芒果可可毛色二孢咪鮮胺抗藥性菌株的轉(zhuǎn)錄組分析

關(guān)鍵詞：芒果；可可毛色二孢；咪鮮胺；轉(zhuǎn)錄組；解毒代謝酶

中圖分類號：S436.67 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

芒果（Mangifera indica L.）是我國重要的熱帶經(jīng)濟(jì)作物，海南地區(qū)的芒果產(chǎn)量和種植面積均位居我國前列。芒果果肉香味濃郁，除鮮食外還可制作果醬和飲品，深受消費(fèi)者喜愛。芒果蒂腐病是危害芒果品質(zhì)、導(dǎo)致采后果實(shí)嚴(yán)重腐爛的重要病害?？煽擅撸↙asiodiplodia theobromae）是引發(fā)芒果蒂腐病的主要病原菌之一[1]。該病原菌是一種全球性病原真菌，能夠在芒果等多種熱帶果樹及林木作物上侵染為害，造成采后果實(shí)蒂腐病和田間樹木、枝干的枯死等病害[1]。此外，該菌具有潛伏侵染的特性，病菌可在幼果期侵染并在果實(shí)中潛伏，果實(shí)成熟后病斑迅速擴(kuò)展，發(fā)生褐變并散發(fā)出酸臭味，在芒果采后貯藏和運(yùn)輸?shù)倪^程中爆發(fā)，嚴(yán)重影響芒果的品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2]。目前防治芒果病害的方法主要包括物理防治、生物防治與化學(xué)防治，其中化學(xué)防治是最常用的方式，異菌脲、多菌靈、咪鮮胺等殺菌劑能夠有效防治芒果蒂腐病[3-4]。然而，隨著藥劑施用量持續(xù)增加，使得病原菌的選擇壓力持續(xù)增大，單一靶標(biāo)位點(diǎn)的殺菌劑已經(jīng)產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性。據(jù)報(bào)道，芒果可可毛色二孢對多菌靈、嘧菌酯抗性已經(jīng)達(dá)到十分嚴(yán)重的水平[5-6]。

大量研究表明，害蟲、雜草及病原菌對農(nóng)藥的抗性機(jī)制主要包括靶標(biāo)抗性機(jī)制和非靶標(biāo)抗性機(jī)制[6]。靶標(biāo)抗性主要是殺菌劑靶標(biāo)基因發(fā)生突變所致，致使藥劑與作用位點(diǎn)酶的親和性降低。而非靶標(biāo)抗性主要是增加藥劑外排作用、解毒作用和對藥劑的通透性下降所致，又稱為代謝抗性，增加藥劑外排與代謝解毒常常協(xié)同發(fā)揮作用[7]。以細(xì)胞色素P450 介導(dǎo)的微粒體多功能氧化酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等代謝酶系為主體的解毒系統(tǒng)能夠把農(nóng)藥分解成毒性更低、親水性更強(qiáng)的物質(zhì)，便于排出體外[8]。代謝抗性的發(fā)生不僅會(huì)提升抗藥性水平，也有可能導(dǎo)致交互抗性及多藥抗性的發(fā)生[9]。目前，代謝抗性的研究主要集中在害蟲及雜草抗藥性的產(chǎn)生機(jī)制，病原真菌的代謝抗性研究尚處于初步階段。本研究擬在芒果上分離獲得的咪鮮胺抗藥性菌株為供試材料，通過轉(zhuǎn)錄組測序及差異表達(dá)基因的分析，挖掘與代謝抗性相關(guān)的基因，對代謝抗性的機(jī)制進(jìn)行初步探析，為后續(xù)代謝抗性機(jī)制的深入研究提供依據(jù)。研究芒果可可毛色二孢抗藥性產(chǎn)生機(jī)制，是延緩田間抗藥性發(fā)展的關(guān)鍵所在，對提升芒果蒂腐病防治效果及提高芒果產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要指導(dǎo)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試3 株芒果蒂腐病可可毛色二孢菌株HL02、M108 和DF04 由海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院殺菌劑生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。將菌株接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，于28 ℃黑暗中培養(yǎng)3 d 后備用。

1.1.2 供試藥劑 97%咪鮮胺購自海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司；總RNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；DL2000 DNA Marker、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、ChamQ Universal qPCR SYBRMaster Mix 購自南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA 1000 assay Kit 購自安捷倫科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 咪鮮胺敏感性測定 采用菌絲生長速率法測定3株可可毛色二孢菌株對咪鮮胺的敏感性。咪鮮胺用少量丙酮溶解并配制成1×10³ mg/L 的母液備用。在PDA 培養(yǎng)基中加入不同量的殺菌劑母液，配制得到不同濃度的含藥培養(yǎng)基平板，最終試驗(yàn)濃度為0、0.2、0.8、3.2、12.8、51.2 mg/L。對照培養(yǎng)基中加入等量的溶劑。每處理3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3 次。從培養(yǎng)3 d 的菌落邊緣取菌餅（直徑5 mm）轉(zhuǎn)移到含藥PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)36 h 后，測量菌落直徑并計(jì)算抑制率。將供試濃度轉(zhuǎn)換為濃度對數(shù)，抑制率轉(zhuǎn)換為幾率值，使用Probit 分析求回歸方程y=a+bx，計(jì)算半數(shù)有效濃度EC 值。

1.2.2 可可毛色二孢的RNA 提取及轉(zhuǎn)錄組測序從培養(yǎng)3 d 的菌落邊緣取菌餅（直徑5 mm）轉(zhuǎn)移到100 mL 馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)（PDB），每瓶培養(yǎng)液接種5 個(gè)菌餅，于145 r/min 震蕩培養(yǎng)24 h；然后加入咪鮮胺使其終濃度為10 mg/L，再培養(yǎng)12 h 后取出每個(gè)樣品的菌絲，使用總RNA 提取試劑盒，嚴(yán)格按照說明書提取樣品的總RNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳及微量紫外分光光度計(jì)檢測其純度和濃度。每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)樣品，將質(zhì)檢合格的樣品混合，然后設(shè)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。用Oligo（dT）磁珠從上述RNA 樣品中富集mRNA 并進(jìn)行超聲處理，以片段化的mRNA 為模板合成cDNA 第一鏈，隨后用RNaseH 降解RNA 鏈，并在DNA polymerase Ⅰ體系下，在第二鏈合成時(shí)加入dNTPs 補(bǔ)齊雙鏈DNA的末端。在純化后的雙鏈DNA 的兩端各加上1 個(gè)A 堿基后與末端帶有T 堿基的接頭進(jìn)行連接，使用AMPure XP beads磁珠篩選200 bp 左右的cDNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并再次純化后獲得cDNA 文庫，選擇DNA 1000assay Kit 對文庫進(jìn)行質(zhì)檢合格后，使用IlluminaHiSeq TM 2500 測序儀測序。利用HISAT2 將雙端測序得到的序列比對到參考基因組（ NCBI_ASM982982v1）。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析和差異表達(dá)基因篩選 測序原始數(shù)據(jù)raw reads 利用fastp 過濾和質(zhì)控得到cleanreads[10]。使用短reads 比對工具Bowtie 2將cleanreads 比對到可可毛色二孢的核糖體數(shù)據(jù)庫[11]，在不允許錯(cuò)配情況下去除比對上核糖體的reads，將保留下來的unmapped reads 用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組分析。利用DESeq2軟件比較不同處理的樣品與對照樣品，從而鑒定差異基因[12]。以FDR<0.05 且|log2（FC）|>1 為標(biāo)準(zhǔn)篩選識別顯著變化的差異表達(dá)基因（ DEG ）， 并對差異基因進(jìn)行GO（ http：//www.geneontology.org/ ） 功能分析和KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/）通路富集分析。另外，使用HMMER3.0 軟件和BLASTP 程序比對含有細(xì)胞色素P450 蛋白結(jié)構(gòu)域、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶蛋白結(jié)構(gòu)域和ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域的序列，篩選后比對到轉(zhuǎn)錄組差異基因篩選結(jié)果中，結(jié)合差異基因功能和通路富集分析結(jié)果篩選與抗藥性相關(guān)的解毒代謝基因。

1.2.4 差異表達(dá)基因的定量驗(yàn)證3個(gè)菌株分別設(shè)10 mg/L 咪鮮胺處理組和未處理組（對照），每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)。提取芒果可可毛色二孢菌株總RNA 并使用RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，使用ChamQ Universal qPCR SYBRMaster Mix 配制熒光定量檢測體系，以actin 基因作為內(nèi)參基因測定差異基因表達(dá)量。使用PrimerPremier 5 軟件設(shè)計(jì)特異性引物（表1），所有引物均由楠山科技有限公司（海南）合成。qPCR 反應(yīng)體系：2×ChamQ Universal qPCR SYBR Master Mix10 μL、10 μmol/L 上/下游引物各0.4 μL、cDNA 模板1 μL、ddHO 8.2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，循環(huán)42 次。每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)性重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用2?ΔΔCT 方法計(jì)算基因相對表達(dá)量[13]。使用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 咪鮮胺處理對菌株的作用

供試3個(gè)菌株對咪鮮胺的EC50 值在0.12～3.92 mg/L 之間，與敏感菌株DF04 相比，抗性菌株HL02和M108的抗性倍數(shù)分別為7.67倍和32.67倍（表2）。咪鮮胺敏感菌株的菌絲生長受藥劑的抑制，除了菌落大小的差異，菌絲也較抗性菌株稀薄。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

3個(gè)菌株分別設(shè)10mg/L 咪鮮胺處理組和未處理組，共6個(gè)樣品，每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)。過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，從8 個(gè)文庫中生成了超過50 億個(gè)clean reads，3 個(gè)重復(fù)的平均Q介于97.10%～97.443%之間，Q介于92.375%～93.09%之間，GC 含量介于58.46～58.71 之間（表3）。質(zhì)控后的clean reads 數(shù)超過3500 萬條，其中超過90.81%（unique map）比對到參考基因組唯一位置上，全部的可以定位到基因組上的reads數(shù)量及占有效reads 比例（total mapped）超過91.40%。以上結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量高，可用于后續(xù)生物信息學(xué)分析。

2.3 差異表達(dá)基因表達(dá)分析

以FDR<0.05 且|log2（FC）|>1 為條件進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選。差異基因火山圖數(shù)據(jù)顯示（圖1A），10 mg/L 咪鮮胺處理（Pro）與未處理（CK）樣品間的基因表達(dá)水平及差異基因數(shù)量存在差異：經(jīng)10 mg/L 咪鮮胺處理后的抗性菌株HL02、M108 分別有609、1570 個(gè)顯著上調(diào)表達(dá)基因，539、998 個(gè)顯著下調(diào)表達(dá)基因；而敏感菌株DF04有2026 個(gè)顯著上調(diào)表達(dá)基因，3316 個(gè)顯著下調(diào)表達(dá)基因，敏感菌株的差異基因數(shù)量顯著高于抗藥菌株。韋恩圖顯示（圖1B），3 個(gè)菌株添加咪鮮胺處理前、后共有566 個(gè)差異表達(dá)基因。

針對咪鮮胺處理后抗性菌株與敏感菌株之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，結(jié)果表明，抗性菌株HL02、M108 分別有2078、3096 個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，1527、1793 個(gè)下調(diào)表達(dá)基因（圖2），上調(diào)表達(dá)基因數(shù)量遠(yuǎn)大于下調(diào)表達(dá)基因。

2.4 咪鮮胺caWio5UGbH3r9GPI2F1ULw==處理后的差異表達(dá)基因GO富集分析

GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，咪鮮胺處理后的抗性和敏感菌株的差異表達(dá)基因分別集中在生物學(xué)進(jìn)程（biological process）、分子功能（molecularfunction）及細(xì)胞組分（cellular component）方面，其中，基因功能主要集中在27 個(gè)term 中，它們的差異表達(dá)基因數(shù)均大于100。生物學(xué)進(jìn)程中富集的差異基因數(shù)量最多，主要富集在細(xì)胞過程（cellular process）和代謝過程（metabolic process），其中，DF04 vs HL02 中分別有2249（18%）、2005（16%）個(gè)DEGs，DF04 vs M108 中分別有3073（17%）、2683（15%）個(gè)DEGs。分子功能進(jìn)程中差異表達(dá)基因主要富集在結(jié)合（binding）、催化活性（catalytic activity），DF04 vs HL02 中分別有1774（38%）、1606（35%）個(gè)DEGs，DF04 vsM108 中分別有2422（38%）、2095（33%）個(gè)DEGs。細(xì)胞組分進(jìn)程中的差異表達(dá)基因顯著富集在細(xì)胞結(jié)構(gòu)體（cellular anatomical entity）和含蛋白質(zhì)復(fù)合物（protein-containing complex）中，DF04 vs HL02中分別有1846（67%）、899（32%）個(gè)DEGs，DF04vs M108 中分別有2573（65%）、1354（34%）個(gè)DEGs（圖3）。2 個(gè)抗性菌株HL02、M108 與敏感菌株DF04 之間的差異表達(dá)基因分類趨勢表現(xiàn)一致，但DF04 vs M108 比對的差異表達(dá)基因高于DF04 vs HL02。

2.5 咪鮮胺處理后差異表達(dá)基因KEGG信號通路富集

KEGG 信號通路富集分析結(jié)果顯示，咪鮮胺處理后的差異表達(dá)基因集中在代謝（metabolism）、遺傳信息處理（genetic information processing）、細(xì)胞過程（cellular processes）、環(huán)境信息處理（environmental information processing）及有機(jī)系統(tǒng)（organismal systems）通路，DF04 vsHL02 和DF04 vs M108 中DEGs 分別為1479、1961個(gè)DEGs?？剐跃昱c敏感菌株之間差異表達(dá)基因顯著富集在代謝通路中，代謝通路差異基因在DF04 vs HL02 和DF04 vs M108 比對中分別占64.98%和63.39%；其中，位于前五的分別是全局和總覽圖（global and overview maps）、碳代謝（carbon metabolism）、氨基酸代謝（amino acidsmetabolism）、脂質(zhì)代謝（lipid metabolism）和輔助因子和維生素的代謝（metabolism of cofactorsand vitamins）（圖4）。

2.6 與代謝抗性相關(guān)基因的篩選及表達(dá)分析

使用細(xì)胞色素P450蛋白結(jié)構(gòu)域、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶蛋白結(jié)構(gòu)域和ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域比對到參考基因組后，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分別篩選出46 個(gè)細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450）差異表達(dá)基因、19個(gè)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）差異表達(dá)基因和84個(gè)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABC transporter）差異表達(dá)基因。其中，抗敏菌株間基因表達(dá)水平存在明顯差異，被注釋為顯著差異表達(dá)基因的有：細(xì)胞色素P450差異表達(dá)基因27 個(gè)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶差異表達(dá)基因17 個(gè)和ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白差異表達(dá)基因59 個(gè)。聚類熱圖分析表明，與敏感菌株相比，2 個(gè)抗性菌株的差異表達(dá)基因基本一致。DF04 vs HL02 和DF04 vs M108 比對中，呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)P450s 基因分別有14 和15 個(gè)（圖5A），呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)GSTs基因分別有12 和11 個(gè)（圖5B），呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因分別有46 和47 個(gè)（圖5C）。

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，隨機(jī)選取4 個(gè)細(xì)胞色素P450 基因（56011963、56011911、56015966、56023668）、2 個(gè)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因（56016123、56022618）和2 個(gè)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（56013411、56014441）進(jìn)行qPCR 驗(yàn)證（圖6），結(jié)果表明差異表達(dá)基因變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致，說明該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠。

代謝抗性相關(guān)的基因中，與敏感菌株相比，在2 個(gè)抗性菌株中均呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)的基因包括：7 個(gè)P450s 基因、8 個(gè)GSTs 基因和11 個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（表4）。上述基因在芒果可可毛色二孢對咪鮮胺的解毒代謝中可能發(fā)揮重要作用，抗性菌株表達(dá)水平的變化很可能與可可毛色二孢菌株抗藥性相關(guān)。

3討論

苯并咪唑類及甲氧丙烯酸酯類均為高抗性風(fēng)險(xiǎn)的殺菌劑，在國內(nèi)的海南及國外的阿曼均有發(fā)現(xiàn)。芒果蒂腐病菌可可毛色二孢對苯并咪唑類多菌靈、甲基硫菌靈和甲氧丙烯酸酯類吡唑醚菌酯、嘧菌酯等已經(jīng)產(chǎn)生嚴(yán)重抗藥性，在田間形成了具有較高抗性水平的抗藥性亞種群[14-17]；此外，在木瓜上有報(bào)道蒂腐病菌可可毛色二孢對甲基硫菌靈和嘧菌酯產(chǎn)生抗藥性[18]。被劃分為中等抗性風(fēng)險(xiǎn)的甾醇脫甲基抑制劑類（DMIs）如咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑等，單用或者作為復(fù)配制劑廣泛應(yīng)用于芒果病害防治，但目前生產(chǎn)上已經(jīng)出現(xiàn)敏感性下降或藥效降低的現(xiàn)象。咪鮮胺主要通過抑制植物病原真菌細(xì)胞膜上麥角甾醇的生物合成從而抑制菌絲生長，作為內(nèi)吸性殺菌劑同樣存在作用位點(diǎn)單一的缺點(diǎn)，長期使用同樣具有產(chǎn)生抗藥性的潛在危險(xiǎn)。WANG 等[19-20]發(fā)現(xiàn)我國海南芒果可可毛色二孢對DMI 類殺菌劑苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺存在敏感性下降，并發(fā)現(xiàn)抗藥性菌株與戊唑醇存在正交互抗性。

據(jù)報(bào)道，已有許多植物病原真菌對DMI 類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性，如桃褐腐病菌（Moniliniafructicola）[21-22]，蘋果黑星病菌（Venturia inaequalis）[23]。DMI 類殺菌劑的抗藥性機(jī)制較為復(fù)雜，抗藥性菌株除了存在靶標(biāo)抗性，即殺菌劑靶標(biāo)14α-脫甲基酶CYP51 基因突變和過表達(dá)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性[19， 24-26]；還包括外排轉(zhuǎn)運(yùn)和解毒代謝酶的變化導(dǎo)致代謝抗性。研究指出，DMI類藥劑的靶標(biāo)基因CYP51 的點(diǎn)突變、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AtrD 和MFS 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Mfs1 的誘導(dǎo)表達(dá)，均有可能介導(dǎo)灰葡萄孢（Botrytis cinerea）高抗突變體對啶菌噁唑的抗藥性[ 2 7 ]。研究發(fā)現(xiàn)ABC-G 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的過量表達(dá)是導(dǎo)致草坪草幣斑病病菌（Sclerotinia homoeocarpa）對丙環(huán)唑產(chǎn)生抗藥性的原因[28]。ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠?qū)⒂H脂性藥物和代謝產(chǎn)物排出體外，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AG1IA_06082 的過表達(dá)能夠增強(qiáng)立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）對殺菌劑SYP-14288 的外排作用從而導(dǎo)致病原菌對殺菌劑的抗藥性[29]。WANG 等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，芒果可可毛色二孢咪鮮胺抗性菌株CYP51 基因及ABCG 基因的過表達(dá)與抗藥性的產(chǎn)生有關(guān)。這些研究說明抗藥性產(chǎn)生的機(jī)制不是單一的，可能存在多種機(jī)制。有研究表明解毒代謝相關(guān)基因的特異性表達(dá)與病原菌抗藥性有關(guān)，如細(xì)胞色素P450，這是一類由含鐵血紅素蛋白組成的超家族單加氧酶，具有廣泛的底物特異性，能夠催化多種氧化和還原反應(yīng)[30]。此外，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）通過催化谷胱甘肽與各種疏水性和親電性基團(tuán)的結(jié)合參與解毒代謝[31]。細(xì)胞色素P450 基因AG1IA_05136 和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因AG1IA_07383 過表達(dá)增強(qiáng)立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）的解毒代謝，與病原菌對解偶聯(lián)劑SYP-14288、百菌清和苯醚甲環(huán)唑的多藥抗性有關(guān)[32]。上述研究表明，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、細(xì)胞色素P450 基因和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因過表達(dá)均與病菌抗藥性密切相關(guān)。

大量文獻(xiàn)報(bào)道轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）可以篩選及挖掘抗藥性相關(guān)基因，如HELLIN等[33]通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)Fusarium culmorum 在經(jīng)過戊唑醇處理后，抗性菌株ABC1基因的表達(dá)量明顯高于敏感菌株的表達(dá)量。ZHANG 等[34] 通過RNA-seq 發(fā)現(xiàn)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和MFS 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因參與了Penicillium italicum 對咪鮮胺的抗藥性。目前尚未有代謝酶參與可可毛色二孢抗藥性的研究報(bào)道。因此，本研究采用RNA-seq 技術(shù)分析對芒果可可毛色二孢咪鮮胺的抗敏菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，對咪鮮胺處理后抗敏菌株之間差異表達(dá)基因的分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)抗性菌株的差異表達(dá)基因主要集中在代謝通路中。根據(jù)GO 分析和KEGG 信號通路富集分析，將篩選出的與解毒代謝相關(guān)的細(xì)胞色素P450 基因、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因和ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因進(jìn)行進(jìn)一步比較，發(fā)現(xiàn)2個(gè)抗性菌株的表達(dá)模式基本一致。本研究從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出的7 個(gè)細(xì)胞色素P450 基因、8個(gè)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因和11個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在咪鮮胺抗敏菌株間顯著上調(diào)表達(dá)。其中，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因56017578 和56024245 在GO功能注釋上被認(rèn)為是編碼多藥耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因，在灰葡萄孢上發(fā)現(xiàn)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因BcatrB 敲除突變體對植物抗毒素白藜蘆醇和殺菌劑拌種咯的敏感性均增加[35]，煙曲霉中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因atrF 的過表達(dá)被證明與伊曲康唑耐藥性相關(guān)[36]。已有研究報(bào)道煙曲霉和白色念珠菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的多藥耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因過表達(dá)可能導(dǎo)致真菌的多藥抗性[37]。其它差異表達(dá)基因并沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道與殺菌劑抗藥性相關(guān)，推測這些基因很可能與芒果可可毛色二孢菌株對咪鮮胺的抗藥性有關(guān)，但這些基因是否真正參與病原菌抗藥性還需要采用基因過表達(dá)、基因敲除和RNAi 等方法進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究首次對可可毛色二孢進(jìn)行代謝抗藥性的研究，并發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞色素P450、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶和ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在咪鮮胺處理芒果可可毛色二孢后顯著上調(diào)表達(dá)，表明芒果可可毛色二孢對咪鮮胺的抗藥性可能與多種代謝途徑相關(guān)。