乳腺浸潤(rùn)性小葉癌組織中miR-211-5p、SETBP1 的表達(dá)及其意義

翁向前 王葉凌 林 冰 張 爽 蘇 俊

1.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院放療科，海南海口 570102；2.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普外科，海南?？?570102

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，全球每年新發(fā)病例約210 萬(wàn)例[1]。乳腺癌中以浸潤(rùn)性小葉癌（infiltrating lobular carcinoma，ILC）最為常見(jiàn)。ILC 患者即使采取積極治療，治療后患者的生存預(yù)后仍較差，因此有必要探索ILC 新的診斷方法及治療手段[2]。微RNA（microRNA，miR）是小的RNA 分子，與自身免疫性疾病、腫瘤及心血管疾病等的病理生理學(xué)過(guò)程密切相關(guān)[3-4]。miR-211-5p 基因位于15q13.3，在腎癌[5]、宮頸癌[6]等多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，發(fā)揮抑癌基因的作用。SET 結(jié)合蛋白1（SET binding protein 1，SETBP1）基因位于18q12.3，SETBP1 能夠結(jié)合細(xì)胞核內(nèi)SET 原癌基因，促進(jìn)細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)，SETBP1 在多發(fā)骨髓瘤、髓系白血病等惡性腫瘤中異常表達(dá)升高，并能夠促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展[7]。研究表明，SETBP1 受到多種miRNA（miR-4319、miR-211-5p 等）的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控，腫瘤發(fā)生時(shí)調(diào)控SETBP1 的miRNA 表達(dá)異常降低，而SETBP1 表達(dá)升高，其共同參與腫瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展[8]，本研究通過(guò)分析miR-211-5p、SETBP1 在ILC 患者中的表達(dá)，探討兩者的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019 年1 月至2020 年9 月海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院診治的82 例女性ILC 患者的臨床病理資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)組織病理檢查確診為ILC；②首次診治；③患者對(duì)本研究知情同意，能夠配合診治。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有急性乳腺炎、乳腺膿腫等感染性疾??；②既往有其他惡性腫瘤病史；③合并肺腎等臟器衰竭；④伴有嚴(yán)重心肺功能障礙。年齡30～79 歲，平均（53.1±6.2）歲；腫瘤大小≤2 cm 者39 例，>2 cm 者43 例；伴腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31 例，無(wú)腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者51 例；按照2016 年第八版AJCC 乳腺癌TNM 臨床分期標(biāo)準(zhǔn)[9]：Ⅰ～Ⅱ期62 例，Ⅲ～Ⅳ期20 例；組織分化程度：高中分化56 例，低分化26 例；孕激素受體（progesterone receptor，PR）陰性34 例，陽(yáng)性48 例；雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽(yáng)性31 例，陰性51 例；依據(jù)免疫組織化學(xué)染色和熒光原位雜交檢測(cè)結(jié)果判斷c-erbB2的染色結(jié)果，陽(yáng)性63 例，陰性19 例；三陰乳腺癌18 例，非三陰乳腺癌64 例。

1.2 熒光定量PCR 檢測(cè)

收集術(shù)中新鮮獲取的ILC 癌組織及癌旁組織（距離癌組織邊緣>2 cm 且經(jīng)病理學(xué)檢查明確），置于液氮中凍存。實(shí)驗(yàn)時(shí)取約50 mg 組織，Trizol 法提取組織中總RNA，分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司，B-500 型）測(cè)定RNA 溶液的吸光度值，將合格的總RNA 用DEPC 水溶解，-80℃條件下保存。以總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。以cDNA 為模板，進(jìn)行熒光定量PCR。SYBR Green premix plus 試劑盒購(gòu)自TAKARA 公司，貨號(hào)DRR041A。購(gòu)自miR-211-5p正向引物序列：5’-ACGGGAAAGGTTGAAAGGATT-3’，反向引物序列：5’-GGGAAAGGTTGAAAGGATTGT-3’，內(nèi)參U6 正向引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物序列：5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’；SETBP1 正向引物序列：5’-CCAACGCGGACAGTGAGAAAT-3’，反向引物序列：5’-CCTCCTTCGTGGCTTTGCTAT-3’，以GAPDH 為內(nèi)參，正向引物序列：5’-CTGGGCTACACTGAGCACC-3’，反向引物序列：5’-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3’。總體系20 μl，其中模板2 μl，聚合酶0.2 μl、上游及下游引物各1 μl、2XSYBR Green Premix 10 μl 及ddH2O 5.8 μl。反應(yīng) 條件為：94℃2 min，94℃15 s，62℃20 s，70℃10 s，變性退火延伸共35 個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本重復(fù)3 次。目的基因miR-211-5p、SETBP1 的表達(dá)水平分別相對(duì)于內(nèi)參基因U6、DAPDH 的比值為2-ΔΔCt，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)。Pearson 線性相關(guān)分析miR-211-5p 與SETBP1 表達(dá)的相關(guān)性。采用TargetScan Human7.2 在線軟件預(yù)測(cè)miR-211-5p 與SETBP1 的結(jié)合位點(diǎn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ILC 癌與癌旁組織中miR-211-5p 與SETBP1 表達(dá)差異

ILC 癌組織中miR-211-5p 的相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），而SETBP1的相對(duì)表達(dá)量顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 ILC 癌與癌旁組織中miR-211-5p 與SETBP1表達(dá)水平比較（）

表1 ILC 癌與癌旁組織中miR-211-5p 與SETBP1表達(dá)水平比較（）

注：ILC：浸潤(rùn)性小葉癌；miR-211-5p：微小RNA-221-5p；SETBP1：SET 結(jié)合蛋白1

2.2 ILC 癌組織中miR-211-5p、SETBP1 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

不同年齡、腫瘤大小、組織分化程度、ER 表達(dá)、PR 表達(dá)、c-erbB2 表達(dá)、三陰性表達(dá)的癌組織中miR-211-5p、SETBP1 表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。與腫瘤TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期ILC 癌組織比較，腫瘤TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期的ILC 癌組織中miR-211-5p 表達(dá)顯著較低，而SETBP1 的表達(dá)顯著較高（P ＜0.05）。與無(wú)腋淋巴轉(zhuǎn)移ILC 癌組織比較，伴腋淋巴轉(zhuǎn)移的ILC 癌組織中miR-211-5p 表達(dá)顯著較低，而SETBP1的表達(dá)顯著較高（P ＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 癌組織中miR-211-5p、SETBP1 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（）

表2 癌組織中miR-211-5p、SETBP1 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（）

注：ER：雌激素受體；PR：孕激素受體；miR-211-5p：微小RNA-221-5p；SETBP1：SET 結(jié)合蛋白1

2.3 ILC 癌組織中miR-211-5p、SETBP1 表達(dá)的相關(guān)性

ILC 癌組織中miR-211-5p 的相對(duì)表達(dá)量與SETBP1 的相對(duì)表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.573，P <0.001）。見(jiàn)圖1。

圖1 癌組織中miR-211-5p 與SETBP1 相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性

2.4 miR-211-5p 與SETBP1 的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

TargetScan Human7.2 在線軟件對(duì)miR-211-5p與SETBP1 的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示SETBP1的3’UTR 區(qū)第374 至381 個(gè)堿基處存在與miR-211-5p 潛在的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。見(jiàn)圖2。

圖2 TargetScan Human7.2 在線軟件預(yù)測(cè)miR-211-5p與SETBP1 的結(jié)合位點(diǎn)

3 討論

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，我國(guó)每年發(fā)病例數(shù)達(dá)16.9 萬(wàn)例，死亡例數(shù)達(dá)4.5 萬(wàn)例[10-13]。深入研究ILC 發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，對(duì)尋找新的診斷治療靶點(diǎn)，意義較大。腫瘤的生物學(xué)特征包括無(wú)限增殖、凋亡抑制、過(guò)度腫瘤血管生成、獲得浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力、免疫逃逸、代謝異常及基因組不穩(wěn)定和突變。研究表明，腫瘤中存在多種miRNA 異常表達(dá)升高或降低的現(xiàn)象，并通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移等惡性行為，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[14]。

miR-211-5p 基因位于人類15 號(hào)染色體，其能夠結(jié)合下游靶基因信使RNA 的3’非編碼區(qū)，降低靶基因信使RNA 的穩(wěn)定性，抑制下游靶基因的蛋白表達(dá)[15]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miR-211-5p 在腎細(xì)胞癌[16]、宮頸癌[17]等腫瘤中均存在表達(dá)降低的現(xiàn)象，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖，凋亡減少。本研究中，ILC 癌組織中miR-211-5p 的相對(duì)表達(dá)量顯著低于癌旁組織。目前miR-211-5p 表達(dá)降低的機(jī)制尚不清楚，可能與長(zhǎng)鏈非編碼RNA 如F11-AS1 等對(duì)miR-211-5p 的表達(dá)調(diào)控異常有關(guān)。有研究報(bào)道，長(zhǎng)鏈非編碼RNA F11-AS1 能夠作為分子海綿結(jié)合并抑制miR-211-5p 的表達(dá)，降低miR-211-5p 的表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)下游癌基因核受體亞家族成員3 的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤的惡性進(jìn)展[18]。本研究結(jié)果亦顯示，與腫瘤TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期ILC 癌組織比較，腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期的ILC 癌組織中miR-211-5p 表達(dá)顯著較低（P ＜0.05）。與無(wú)腋淋巴轉(zhuǎn)移ILC 癌組織比較，伴腋淋巴轉(zhuǎn)移的ILC 癌組織中miR-211-5p 表達(dá)顯著較低（P ＜0.05）。提示miR-211-5p 的低表達(dá)參與促進(jìn)ILC 的發(fā)生發(fā)展。腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖及轉(zhuǎn)移潛能是腫瘤的重要特征。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-211-5p在腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用，miR-211-5p 能夠結(jié)合癌基因Ezrin 信使RNA 的3’非編碼區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)，抑制Ezrin 的表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-211-5p 后，Src 信號(hào)通路受到抑制，腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力減弱，因此，腫瘤中miR-211-5p 表達(dá)水平降低激活腫瘤細(xì)胞中Src 信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤的增殖及淋巴轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展[19]。

SETBP1 位于人類18 號(hào)染色體，參與個(gè)體正常細(xì)胞的增殖、分化及發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程。近年來(lái)有學(xué)者報(bào)道，SETBP1 作為一種致癌基因，在慢性粒細(xì)胞白血病、骨髓瘤等腫瘤中存在異常表達(dá)升高的現(xiàn)象，其表達(dá)水平升高能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。本研究中，ILC 癌組織中SETBP1 的表達(dá)水平亦顯著升高，其機(jī)制尚不清楚。有學(xué)者在白血病中發(fā)現(xiàn)，SETBP1 基因的SKI 同源域內(nèi)有4 個(gè)氨基酸突變熱點(diǎn)，這些基因位點(diǎn)的突變導(dǎo)致泛素連接酶對(duì)底物的識(shí)別能力降低，導(dǎo)致泛素連接酶降解SETBP1 的功能喪失，引起SETBP1表達(dá)的上調(diào)，SETBP1 能夠進(jìn)一步激活Janus 激酶1，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖[20-21]。本研究中，與腫瘤TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期及無(wú)液淋巴轉(zhuǎn)移ILC 癌組織比較，腫瘤TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期及伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者ILC 癌組織中SETBP1 表達(dá)較高，提示SETBP1 的高表達(dá)參與促進(jìn)ILC 的惡性進(jìn)展。其機(jī)制目前尚不清楚，SETBP1 能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的局部浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的發(fā)生。有學(xué)者在肺癌中發(fā)現(xiàn)，SETBP1 能夠誘導(dǎo)肺腫瘤細(xì)胞N-鈣黏素及Vimentin 等間質(zhì)性表達(dá)，而上皮性標(biāo)志如E-鈣黏素表達(dá)降低，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換，細(xì)胞間黏附能力下降，腫瘤細(xì)胞易發(fā)生局部浸潤(rùn)及淋巴管侵犯，導(dǎo)致腫瘤分期升高及腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[22-25]。

本研究中ILC 癌組織中miR-211-5p 與SETBP1表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)，其原因可能是SETBP1 是miR-211-5p 的下游靶基因，SETBP1 的表達(dá)受到miR-211-5p 的調(diào)控。本研究結(jié)果亦顯示SETBP1 的3’非編碼區(qū)的第374 至381 個(gè)堿基處存在與miR-211-5p潛在的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。因此，miR-211-5p 可能通過(guò)結(jié)合SETBP1 信使RNA 的3’非編碼區(qū)，降低SETBP1信使RNA 穩(wěn)定性，抑制SETBP1 的表達(dá)。有研究亦證實(shí)，SETBP1 是miR-211-5p 的直接下游靶基因，miR-211-5p 能夠通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平抑制SETBP1 的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤增殖、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移[26-27]。但I(xiàn)LC 中二者的具體作用機(jī)制有待深入研究。

綜上所述，不同腫瘤TNM 分期及是否伴腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ILC 癌組織中miR-211-5p 和SETBP1 表達(dá)水平有差異，miR-211-5p 和SETBP1 共同參與ILC的發(fā)生發(fā)展病理過(guò)程。針對(duì)miR-211-5p 及SETBP1的調(diào)控或上游的調(diào)控分子進(jìn)行特異性靶向治療，可能是一種新的乳腺癌治療方式，但仍需多中心、大樣本的臨床資料深入研究?jī)烧叩呐R床意義。