功能前提下，效仿外科手術(shù)進(jìn)行切口牽拉，并可引起1 個(gè)月左右持續(xù)性痛覺(jué)過(guò)敏，該模型的成功建立成為目前研究術(shù)后慢性疼痛的主要方法，因此被廣泛采用作為研究術(shù)后慢性痛機(jī)制的理想模型。

SDF-1 作為趨化因子家族中的重要成員，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，介導(dǎo)多種原因?qū)е碌耐从X(jué)過(guò)敏。報(bào)道顯示脊髓損傷、蜂毒注射模型誘導(dǎo)痛覺(jué)過(guò)敏中均檢測(cè)到SDF-1 的明顯上調(diào)［13-14］，SDF-1 還通過(guò)與其受體CXCR4 相結(jié)合介導(dǎo)神經(jīng)損傷或嗎啡耐受誘導(dǎo)的痛覺(jué)過(guò)敏［15］。本研究證實(shí)：SMIR 手術(shù)顯著上調(diào)脊髓背角SDF-1 蛋白及mRNA 的表達(dá)，且鞘內(nèi)注射SDF-1 中和性抗體顯著抑制SMIR 手術(shù)誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏，提示SMIR 手術(shù)可能通過(guò)上調(diào)脊髓背角SDF-1 的表達(dá)誘導(dǎo)中樞敏感化及痛覺(jué)過(guò)敏，然而脊髓背角SDF-1 的上調(diào)機(jī)制目前仍不明確。STAT3 是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，目前認(rèn)為STAT3 不僅可以介導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)，而且在慢性疼痛中也起著至關(guān)重要的作用［16］。既往研究顯示，神經(jīng)損傷會(huì)增加STAT3的磷酸化，抑制STAT3 通路會(huì)減弱機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏［17-19］。本研究發(fā)現(xiàn)，SMIR 手術(shù)后大鼠脊髓背角神經(jīng)元中的STAT3 明顯活化，p-STAT3 與總STAT3蛋白的比值顯著增加，且鞘內(nèi)注射STAT3 抑制劑S3I-201 顯著減輕了SMIR 引起的疼痛，提示磷酸化的STAT3 可能參與SMIR 誘導(dǎo)的痛覺(jué)過(guò)敏。然而，STAT3 的激活是否會(huì)上調(diào)脊髓背角SDF-1 的表達(dá)尚不清楚。

為了進(jìn)一步研究脊髓背角SDF-1 和STAT3 之間的潛在關(guān)系，首先要表明它們是否在很大程度上共定位，以及STAT3 抑制劑是否可以降低SMIR誘導(dǎo)的SDF-1 的上調(diào)。研究證明，STAT3 可以轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)趨化因子CX3CL1、CXCL5、CXCL10 和CCL20的表達(dá)［8］。作為轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)受到炎癥、損傷或其他情況的刺激時(shí)，STAT3 可以被激活，結(jié)合至其靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄［20］。本研究通過(guò)免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，脊髓背角SDF-1 與p-STAT3 主要在Neun 陽(yáng)性神經(jīng)元中表達(dá)，而在GFAP 陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞中不表達(dá)，說(shuō)明神經(jīng)元細(xì)胞而非小膠質(zhì)細(xì)胞參與了術(shù)后痛覺(jué)反應(yīng)，并且p-STAT3 可能通過(guò)調(diào)節(jié)SDF-1 的表達(dá)誘發(fā)術(shù)后慢性疼痛。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，STAT3 激活后進(jìn)入細(xì)胞核并與目的基因的啟動(dòng)子相結(jié)合，通過(guò)調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄，在多種生物學(xué)功能中發(fā)揮作用［16］。ChIP 分析也證實(shí)，SMIR 增強(qiáng)了脊髓背角STAT3 向SDF-1 基因啟動(dòng)子的募集，鞘內(nèi)注射STAT3 抑制劑S3I-201 可顯著抑制SMIR 手術(shù)后SDF-1 蛋白和mRNA 水平的上調(diào)。這表明脊髓背角STAT3 對(duì)SDF-1 的調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，S3I-201 可能通過(guò)抑制STAT3 磷酸化、STAT3 轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核以及脊髓背角STAT3 與SDF-1 基因啟動(dòng)子的結(jié)合來(lái)降低SDF-1 的表達(dá)。因此，SMIR 可能通過(guò)增強(qiáng)脊髓背角STAT3 向SDF-1 基因啟動(dòng)子的募集，上調(diào)SDF-1 的表達(dá)，從而促進(jìn)了機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏的發(fā)生發(fā)展。

本研究首次提出了脊髓背角病理性上調(diào)的SDF-1 參與了SMIR 模型大鼠術(shù)后慢性疼痛的發(fā)生、發(fā)展，并且提出其上調(diào)機(jī)制可能是由轉(zhuǎn)錄因子STAT3 與SDF-1 啟動(dòng)子結(jié)合增多、促進(jìn)SDF-1 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的。但本文也有一定的局限性：（1）沒(méi)有證明STAT3 與SDF-1 啟動(dòng)子結(jié)合增多的原因，是否是由于SMIR 術(shù)后SDF-1 啟動(dòng)子區(qū)域乙酰化水平增高或是其他原因；（2）沒(méi)有對(duì)STAT3 與SDF-1 可能的結(jié)合區(qū)域進(jìn)行突變，之后觀察STAT3 還能否與突變后的SDF-1 啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合以及其對(duì)SDF-1 表達(dá)的影響；（3）激活的STAT3 是否存在其他下游靶蛋白在本文中并未探究。

綜上所述，SMIR 手術(shù)可能通過(guò)激活脊髓背角STAT3，促進(jìn)其與SDF-1 基因啟動(dòng)子的結(jié)合，上調(diào)脊髓背角SDF-1 的表達(dá)，增強(qiáng)脊髓背角突觸傳遞效率，從而導(dǎo)致機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏。這一結(jié)論為術(shù)后慢性疼痛提供了潛在的分子診斷依據(jù)和臨床治療靶點(diǎn)。而術(shù)后慢性疼痛是否還存在其他可能機(jī)制及STAT3/SDF-1 信號(hào)通路的具體調(diào)控方式，需要進(jìn)一步深入研究。