基于“藥物-靶點-通路”網(wǎng)絡的血必凈注射液治療COVID-19作用機制研究

楊冬梅,霍艷杰,陳臨江,曾 陽,袁志鷹,庹勤慧,趙洪慶

(湖南中醫(yī)藥大學,湖南 長沙410208)

由2019新型冠狀病毒(2019-novel coronavirus,2019-nCo V)引發(fā)的新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)在全球范圍內(nèi)流行,嚴重威脅人們身體健康[1]。新型冠狀病毒肺炎的臨床分型根據(jù)病情危重程度主要為輕型、普通型、重型與危重型[2]。研究發(fā)現(xiàn),在COVID-19重癥及危重癥患者血漿中中性粒細胞數(shù)量增加,淋巴細胞數(shù)量顯著降低,而多種促炎因子表達水平明顯上升[3-5]。其中,危重型患者免疫系統(tǒng)已經(jīng)完全紊亂,因炎性因子大量產(chǎn)生而出現(xiàn)細胞因子風暴[6-7]。而細胞因子風暴發(fā)生迅速,是新型冠狀肺炎重型患者發(fā)展為危重型患者的主要原因。

血必凈注射液作為國家中藥二類新藥,于非典時期上市,主要應用于膿毒血癥、多臟器功能衰竭綜合征、肺心病急性加重期、急性肺損傷與急性呼吸窘迫綜合征、急性胰腺炎等疾病的治療[8-11]。2020年4月12日,經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局批準,血必凈新增適應證:“可用于新型冠狀病毒肺炎重型、危重型的全身炎癥反應綜合征或/和多臟器功能衰竭”[12]。本研究擬采用網(wǎng)絡藥理學方法分析血必凈注射液活性成分通過調(diào)節(jié)免疫與炎癥反應治療COVID-19的作用機制,為其臨床運用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

數(shù)據(jù)庫:中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP,http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php);Uniprot數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/);STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd/);DisGeNT數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/);DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)。

軟件:可 視 化cytoscape3.5.1軟 件、pymol軟 件 與Autodock4.2分子對接軟件,易漢博作圖軟件(http://www.ehbio.com/ImageGP/index)。

1.2 藥物活性成分收集與篩選

利用TCMSP收集血必凈注射液:丹參、赤芍、紅花、川芎、當歸五味中藥的主要化學成分。根據(jù)人體對藥物吸收、分布、代謝及排泄/毒性的藥動學參數(shù),以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug likeness,DL)≥0.18為篩選條件,初步篩選出血必凈注射液潛在具有較高活性的化合物。

1.3 血必凈注射液作用靶點的預測

基于篩選的活性成分預測化合物的作用靶點,經(jīng)Drug-Bank數(shù)據(jù)庫將化合物分子結構與測出的靶點,經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫轉化為基因簡稱命名。

1.4 篩選血必凈注射液關鍵活性成分

將血必凈注射液潛在具有較高活性的化合物與成分導入cytoscape 3.5.1軟件進行可視化,通過Network Analyzer功能對網(wǎng)絡節(jié)點中心性進行分析,設置節(jié)點度(degree)值大于所有節(jié)點連接度2倍中位數(shù)為標準進行篩選,確定關鍵節(jié)點。

1.5 COVID-19相關靶點構建

本研究基于TTD、DisGeNT數(shù)據(jù)庫構建COVID-19免疫與炎癥相關靶點。利用在線韋恩圖工具,將COVID-19基因靶點與血必凈注射液活性成分靶點進行映射。

1.6 蛋白質相互作用網(wǎng)絡構建

將COVID-19基因靶點與血必凈注射液活性成分靶點進行映射結果導入STRING數(shù)據(jù)庫限定物種為Homo sapiens,設定最低要求互動分數(shù)為中度信度0.400得到蛋白相互作用(PPI)相關信息。導入Cytoscape 3.7.1軟件進行可視化,并利用Network analyzer功能對PPI網(wǎng)絡圖進行拓撲分析,根據(jù)大于平均Degree值對共有靶點進行篩選分析。

1.7 GO富集分析與KEGG通路分析

篩選出關鍵作用蛋白導入DAVID數(shù)據(jù)庫,設定“Background”為“Homo sapiens”,P<0.05,分別導出細胞組分(CC)、分子功能(MF)、生物過程(BP)進行GO分析。根基P<0.05,KEGG富集分析,篩選免疫與炎癥反應相關通路。

1.8 成分-靶點分子對接

從PDB數(shù)據(jù)庫下載SARS-Co V-2 3CL水解酶的3D結構pdb格式文件,移除靶蛋白中的配體和非蛋白分子,保存為pdb后綴的文件。從PubChem數(shù)據(jù)庫下載化合物2D結構的sdf格式文件。利用pymol軟件先上傳去水加氫后的蛋白質文件,將其轉化為pdbqt格式文件,采用Auto Dock4.2進行分子對接,選取結合能<-5 kJ?mol-1且構象較好的結果作為分子對接結果。

2 結果

2.1 血必凈注射液活性成分收集與篩選

血必凈注射液中丹參65個活性成分、赤芍29個活性成分、紅花20個活性成分、川芎7個活性成分、當歸2個活性成分,剔除重復數(shù)據(jù),血必凈注射液共有116種活性成分,見表1。

2.2 血必凈注射液活性成分-靶點網(wǎng)絡圖

以網(wǎng)絡節(jié)點中的拓撲結構特征值“連接度(degree)”成分-靶點網(wǎng)絡圖中,364個節(jié)點,1 687條相互作用關系(圖1),即選擇degree大于其中位數(shù)值2倍以上的節(jié)點作為關鍵候選靶點(degree≥18),得到關鍵靶點59個節(jié)點,595條相互作用關系,其中關鍵成分29個。以degree排序前10進行展示(表2),分別是槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇、黃芩素、山柰酚、丹參酮IIA、鼠尾草酚酮、4-亞甲丹參新酮、二氫異丹參酮。

2.3 基于抗炎,調(diào)節(jié)免疫作用血必凈注射液治療COVID-19的潛在靶點

基于TTD、DisGeNT數(shù)據(jù)庫構建COVID-19的免疫與炎癥反應靶點541個。利用在線韋恩圖工具,將COVID-19基因靶點與血必凈注射液活性成分靶點進行映射得到血必凈與COVID-19共同靶點75個(圖2A)。通過構建成分-炎癥、免疫靶點網(wǎng)絡(圖2B),得到159個節(jié)點,1 438條相互作用關系。經(jīng)degree大于中位數(shù)值2倍進行篩選,得到關鍵蛋白靶點55個,關鍵活性成分4個,864條相互作用關系。其中大于平均中介中心性0.014 5的關鍵靶點9個(圖2C)。

圖2 活性成分-炎癥、免疫靶點網(wǎng)絡

2.4 GO富集與KEGG通路分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對篩選出的55個關鍵作用靶點進行GO富集分析及KEGG信號通路富集(P≤0.05)分析。GO富集分析得到GO生物進程(biological process,BP)93個,包括RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調(diào)控、炎癥反應、內(nèi)毒素調(diào)節(jié)信號通路、血管生成、免疫反應、調(diào)節(jié)細胞增殖等生物過程,分子功能(molecular function,MF)17種,細胞組分(cellular component,CC)11種。根據(jù)P值進行排序,選擇前10個進行展示(圖3)。

圖3 GO富集分析

KEGG通路分析得到通路87條,與炎癥免疫相關27條,包括toll樣受體信號通路、甲型流感、T細胞受體信號通路、HIF-1信號通路、炎癥性腸病(IBD)、NF-κB信號通路、細胞因子間受體的相互作用、PI3K-Akt信號通路、RIG-I樣受體信號通路(表3、圖4)。

圖4 KEGG通路分析氣泡圖

表3 KEGG通路分析

2.5 核心成分與SARS-CoV-2 3CL水解酶分子對接

將“2.2”與“2.3”關鍵活性化合物與SARS-Co V-2 3CL水解酶對接,選取結合能<-5 kJ?mol-1,篩選出12種活性化合物,見表4與圖5。

圖5 部分關鍵活性化合物與SARS-CoV-2 3CL水解酶對接結果

表4 關鍵活性化合物對接結果

3 討論

COVID-19患者大多表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力和干咳等癥狀,預后良好。但少數(shù)重型和危重型患者可快速進展為膿毒癥休克、出凝血功能障礙及多器官衰竭等,往往預后不良。而研究發(fā)現(xiàn)SARS-Co V-2感染導致的免疫反應過激與炎癥因子風暴是上述并發(fā)癥產(chǎn)生,以及患者死亡的罪魁禍首[3]。血必凈注射液是我國被批準治療膿毒癥、全身炎癥反應綜合征及多器官衰竭的中成藥,由丹參、紅花、當歸、赤芍、川芎組成,起效迅速、療效顯著[13]。自COVID-19暴發(fā)以來,血必凈注射液在治療危重型肺炎患者中發(fā)揮重要作用[14]。但其具體作用于SARS-Co V-2的分子機制尚不十分清楚。因此,本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法結合分子對接技術,從“藥物-靶點-通路”角度入手,探討血必凈注射液治療SARS-Co V-2的分子機制,為臨床合理應用提供科學依據(jù)。

利用TCMSP收集血必凈注射液共有116種活性成分。經(jīng)TCMSP、DrugBank數(shù)據(jù)庫篩選關鍵靶點59個節(jié)點,595條相互作用關系,其中關鍵成分29個。排序前十的核心化合物分別為槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇、黃芩素、山柰酚、丹參酮IIA、鼠尾草酚酮、4-亞甲丹參新酮、二氫異丹參酮。經(jīng)TTD、DisGeNT數(shù)據(jù)庫篩選出COVID-19相關的免疫與抗炎相關靶點541個,在這些靶點中,血必凈與COVID-19交集有75個共同靶點。構建中藥-成分-靶點網(wǎng)絡圖;利用STRING數(shù)據(jù)庫構建蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡圖,篩選出關鍵蛋白靶點55個,關鍵活性成分4個,864條相互作用關系。其中大于平均中介中心性0.014 5的關鍵靶點9個,分別是PTGS2、IL6、PTGS1、ADRB2、NR3C1、PPARG、VEGFA、TP53、HSP90AA1。

GO富集分析結果顯示,與關鍵靶基因相關的生物過程主要涉及RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調(diào)控、炎癥反應、內(nèi)毒素調(diào)節(jié)信號通路、血管生成、免疫反應、調(diào)節(jié)細胞增殖等生物過程,提示血必凈注射液通過調(diào)控這些生物過程從而抗COVID-19。KEGG通路分析關鍵靶點與免疫炎癥相關27條,包括toll樣受體信號通路、甲型流感、T細胞受體信號通路、HIF-1信號通路、炎癥性腸病(IBD)、NF-κB信號通路、細胞因子間受體的相互作用、PI3K-Akt信號通路、RIG-I樣受體信號通路,其中NF-κB信號通路在炎癥反應和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[15-16],可減輕SARS-Co V-2引起炎性因子釋放和異常增多,減少肝、肺、腎等組織的損傷[17-18]。同時發(fā)現(xiàn),IL6、PTGS2等靶點參與上述多條炎癥信號通路,表明血必凈注射液可通過免疫調(diào)節(jié),抑制細胞釋放炎性因子,從而降低SARS-Co V-2對肺組織的損傷,促進肺部細胞的修復與再生,達到緩解肺炎癥狀的效果[19]。分子對接結果顯示,血必凈注射液主要活性成分與SARSCo V-2 3CL水解酶這一具有較好的結合活性,分子構象結合穩(wěn)定,進一步驗證了血必凈注射液可通過與SARS-Co V-2靶蛋白結合起到抗COVID-19的作用。

綜上,本研究以血必凈注射液的活性成分、靶蛋白、信號通路的調(diào)控網(wǎng)絡為基礎,通過網(wǎng)絡藥理學、分子對接揭示血必凈注射液對COVID-19免疫調(diào)節(jié)與抑制炎癥的作用機制,為臨床應用血必凈治療重癥COVID-19患者提供理論參考。