綠色熒光碳點在活細胞中Fe3+檢測的應用

石利紅，董曉芮，張國梅，張彩紅，張彥

（山西大學 化學化工學院，山西 太原 030006）

0 引言

碳點（CDs）是一種新型的零維碳納米材料，是一種具有準球形形貌和納米級特征尺寸（＜10 nm）的納米顆粒［1］。2004 年 Xu［2］等人在制備單壁碳納米管時發(fā)現(xiàn)碳點是一種副產(chǎn)物，從此碳點的研究取得了迅速的進展，2006年對其進行了第一次合成。相對于傳統(tǒng)量子點，碳點具有一系列優(yōu)越的特性，如良好的水溶性、優(yōu)異的穩(wěn)定性、低毒性、易于功能化等，這些卓越的特性使其廣泛應用于如光催化［3-4］、生物成像［5-7］、離子檢測［8-12］、指紋檢測［13-14］、納米醫(yī)學［15-18］、傳感［19-21］等諸多領域。

目前，碳點的合成方法有很多，包括激光燒蝕［22-23］、電弧放電［24］、電化學氧化［25］、熱解［26-27］、模板合成法［28］等。盡管合成方法種類繁多，但它們普遍存在操作過程復雜、成本高、條件苛刻、難于控制等不可忽略的缺陷。水熱法［29］是一種起步較晚但廣泛使用的方法，它有效地克服了以上劣勢，顯示出操作簡便、易于控制、綠色環(huán)保等優(yōu)點。

鐵是人體內(nèi)不可缺少的微量元素，是血紅蛋白的主要原料之一，可以在血液中運輸氧和營養(yǎng)物質(zhì)，對人體許多生理過程都有著至關重要的作用。鐵攝入過量或不足都會對人體產(chǎn)生不利影響。例如，人體缺鐵會導致缺鐵性貧血、免疫功能下降、新陳代謝紊亂等；鐵攝入過多容易導致人體組織損傷，還易誘發(fā)糖尿病、色素沉著等癥狀。因此，探索高效可靠的檢測Fe3+的方法對人類生命健康尤為重要。目前測定鐵離子的方法包括熒光光譜法、分子吸收光譜法、高效液相色譜法、電化學法等。近幾年，碳點由于其具有優(yōu)異的性能而被研究者廣泛用于檢測鐵離子［30-32］。

本文以金銀花為碳源采用一步水熱法合成了綠色熒光碳點。以金銀花作為碳源的優(yōu)勢在于原料廉價易得，綠色環(huán)保。此外，該原料含有碳、氫、氧等元素，滿足了合成熒光碳點的需求。實驗采用的方法簡便易操作，獲得的碳點具有良好的親水性和生物兼容性，對Fe3+具有高的選擇性和靈敏度，能用于水溶液和活細胞中Fe3+的檢測。

1 實驗部分

1.1 主要試劑與儀器

金銀花（山西，中國）；AlCl3、AgCl、BiCl3、Ca-Cl2、CdCl2、CuCl2、FeCl3、CoCl2、HgCl2、KCl、MgCl2、MnCl2、NaCl、NiCl2、ZnCl2、Pb（NO3）2、NaF、NaBr、NaI、Na2CO3、NaNO3、NaNO2、Na3PO4、Na2S2O3、Na2SO3、Na2SO4（均購自北京化工股份有限公司）；Tris（購自廣州賽國生物科技有限公司）；羅丹明6G（購自E.Merck，Darmatadt公司）。實驗中，一切藥品和試劑均為分析純，實驗用水為去離子水。

紫外-可見分光光度計（TU-1901，北京）；原子力顯微鏡（Multimode 8，德國Brucker）；高分辨透射電子顯微鏡（JEM-2100，日本電子）；熒光分光光度計（F-280，天津港東）；傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet iS50，美國尼高力）；激光共聚焦顯微鏡（LSM880，德國Zeiss）。

1.2 實驗過程

1.2.1 碳點的制備

首先稱取0.5 g金銀花并研磨成粉末，然后將其與20 mL二次水混合搖勻，隨后將混合溶液密封在30 mL高壓反應釜中，在220℃下保持水熱反應5 h，待冷卻后，將懸浮液離心（4 000 r/min）20 min，取上清液用截留分子量為500 Da～1 000 Da的透析袋透析12 h，最終制得綠色熒光碳點溶液作為儲備液。

1.2.2 碳點的光譜性能測定

碳點的熒光性能主要通過熒光分光光度計進行測定，主要步驟是將100 μL的碳點儲備液分散于500 μL pH=7.3 的Tris-HCl緩沖液中，測定在不同激發(fā)波長下的發(fā)射光譜。

碳點的吸收光譜主要通過紫外-可見分光光度計進行測定，它可以對碳點的結(jié)構(gòu)和性能進行輔助分析，有助于探究其發(fā)光機理，主要步驟是用pH=7.3的Tris-HCl緩沖液作為參比，將碳點儲備液分散到緩沖液中，掃描測量其吸光度。

1.2.3 碳點的表征

碳點的形貌和粒徑主要通過透射電子顯微鏡（TEM）和原子力顯微鏡（AFM）進行表征，主要操作是先將碳點溶液進行一定的稀釋，然后滴加到銅片和云母片上，自然風干，最后在相應的顯微鏡下觀察。

碳點的結(jié)構(gòu)特征通過傅立葉變換紅外（FTIR）和拉曼光譜（Raman）進行表征，將碳點溶液冷凍干燥得到固體樣品后在相應的儀器下進行一系列操作即可。

1.2.4 碳點的熒光壽命的測定

熒光壽命是粒子返回基態(tài)之前在激發(fā)態(tài)停留的時間，以ns計量。熒光壽命（τ）由熒光衰減曲線進行估算，熒光衰減曲線通過對方程Y（t）=B1exp（-t/τ1）+B2exp（-t/τ2）進行擬合而成，由此可知碳點的熒光壽命。

1.2.5 熒光測定Fe3+

室溫下，取100 μL的碳點儲備液分散于500 μL pH=7.3的Tris-HCl緩沖液中，分別加入不同濃度的Fe3+標準溶液，反應30 s后記錄其熒光發(fā)射光譜。

1.2.6 體外活細胞成像實驗

以人類肝癌細胞（SMMC-7721）為模型，采用MTT毒性實驗，評估所制備的碳點的細胞毒性。將等量的濃度范圍為0.1 mg/mL～0.6 mg/mL的碳點溶液分別加入培養(yǎng)液中，并在37℃下恒溫培養(yǎng)1 h，測定細胞存活率?；诖耍?7℃下，將SMMC-7721細胞置于含有5%的CO2輔以10%胎牛血清的DMEM的培養(yǎng)基中孵育，然后將碳點溶液（500 μL，0.15 mg/mL）添加到1.0 mL培養(yǎng)基中，30 min后，用0.25%胰蛋白酶-0.020%EDTA對混合液中的細胞進行消化收集，并用pH=7.3 Tris-HCl緩沖液緩慢洗滌3次后，加入Fe3+（10 μL，0.1 mol/L）處理1 min，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并收集圖像。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 綠色熒光碳點的制備

如圖1所示，以金銀花為原料，通過一步水熱法成功合成了分布均勻的綠色熒光碳點。該方法避免了煩瑣復雜的程序，簡單快速，并且在一定溫度和壓力的密閉環(huán)境中，可以在形成碳點的同時在其表面引入一些有機官能團，從而實現(xiàn)制備和修飾的一體化。

圖1 金銀花通過水熱法合成碳點的示意圖Fig.1 Diagram for the synthesis of CDs from hydrothermal treatment of honeysuckle，along with photographs of the corresponding samples under daylight and 470 nm excitation

2.2 碳點的表征

2.2.1 粒徑和形貌表征

為了清楚地了解碳點的形貌及尺寸，采用TEM對其進行了表征。從圖2中可以看出該碳點呈準球形、分散良好、尺寸相對均一。通過對50個碳點的粒徑進行統(tǒng)計分析得出：該綠色熒光碳點的粒徑集中分布在2.0 nm～4.5 nm區(qū)間內(nèi)，平均粒徑為（3.10±0.47）nm。

圖2 （a-c）碳點在不同比例尺下的TEM圖；（d）碳點的粒徑分布Fig.2 （a-c）TEM images of CDs under different magnifications；（d）Size distribution of CDs

采用AFM進一步表征了該碳點的高度分布及形貌特征，表征結(jié)果如圖3所示。圖3a和3b充分地顯示出碳點良好的分散性。圖3d顯示該碳點的高度主要分布在3.0 nm～4.0 nm范圍內(nèi)，顆粒高度約為3.5 nm，與透射電鏡分析結(jié)果基本一致。

圖3 （a）碳點的AFM平面圖。（b）碳點的AFM三維圖。（c）平面圖中直線碳點的高度分布。（d）碳點的高度分布圖Fig.3 （a）AFM flat view of CDs.（b）AFM 3D image of CDs.（c）The height profile on straight line in flat view.（d）The height distribution of CDs

2.2.2 結(jié)構(gòu)表征

使用傅立葉變換紅外（FTIR）光譜對該碳點的表面官能團進行了深入的分析。圖4a是碳點的FTIR譜圖，其中3 210 cm-1處的吸收代表O-H的伸縮振動，位于2 916 cm-1的吸收是C-H的反對稱伸縮振動；1 760 cm-1和1 662 cm-1處的吸收都歸因于C=O的伸縮振動；1 569 cm-1處的吸收是N-H的面內(nèi)彎曲；1 400 cm-1處的吸收與-OH的面內(nèi)彎曲相吻合；1 047 cm-1處的特征吸收峰是由于=C-O-C的伸縮振動引起的；O-H的面外彎曲對應紅外譜圖中920 cm-1處的弱吸收。由以上一系列分析可得：合成的碳點表面存在羥基、羧基和氨基。

圖4b是碳點的拉曼光譜圖，其中位于1 383 cm-1處的D帶和位于1 528 cm-1處的G帶分別與碳原子的sp3和sp2雜化相關。根據(jù)譜圖可計算得出IG/ID≈1.54，說明碳點是一種類石墨結(jié)構(gòu)。

圖4 （a）碳點的紅外譜圖。（b）碳點的拉曼譜圖Fig.4 （a）FTIR spectrum of CDs.（b）Raman spectrum of CDs

2.2.3 碳點的光學性質(zhì)

圖5a是碳點的熒光光譜和紫外吸收光譜。紫外吸收光譜中處于268 nm處的弱吸收，可能來源于碳核中C=C的π-π*躍遷；圖5b顯示，隨著激發(fā)波長的增加，碳點的熒光強度呈現(xiàn)先增加后減弱的趨勢，熒光峰位置發(fā)生紅移，表現(xiàn)出激發(fā)依賴的特性。在激發(fā)波長為470 nm時，碳點的熒光強度最強。因此選擇470 nm為最佳激發(fā)波長，對應的最強發(fā)射峰位于523 nm。此外，選用羅丹明6G為參照物，計算其相對量子產(chǎn)率為1.5%。

2.2.4 pH、響應時間對碳點熒光強度的影響

通過測定在不同pH下碳點的熒光強度來進一步了解該碳點的穩(wěn)定性。從圖6a可以看出碳點的熒光強度隨pH的增加稍有降低。同時，我們還研究了激發(fā)時間和貯存時間對碳點熒光強度的影響。如圖6b所示，在470 nm下對碳點持續(xù)激發(fā)160 min，其熒光強度稍有降低。從圖6c可以看出，碳點在室溫下貯存600 min后，熒光強度仍然保持穩(wěn)定。這些實驗結(jié)果證明該碳點具有高穩(wěn)定性，有利于其在實際中的應用。

圖6 （a）pH對碳點熒光強度的影響；（b）激發(fā)時間對碳點熒光強度的影響；（c）貯存時間對碳點熒光強度的影響Fig.6 （a）Effect of pH on the PL intensity of CDs；（b）Effect of excitation time on the PL intensity of CDs；（c）Effect of storage time on the PL intensity of CDs

2.3 離子檢測

實驗探究了在pH=7.3的Tris-HCl緩沖液中，該碳點對外部各種陰離子和陽離子的刺激響應，結(jié)果如圖7a。在眾多的外部陰、陽離子中，只有Fe3+會明顯抑制該碳點的熒光。如圖7b所示，隨著Fe3+濃度從 0.05 μmol/L～400 μmol/L 逐漸增大，該碳點的熒光強度逐漸減弱，說明Fe3+對該碳點的熒光抑制作用越來越明顯。這可能歸因于碳點表面含有羧基和氨基，羧基上的O和氨基上的N擁有孤對電子。Fe3+包含空價軌道。因此，羧基上的O和氨基上的N與Fe3+發(fā)生配位作用，引起了能量或者電子轉(zhuǎn)移，導致了明顯的熒光猝滅。圖7c表明在0.05 μmol/L～400 μmol/L區(qū)間內(nèi)，F(xiàn)e3+和該碳點表現(xiàn)出兩段不錯的線性響應，分別是0.05 μmol/L～50 μmol/L 和 75 μmol/L～325 μmol/L，其線性關系分別為Y=-0.005 26X+0.939 97（R2=0.991 7）和Y=-0.001 3X+0.697 74（R2=0.993 2），檢測限為0.032 μmol/L。如表1所示，與以往報道過的Fe3+探針相比，該探針檢測的線性范圍更寬，檢測靈敏度更高。圖7d表明，加入Fe3+前后，該碳點的熒光壽命分別為9.719 2 ns和9.908 2 ns，二者比較接近，這表明Fe3+猝滅該碳點的過程是靜態(tài)猝滅，可能是由于Fe3+和碳點表面含氧基團相互作用，形成比較穩(wěn)定的非熒光絡合物而造成的。

表1 與以往報道的不同熒光探針對Fe3+檢測的比較Table 1 Comparison of previously reported different CDs based probes for Fe3+detection

圖7 （a）在pH=7.3，470 nm激發(fā)下不同金屬離子對碳點熒光強度的影響。（b）不同濃度Fe3+（0.05 μmol/L～400 μmol/L）對碳點熒光強度的影響。（c）F/F0和Fe3+濃度之間的關系。（d）加入Fe3+前后碳點的熒光壽命曲線。Fig.7 （a）Selectivity of CDs solution for Fe3+over other ionic species at pH=7.3 condition at 470 nm excitation.（b）Representative fluorescence emission spectra of CDs in the presence of Fe3+（0.05 μmol/L-400 μmol/L）.（c）The relationship between F/F0and Fe3+concentration（0.05 μmol/L-50 μmol/L and 75 μmol/L-325 μmol/L）.（d）The fluorescence decay of CDs and CDs/Fe3+

2.4 細胞成像及細胞中Fe3+傳感

為了確保碳點可以應用于生物體細胞或組織當中，選用SMMC-7721細胞，采用MTT實驗，評估了該碳點的細胞毒性。實驗結(jié)果如圖8，當碳點濃度達到0.6 mg/mL時，約有70%的細胞存活下來，這意味著該碳點毒性很低，為細胞在生物熒光成像應用中提供了良好的保障。

圖8 碳點對SMMC-7721細胞的毒性效應Fig.8 Cytotoxic effect of CDs obtained on SMMC-7721 cells

為了探究該碳點在活細胞內(nèi)的熒光標記用途，我們用該碳點對SMMC-7721細胞進行了孵育。如圖9所示，在激光共聚焦顯微鏡下，觀測到碳點能夠有效地進入到細胞質(zhì)中，對細胞進行標記。

圖9 碳點標記的SMMC-7721細胞的激光共聚焦圖像分別用（a）514 nm激光激發(fā)，（b）488 nm激光激發(fā)和（c）405 nm激光激發(fā).（d）明場Fig.9 LSCM images of SMMC-7721 cells treated with obtained CDs under（a）514 nm excitation，（b）488 nm excitation and（c）405 nm excitation.（d）bright field

此外，我們還設計了Fe3+的細胞內(nèi)傳感。由于人工培養(yǎng)的SMMC-7721細胞中不含游離的Fe3+，為了更好地檢測活細胞中Fe3+的波動，從而驗證其在生物領域中的實用性，因此需要在細胞中外加Fe3+。如圖10所示，在被該碳點染色的SMMC-7721細胞中加入Fe3+，發(fā)現(xiàn)在加入Fe3+50 s內(nèi)，活細胞中的熒光強度很快降低，這表明該碳點可以作為有效的熒光探針檢測活細胞中的Fe3+。

圖10 CDs/Fe3+體系加入SMMC-7721細胞中的激光共聚焦顯微鏡下的動態(tài)圖Fig.10 Dynamic LSCM fluorescence images of SMMC-7721 cells in existence of CDs/Fe3+

3 結(jié)論

以金銀花為碳源借助一步水熱法成功合成了綠色熒光發(fā)射的碳點。合成的碳點具有良好的熒光性質(zhì)。該碳點在水溶液體系中能夠?qū)e3+進行檢測，線性范圍為 0.05 μmol/L～50 μmol/L 和 75 μmol/L～325 μmol/L，檢出限為0.032 μmol/L?；谠撎键c的低毒性和高生物相容性，可以將其應用于體外活細胞的染色成像和活細胞中的Fe3+傳感。