基于ctDNA的MRD檢測在早期非小細胞肺癌根治術后的應用價值

竇世華 謝鴻生 楊林

根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer, IARC）發(fā)布的2020年全球最新癌癥數(shù)據(jù)，肺癌估計有220萬新發(fā)和180萬死亡病例[1]。其中，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約占肺癌總數(shù)的85%[2]。對于早期術后患者，推薦臨床訪視和X線計算機斷層掃描（computed tomography, CT）作為腫瘤監(jiān)測的主要手段。雖然CT掃描可以檢測到術后患者的疾病進展早于X線，但兩組患者的總體生存率沒有統(tǒng)計學差異[3]，表明傳統(tǒng)的放射學方法在術后隨訪中可能已經(jīng)達到極限。如何識別根治性手術后的分子殘留病灶（molecular residual disease, MRD）、預測疾病復發(fā)或轉移和指導術后治療，這仍然是一系列亟需解決的問題。本文將綜述循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA）與MRD的關系、ctDNA的檢測方法、ctDNA的應用，以及通過MRD的檢測結果指導術后輔助治療可產(chǎn)生顯著的臨床相關性。

1 ctDNA與MRD的關系

ctDNA是血液中腫瘤衍生的片段化DNA，ctDNA直接來自腫瘤或循環(huán)腫瘤細胞，主要由單鏈或雙鏈DNA以及單鏈與雙鏈DNA的混合物組成，存在于血漿或血清中[4]。ctDNA中常包含突變、缺失、插入、重排、拷貝數(shù)異常以及甲基化等相關基因突變信息[5]。目前以ctDNA作為MRD的指標最常見[6]，對晚期肺癌的研究[7-12]表明，ctDNA分析在腫瘤基因突變譜檢測、疾病進展監(jiān)測、評判腫瘤負荷和預測藥物療效等方面具有重要的臨床價值。在腸癌、乳腺癌、肌層浸潤性尿路上皮癌及肺癌等術后患者中，基于術后血漿ctDNA發(fā)現(xiàn)MRD，相較與影像學顯示出對腫瘤復發(fā)及轉移預測的明顯優(yōu)勢[13-17]。在2021年第18屆中國肺癌高峰論壇上對肺癌MRD達成了專家共識：肺癌MRD指的是經(jīng)過治療后，傳統(tǒng)影像學（包括正電子發(fā)射體層顯像/CT（positron emission tomography/CT, PET/CT）或實驗室方法不能發(fā)現(xiàn)，但通過液體活檢發(fā)現(xiàn)的腫瘤來源分子異常，代表著肺癌的持續(xù)存在和臨床進展可能。肺癌分子殘留病灶：指的是在外周血可穩(wěn)定檢測出豐度≥0.02%的ctDNA，包括肺癌驅動基因或其他的I類/II類基因變異[18]。經(jīng)過治療后仍能測出豐度≥0.02%的ctDNA，表明存在MRD。

2 ctDNA MRD常用的檢測方法

DNA測序技術的進步和我們對腫瘤分子生物學的理解，通過檢測術后MRD識別疾病復發(fā)的高風險患者，并在輔助治療環(huán)境下調整臨床方案，以優(yōu)化風險分層，這一目標是可以用現(xiàn)有技術實現(xiàn)的[19]。

基因測序的主要策略為檢測腫瘤特異性突變或預定義的基因組區(qū)域（靶向ctDNA策略）。此類型分析基于非常靈敏的技術使用，一類是PCR的分析，如二代的實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR, qPCR）、突變擴增阻滯系統(tǒng)（amplification refractory mutation system, ARMS）和三代的微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR, DdPCR）；PCR技術在ctDNA檢測中從二代到三代的迭代完成了特異性和靈敏性提升（靈敏度從0.1%到0.001%[20-22]），但因不能全面檢測驅動變異之外的突變，這限制了它在多重檢測中的應用。另一類是基于二代測序（next generation sequencing, NGS）的方法，NGS檢測ctDNA技術路線有兩大方向，一個是基于tumor-na?ve的路線，代表研究有Lung-CLiP研究[23]，研究者采用腫瘤個體化分析深度測序法（cancer personalized profiling by deep sequencing, CAPP-Seq），其平均測序深度達23,570×，將檢出的分子突變信息結合基因組捕獲區(qū)域的基因拷貝數(shù)變異（copy number variations, CNV）等信息，納入評估模型。但在整體98%特異性下，I期、II期、III期NSCLC敏感性僅為41%、54%、67%；另一個是基于tumor-informed的路線，代表方法為個體化定制監(jiān)控方案（personalized cancer monitoring, PCM），Zviran等[24]以原發(fā)腫瘤突變譜為基礎，利用全基因組測序（whole genome sequencing, WGS）對整個基因組進行檢測（MRDetect技術），通過觀測整個基因組尋找腫瘤組織已經(jīng)存在的突變，應用極大的廣篩ctDNA測序代替加深深度測序來提高敏感性?；诖?，Signatare首先使用全外顯子測序（whole exome sequencing, WES）的方法，篩選出腫瘤組織攜帶的變異，然后針對這些突變定制患者專屬的基于擴增的NGS panel，通過超高深度100,000×的深度測序，最大化地對每個患者特有的腫瘤變異進行個體化跟蹤。另一家公司ArcherDX在這個基礎上，在單點測序上增加了單分子標簽技術（unique molecular identifiers, UMI），又進一步提升了單點檢測的敏感性。Signatare和ArcherDX這兩種方法均可以歸納為PCM。PCM在特異性監(jiān)控的同時，能達到對0.01%到0.1%級別的變異豐度較好的覆蓋，基本實現(xiàn)早期腫瘤患者ctDNA變異的覆蓋。但這一方法學仍有一定的局限性，由于腫瘤的克隆進化及二次原發(fā)腫瘤的存在，患者新原發(fā)病灶的跟蹤、監(jiān)測以及新克隆的出現(xiàn)，對于基于tumor-informed的PCM來說是無法覆蓋的。例如在TRACERx研究[16]中，I期采用Signatera，II期采用ArcherDX，結果發(fā)現(xiàn)其中大約12%的患者復發(fā)腫瘤病灶從分子上定義是一個新原發(fā)的腫瘤，而對于這種新原發(fā)病灶來說PCM的方法無法做到覆蓋和監(jiān)控。而MRD的檢測維度也是不斷豐富，除了基于ctDNA變異的單一監(jiān)控維度，ctDNA甲基化也成為MRD研究中重要的角色。

3 基于ctDNA的MRD檢測陽性預示NSCLC術后較差的無復發(fā)生存期（relapse-free survival, RFS）與復發(fā)

在非轉移性肺癌患者中，部分患者可以通過初次手術切除、放射治療和包括化療在內的綜合治療方法治愈[25,26]。在一線治療之后影像學只能監(jiān)測到宏觀疾病復發(fā)，但是由于治療后腫瘤組織的壞死等因素，影像學檢測發(fā)現(xiàn)復發(fā)或進展病灶時，患者的全身腫瘤負荷已明顯升高。因此，NSCLC根治術后MRD檢測是否能識別有復發(fā)風險的患者，并且可以在腫瘤負荷最低的情況下進行個性化輔助治療是一個值得深入研究的課題[17,27]。

Peng等[27]研究表明，未檢測到ctDNA（ctDNA轉為陰性）患者的RFS和總生存期（overall survival, OS）明顯好于術后可檢測到ctDNA（ctDNA仍為陽性）的患者（P<0.05）。當與美國癌癥分期聯(lián)合委員會（American joint Committee on cancer, AJCC）分期一起使用時，ctDNA提供了一個相對精確的風險分層。Ohara等[28]用CAPP-seq檢測ctDNA，術后ctDNA陽性提示更短的RFS（P=0.015）。Chen等[29]發(fā)現(xiàn)術后3 d檢測ctDNA與無病生存期（disease-free survival, DFS）密切相關（P=0.018），基于以上，我們將有可能在術后動態(tài)監(jiān)控MRD，并且這一指標具有預測肺癌復發(fā)的可能性。Chaudhuri等[17]的研究中，與治療結束后未檢測到ctDNA的患者相比，在治療后任一時間點均可檢測到ctDNA的患者的生存率顯著降低（P<0.001）（表1）。綜上所述，通過MRD檢測可以更早識別有復發(fā)風險的患者，是NSCLC根治術后的一個實用預后因素。

表1 ctDNA 在早期NSCLC術后的應用Tab 1 Application of ctDNA after early NSCLC surgery

術后ctDNA檢測比影像學檢查更早提示疾病進展或復發(fā)，Xia等[8]表示甲基化水平和最大等位基因頻率（maximum allelic fraction, maxAF）的降低反映了治療效果，而逐漸升高反映了即將到來的疾病進展（progressive disease, PD）。在使用放射成像評估PD之前，分別有6例和5例患者平均提前3.0個月和1.9個月觀察到甲基化水平和maxAF升高。Peng等研究[27]表明19例（63.3%）患者術后ctDNA先于影像學表現(xiàn)或臨床癥狀出現(xiàn)，平均時間為12.6個月。而用ctDNA檢測腫瘤復發(fā)的中位時間比CT檢測提前165 d[29]，Chaudhuri等[17]根據(jù)實體腫瘤的療效評價標準1.1版（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Version 1.1, RECIST 1.1）標準也證實了其研究中72%的患者（共19例）的ctDNA檢測先于CT進展，中位時間為5.2個月。綜上所述，術后ctDNA檢測比影像學檢測更靈敏，能更早提示疾病進展或復發(fā)，有助于患者腫瘤負荷處于較低狀態(tài)下進行輔助診斷，從而可能指導后續(xù)治療起到提高患者預后水平的作用。但確切的提前時間還需進行前瞻性的研究或大量的回顧性研究來證實。

4 ctDNA MRD的檢測指導早期NSCLC術后輔助治療

據(jù)統(tǒng)計，接受手術的NSCLC患者的5年OS從Ia1期的92%到IIIb期的26%[30]。所以即使是在早期疾病，也產(chǎn)生了臨床上對輔助治療的需求，以根除MRD。從2021年中國臨床腫瘤學會（Chinese Society Of Clinical Oncology,CSCO）[31]和2021年美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡（National Comprehensive Cancer Network, NCCN）第1版[32]發(fā)布的《非小細胞肺癌診療指南》對比，可以看出針對早期NSCLC行根治性手術后輔助治療方法的不同。

在CSCO指南中，Ib期NSCLC（包括有高危因素的）因為缺乏高級別證據(jù)支持，一般不推薦輔助化療，IIa期患者根治術后可考慮含鉑雙藥方案輔助化療（2B類證據(jù)）。而NCCN指南中表示Ib期-IIa期NSCLC根治術后建議觀察或高危人群進行化療，IIb期-IIIa期行化療，對表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）突變陽性的Ib期-IIIa期患者根治術后無論是否接受輔助化療，均可以使用奧希替尼靶向輔助治療。高危因素包括：①低分化腫瘤[包括肺神經(jīng)內分泌腫瘤（不包括分化良好的神經(jīng)內分泌腫瘤）]；②血管侵犯；③楔形切除；④腫瘤>4 cm；⑤內臟胸膜受累和淋巴結狀態(tài)不明（Nx）。

綜上兩份指南存在的分歧，而在早期NSCLC根治術后的輔助治療中，MRD的檢測結果指導術后輔助治療可產(chǎn)生顯著的臨床相關性。Chaudhuri等[17]用CAPP-seq檢測ctDNA，在MRD出現(xiàn)36個月后，可檢測到ctDNA的患者100%疾病進展，而未檢測到ctDNA的患者93%（HR=43.4,P<0.001）疾病無進展，MRD未檢出ctDNA的患者遠期生存率明顯高于檢測到ctDNA的患者（P<0.001）。Chen等[29]發(fā)現(xiàn)術后3 d檢測ctDNA陽性的患者，接受輔助治療的RFS為269 d，未接受輔助治療的RFS為111 d（P=0.018），ctDNA的變化與治療療效相關，且術后3 d檢測ctDNA與DFS相關。在Kuang[33]對于術后ctDNA陽性的患者研究中，與化療后ctDNA清零患者相比，化療后ctDNA陽性患者的RFS較差（HR=8.68, P=0.022）。對于術后ctDNA陰性的患者，化療后ctDNA陰性與化療后ctDNA陽性患者相比有更好的遠期療效（HR=4.76, P=0.047）。該研究表明，化療后ctDNA狀態(tài)與RFS密切相關，有可能指導術后強化治療。

綜上所述，治療后ctDNA可以由陽性轉陰性，意味著手術或輔助治療方案可以清除MRD，從而改變其疾病進展和生存。而ctDNA繼續(xù)呈陽性或者是由陰轉陽，可能預示著存在MRD，這可能是一個提示改變治療方案的信號（表1）。

5 總結

目前以ctDNA作為MRD的指標最常見，基于ctDNA提示MRD的研究在腸癌、乳腺癌、肌層浸潤性尿路上皮癌及肺癌等術后患者的隊列中，都顯示出對腫瘤復發(fā)及轉移預測的明顯優(yōu)勢?，F(xiàn)各類方法學在MRD場景孰優(yōu)孰劣還值得進一步細分和探索，而NSCLC本身的分子克隆行為并不均一，從可能影響MRD監(jiān)控效能的腫瘤基因變異數(shù)量考慮，驅動變異與非驅動變異的腫瘤，腫瘤突變負荷（tumor mutational burden, TMB）有極大的差異。一般來說，攜帶驅動變異的患者整體腫瘤基因變異遠遠少于并不攜帶驅動變異的患者，對于這兩類人群我們應該如何去選擇合適的MRD檢測技術需進一步論證。MRD檢測能夠方便、精準、高效是支持它在臨床應用的基礎，而且ctDNA能比NSCLC治療后的影像監(jiān)測更早的預示著疾病的復發(fā)，給及時調整治療方案提供了寶貴的時間。在早期NSCLC根治術后輔助治療研究中，對合適的治療方式存疑，而MRD可以作為一個理想的預測因素，對早期NSCLC根治術后患者進行精準的指導，從而提高患者的存活率和為改善預后作出貢獻。此結論仍需大型前瞻性、隨機對照臨床研究對此進行深一步論證。