ZEB1在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)及功能研究

袁 明 汪雯雯 宋 佳

子宮內(nèi)膜異位癥(簡稱內(nèi)異癥)是婦科常見的雌激素依賴性疾病，主要導(dǎo)致慢性盆腔痛、痛經(jīng)及不孕等[1]。雖然內(nèi)異癥為婦科良性疾病，但具有腫瘤的惡性生物學(xué)行為，如具有侵襲性、轉(zhuǎn)移潛能及術(shù)后易復(fù)發(fā)等，給患者造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)及心理負(fù)擔(dān)[2]。因此，探究內(nèi)異癥的惡性生物學(xué)行為的機(jī)制對(duì)尋找新的分子治療靶點(diǎn)具有重要臨床意義。轉(zhuǎn)錄因子ZEB1屬于鋅指同源家族成員，通過鋅指結(jié)構(gòu)與下游靶基因啟動(dòng)子區(qū)的E-box序列結(jié)合發(fā)揮作用。ZEB1在人類多種癌癥中異常表達(dá)，主要參與調(diào)控上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT) 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移，以及調(diào)控腫瘤細(xì)胞化療敏感度[3,4]。EMT是重要的細(xì)胞重塑過程，其特征是上皮表型逐漸喪失，間充質(zhì)表型逐漸增加。近年來，越來越多的證據(jù)表明EMT參與內(nèi)異癥的發(fā)病機(jī)制[5～7]。作為EMT調(diào)控的重要轉(zhuǎn)錄因子，筆者推測ZEB1在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病過程中亦可能發(fā)揮重要作用。本研究通過檢測ZEB1在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)情況，初步探討ZEB1在內(nèi)異癥中的功能，為內(nèi)異癥的診療提供新的思路。

資料與方法

1.臨床資料及標(biāo)本采集：選取2010年1月1日～2011年12月31日在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院因卵巢子宮內(nèi)膜囊腫行手術(shù)治療的患者30例為研究組，留取卵巢囊壁組織。選取同期因婦科良性疾病(子宮平滑肌瘤17例，不孕癥13例)住院行手術(shù)治療的患者30例為對(duì)照組，留取正常內(nèi)膜組織。組織標(biāo)本部分行石蠟包埋，剩余組織液氮速凍后超低溫冰箱保存。臨床資料及臨床標(biāo)本的采集工作經(jīng)華中科技大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)討論并通過。

2.主要試劑：DF12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自浙江天杭生物技術(shù)有限公司，Ⅰ型膠原酶購自美國Sigma-Aldrich公司，DNaseⅠ酶購自中國碧云天生物技術(shù)研究所，Rever Tra Ace qPCR RT Kit購自日本TaKaRa公司，SYBR Green Real-time PCR Master Mix購自美國ABI公司，所有引物由上海Invitrogen公司合成，普通PCR試劑購自美國Fermentas公司，ZEB1多克隆抗體購自美國Santa公司。CCK8 試劑盒購自日本Dojind公司。Matrigel膠購自美國BD公司， Transwell小室購自美國Milipore公司。

3.石蠟切片免疫組織化學(xué)：組織標(biāo)本經(jīng)10%甲醛溶液固定后，石蠟包埋，切片3μm厚。組織切片脫蠟再水化。3%H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，檸檬酸緩沖液于微波爐行抗原恢復(fù)。3%牛血清白蛋白阻斷后一抗孵育切片，抗ZEB1(兔抗1∶200)，DAB顯色。

4.原代子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：正常子宮內(nèi)膜組織充分剪碎，經(jīng)膠原酶B(10μg/ml)消化后收集細(xì)胞。培養(yǎng)基DF12重懸細(xì)胞，經(jīng)400目濾網(wǎng)得到子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞,接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶。24h后胰酶消化細(xì)胞,接種6孔板，待細(xì)胞貼壁生長、細(xì)胞融合度達(dá)到70%左右時(shí)，根據(jù)Invitrogen的轉(zhuǎn)染試劑Lipo 2000的步驟行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，觀察組每孔用200μl DF12稀釋4μg pCI-neo-ZEB1，加入6μl脂質(zhì)體Lipo 2000；對(duì)照組轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pCI-neo。于轉(zhuǎn)染后72h收集細(xì)胞渣行Western blot法檢測。

5.RNA提取及qRT-PCR：按Trizol說明書提取卵巢囊壁組織、正常內(nèi)膜組織及轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞渣的總RNA，Nano drop 2000檢測RNA純度，取2μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃ 1min變性; 95℃ 15s；60℃ 45s；72℃ 30s共40個(gè)循環(huán)；95℃ 15s; 60℃ 15s; 95℃ 15s收集熒光。以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔct計(jì)算各組ZEB1的相對(duì)表達(dá)差異。

6. Western blot法檢測:轉(zhuǎn)染后分別收集兩組細(xì)胞提取總蛋白，按照試劑盒的操作步驟進(jìn)行蛋白定量。取60μg 蛋白進(jìn)行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù) marker蛋白分離條帶，切下電泳后目的蛋白凝膠。電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，一 抗(稀釋濃度為ZEB1 1∶1000和GAPDH 1∶8000)4℃孵育過夜。室溫洗膜，于HRP標(biāo)記的二抗溶液中37℃孵育1h,ECL顯色，采用Chemi-genius凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白條帶相對(duì)表達(dá)量。

7.CCK-8檢測細(xì)胞增殖情況：培養(yǎng)瓶中原代培養(yǎng)的內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度以1×104個(gè)/孔均勻接種于96孔板, 待孔板中細(xì)胞融合度達(dá)到85%時(shí), 轉(zhuǎn)染pCI-neo-ZEB1及空質(zhì)粒pCI-neo,每組各5個(gè)復(fù)孔。于轉(zhuǎn)染后24、48、72h加入CCK8, 37℃孵育2h,全能酶標(biāo)儀(UQUA38 型)檢測570nm吸光度(A)值。

8. Transwell侵襲小室法檢測細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力：收集轉(zhuǎn)染后的內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞,用無血清DF12調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/毫升，在Transwell孔板上室加入200μl細(xì)胞懸液，下室加入600μl DF12完全培養(yǎng)液。4%多聚甲醛固定濾膜，結(jié)晶紫染色10min，高倍顯微鏡計(jì)數(shù)穿透到濾膜下層的細(xì)胞數(shù)，每孔隨機(jī)選擇5個(gè)視野，結(jié)果求平均值。侵襲實(shí)驗(yàn)在Transwell小室半透膜表面包被按1∶8比例稀釋的50mg/L matrigel(每孔100μl)置37℃培養(yǎng)箱中，30min成凝膠，再向上室加入細(xì)胞懸液，余同前述，各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

結(jié) 果

1.ZEB1在正常子宮內(nèi)膜及異位子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況：qRT-PCR檢測ZEB1 mRNA在正常子宮內(nèi)膜及異位子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)ZEB1 mRNA在異位子宮內(nèi)膜組織中異常高表達(dá)，且分泌期的表達(dá)高于增生期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1A)。免疫組化法檢測ZEB1在增生期及分泌期正常子宮內(nèi)膜組織、異位子宮內(nèi)膜組織中蛋白水平的表達(dá)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常子宮內(nèi)膜組織中，ZEB1蛋白主要定位于子宮內(nèi)膜的間質(zhì)細(xì)胞的胞核，分泌期表達(dá)高于增生期；而在異位內(nèi)膜中組織中，ZEB1蛋白除在子宮內(nèi)膜的間質(zhì)細(xì)胞的胞核中表達(dá)，還見于異位內(nèi)膜的腺上皮細(xì)胞中(圖1B)。

圖1 ZEB1在正常子宮內(nèi)膜及異位子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況A.ZEB1 mRNA在正常子宮內(nèi)膜及異位子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況;B.ZEB1在正常子宮內(nèi)膜及異位子宮內(nèi)膜組織中免疫組化染色(×400)

2.鑒定質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率：分別收集轉(zhuǎn)染后48h及72h的細(xì)胞渣，qRT-PCR及Western blot法分別檢測ZEB1 mRNA及蛋白表達(dá)變化，可見轉(zhuǎn)染pCI-neo-ZEB1后子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中ZEB1的mRNA及蛋白表達(dá)均明顯升高(圖2)。

圖2 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后ZEB1的表達(dá)A.轉(zhuǎn)染后，間質(zhì)細(xì)胞ZEB1蛋白的表達(dá)；B.轉(zhuǎn)染后，間質(zhì)細(xì)胞ZEB1mRNA的表達(dá)

3.ZEB1對(duì)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖的影響：CCK-8法檢測兩組細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示ZEB1重組質(zhì)粒組間質(zhì)細(xì)胞在 24、48和72h時(shí)的增殖率均明顯高于空白質(zhì)粒組(P<0.05)，上調(diào)正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中的ZEB1后，間質(zhì)細(xì)胞的增殖率明顯提高(圖3)。

圖3 ZEB1對(duì)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖的影響與空白質(zhì)粒組比較，*P<0.05

4.ZEB1對(duì)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞遷移、侵襲的影響：內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，空質(zhì)粒組每高倍視野透膜細(xì)胞數(shù)為 191±22，ZEB1組每高倍鏡視野下的細(xì)胞數(shù)為634±91；小室半透膜表面鋪Matrigel膠后，空質(zhì)粒組間質(zhì)細(xì)胞透膜細(xì)胞數(shù)為187±21，ZEB1組細(xì)胞透膜細(xì)胞數(shù)為460±38，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

討 論

轉(zhuǎn)錄因子ZEB1屬于鋅指同源家族成員，通過其特殊的鋅指結(jié)構(gòu)與下游靶基因啟動(dòng)子區(qū)的E-box序列結(jié)合，從而參與一系列重要的生理過程，包括中胚層的發(fā)生、神經(jīng)嵴細(xì)胞的發(fā)展等[8]。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)ZEB1在多種腫瘤中異常表達(dá)，并參與腫瘤進(jìn)展[9]。ZEB1可參與調(diào)控細(xì)胞極性，抑制基膜的合成，激活基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1、MMP-9、MMP-14的表達(dá)，從而促進(jìn)基膜的重塑，促進(jìn)對(duì)周圍組織的侵襲[10]。內(nèi)異癥是婦科良性疾病，但是具有腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的惡性生物學(xué)行為。有研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)異癥的發(fā)病過程中，上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)及間質(zhì)細(xì)胞上皮轉(zhuǎn)化(MET)可能參與的疾病的進(jìn)展[11]。作為EMT的調(diào)控因子，ZEB1在內(nèi)異癥的發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用。

在正常的子宮內(nèi)膜中，ZEB1的表達(dá)僅在內(nèi)膜肌層以及內(nèi)膜的間質(zhì)細(xì)胞，且定位于細(xì)胞胞核中。在正常子宮內(nèi)膜的腺上皮細(xì)胞中沒有ZEB1的表達(dá)。隨著月經(jīng)周期的變化，分泌期間質(zhì)細(xì)胞中ZEB1的表達(dá)顯著高于增生期。此外，在體及體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雌激素及孕激素均可調(diào)控間質(zhì)細(xì)胞中ZEB1的表達(dá)[12,13]。本研究發(fā)現(xiàn)ZEB1在異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞及腺上皮細(xì)胞中顯著高表達(dá)，且表達(dá)量隨月經(jīng)周期發(fā)生波動(dòng)，分泌期高于增生期。ZEB1僅在子宮內(nèi)膜異位病變的上皮細(xì)胞中表達(dá)，而在正常子宮內(nèi)膜中不表達(dá)，提示ZEB1在內(nèi)異癥發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮重要作用。異位內(nèi)膜上皮具有更高水平的間充質(zhì)特征，從而導(dǎo)致其侵襲性增強(qiáng)。此外，異位腺上皮細(xì)胞間質(zhì)標(biāo)記表達(dá)增加，且這一變化出現(xiàn)在內(nèi)膜異位種植以后發(fā)生。由此，筆者推測病變不同的微環(huán)境，如炎癥、基因異位損傷或其他因素的差異，導(dǎo)致異位種植內(nèi)膜發(fā)生表型的改變[14]。

向原代培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ZEB1真核表達(dá)載體，Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中ZEB1的蛋白表達(dá)明顯升高。運(yùn)用CCK8及Transwell檢測增殖及侵襲情況，結(jié)果提示ZEB1的高表達(dá)可增強(qiáng)間質(zhì)細(xì)胞的增殖能力、促進(jìn)細(xì)胞的侵襲、遷移能力。正常人子宮內(nèi)膜隨性激素的改變而發(fā)生周期性的脫落，這種周期性的脫落伴隨內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡及增殖。內(nèi)膜細(xì)胞凋亡與增殖的平衡有利于維持子宮內(nèi)膜的正常形態(tài)及功能，而細(xì)胞凋亡和(或)增殖異常會(huì)導(dǎo)致內(nèi)膜的病理生理過程。Braun等[15]在mRNA水平檢測內(nèi)異癥患者與正常對(duì)照內(nèi)膜凋亡調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)異癥患者的在位內(nèi)膜DAD-1表達(dá)顯著升高，內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞Bcl-xl/Bcl-x的比例增加，而caspase-1、p53轉(zhuǎn)錄豐度的下降，提示內(nèi)異癥患者存在凋亡調(diào)控基因表達(dá)異常。有研究發(fā)現(xiàn),miR-200b通過靶向調(diào)控ZEB1、ZEB2和KLF4，亦可影響內(nèi)異癥細(xì)胞的增殖、侵襲性和干性[16]。

大量研究表明ZEB1可通過影響P53和RB依賴的抑癌通路，阻止細(xì)胞衰老及凋亡。此外，通過抑制周期蛋白依賴性激酶抑制劑CDKN1A和INK4B，允許G1～S細(xì)胞周期進(jìn)展，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期[17]。在前列腺癌中，ZEB1亦可通過激活ERK1/2信號(hào)通路，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲[18]。miR-590-3p通過靶向作用與ZEB1，調(diào)控心臟成纖維細(xì)胞的增殖、遷移和膠原合成[19]。ZEB1作為細(xì)胞內(nèi)基本生理過程的關(guān)鍵調(diào)控因子，參與干細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖與衰老以及存活與凋亡的調(diào)控。

綜上所述，有活性的異位內(nèi)膜表現(xiàn)出黏附、侵襲、血管形成、免疫逃逸等生物學(xué)行為是內(nèi)異癥發(fā)病的關(guān)鍵。本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)異癥患者異位病灶中ZEB1顯著高表達(dá)，且該轉(zhuǎn)錄因子的異常促進(jìn)了異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的增殖與侵襲。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探索內(nèi)異癥的發(fā)病機(jī)制提供新的思路，ZEB1可能是內(nèi)異癥侵襲性或嚴(yán)重程度的潛在指標(biāo)。