大蒜素衍生物烯丙基半胱氨酸脂質(zhì)體處方工藝及其體內(nèi)藥動學(xué)研究

劉 旭

S-烯丙基-L-半胱氨酸(S-ally-lL-cysteine, SAC) 是大蒜中一種主要的水溶性硫化物, 化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定[1], 口服后可以迅速被吸收, 在大鼠中的生物利用度高達(dá) 98.2%, 適合開發(fā)為口服給藥制劑。初步藥理學(xué)研究表明，SAC具有顯著的心血管藥理活性，對缺血缺氧心肌具有保護(hù)作用，非常有希望開發(fā)為一個具有良好市場前景的心血管藥物。SAC 是一種水溶性的氨基酸, 不能直接透過細(xì)胞膜[1]。目前, 在心肌細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)有一種氨基酸轉(zhuǎn)運體(Alanine-Serine-cysteine-transporter1, ASCT-1), 是一含有 523 個氨基酸的小分子蛋白[2], ASCT-1 總量一定, 當(dāng)細(xì)胞外液中同時有可以通過 ASCT-1 的2種以上的分子,且超過 ASCT-1 的最大運載能力時, 各物質(zhì)便會相互競爭, 互為通過心肌細(xì)胞膜的拮抗劑[3]。由于SAC半衰期較短和較獨特的吸收方式，須多次給藥以維持體內(nèi)穩(wěn)定的血藥濃度，所以欲將其制成緩釋口服制劑。脂質(zhì)體為一種能夠延長藥效、口感良好的液體緩釋制劑，且具有靶向缺血心肌的作用[4，5]。SAC水溶性較好，單純骨架型材料在阻止藥物的釋放方面有一定困難，因此SAC制備脂質(zhì)體型液體緩釋制劑便突顯研究的必要。

在脂質(zhì)體工藝優(yōu)化和處方篩選過程中，常須同時考察多個因素對結(jié)果的影響，并對結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化。本實驗采用集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計學(xué)方法于一體的效應(yīng)面優(yōu)化法(Response surface methodology，RSM)進(jìn)行優(yōu)化[6]，實驗設(shè)計采用星點設(shè)計(Central composite design，CCD)[7],具有一次設(shè)計即可獲得較佳條件，試驗次數(shù)較少，適宜進(jìn)行非線性擬合的顯著優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 實驗材料烯丙基半胱氨酸；大豆磷脂(LIPOID S-100,上海利寶德生物科技有限公司代購)；膽固醇(天津市博迪化工有限公司)；無水乙醇(分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司)；葡聚糖Sephadex G-50(北京拜爾生物科技有限公司)；乙腈、甲醇(色譜純，天津康科德公司)；重蒸餾水，試驗室自制；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器高效液相色譜儀(LC-10UV 檢測器，Pump LC-05P液相泵，大連江申分離科學(xué)技術(shù)公司)；JS-3050色譜工作站(大連江申分離科學(xué)技術(shù)公司)；高效液相色譜儀(Prominence RF20A 超高靈敏度熒光檢測器，Prominence LC-20A液相泵，中國島津公司)；高效液相島津色譜工作站(中國島津公司)；pH計(上海宇隆儀器有限公司)；SZ-93全自動純水蒸餾器(上海精科實業(yè)有限公司)； SCQ2201超聲波清洗器(上海聲彥超聲波儀器有限公司)；DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠)；JY92-2D型超聲波細(xì)胞粉碎機(寧波新芝儀器研究所)；LS230激光粒度儀(Beckman Coulter公司)；Delsa440SX Zeta Potential Analyzer(Beckman Coulter公司)；分析天平(TG328A，上海精密科學(xué)儀器有限公司)；微量移液器(500 μl，上海求精生化試劑儀器有限公司)；微量進(jìn)樣器(25 μl，上海安亭微量器廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 SAC脂質(zhì)體的制備主動載藥法制備SAC脂質(zhì)體：稱取磷脂0.3 g，膽固醇0.1 g，溶于2 ml無水乙醇中，55 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，以10 ml檸檬酸緩沖液(pH 3.64)水化，稱適量SAC溶于2 ml蒸餾水中，加入上述溶液，繼續(xù)加入3 ml NaHCO3(pH 8.32)緩沖液調(diào)外水相pH值，60 ℃下磁力攪拌(30 r/min)20 min，進(jìn)行主動載藥。

1.3.2 SAC脂質(zhì)體的含量和包封率測定

1.3.2.1 色譜條件RP C18色譜柱(BDS C18 150 mm×4 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(10∶90)；體積流量：1.0 ml/min；檢測波長：220 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。

1.3.2.2 樣品測定取SAC脂質(zhì)體，加入質(zhì)量濃度為10%曲拉通X-100(TritonX-100)溶解脂質(zhì)體膜，加流動相稀釋至刻度，進(jìn)行總藥量的測定。微柱離心法測定包封率：將葡聚糖凝膠G50置于5 ml注射器中，底部放醫(yī)用脫脂棉，脂質(zhì)體0.5 ml滴于凝膠柱頂端，2000 r/min離心3 min，再加蒸餾水0.5 ml，重復(fù)2次，收集洗脫液，以10%曲拉通數(shù)滴破乳，蒸餾水定容至10 ml，取上清液20 μl注入高效液相檢測，測定包封藥物的量,計算包封率與載藥量。

1.3.3 處方篩選的單因素試驗考察

1.3.3.1 孵化時間對包封率的影響固定SAC濃度為15 mg/ml,藥脂比為1∶10，膽脂比為1∶3，pH梯度為3，孵化溫度為50 ℃，考察孵化時間10 min、20 min、30 min對包封率的影響，結(jié)果分別為55.6%、60.4%、58.6%。由此可知, 包封率隨著孵化時間的延長而增大, 當(dāng)孵化時間為20 min 時, 包封率趨于平臺。為了能讓下面的各因素對包封率影響的差別顯示出來, 選擇孵化時間 10 min 進(jìn)行實驗。

1.3.3.2 孵化溫度對包封率的影響固定SAC濃度為15 mg/ml，藥脂比1∶10，膽脂比為1∶3，pH梯度為3，孵化時間為10 min，考察孵化溫度40 ℃、50 ℃、60 ℃對包封率的影響，結(jié)果分別為43.2%、57.6%、82.65%。由此可知, 包封率隨著孵化溫度升高而增大, 當(dāng)孵化溫度為 60～70 ℃時, 達(dá)到最大, 80 ℃ 時, 包封率則下降。溫度過高易使磷脂膜破壞，所以選擇孵化溫度60 ℃。

1.3.3.3 藥物濃度對包封率的影響固定膽脂比1∶3，pH梯度為3，藥脂比1∶10，孵化時間為10 min,孵化溫度50 ℃，加入不同質(zhì)量濃度的SAC溶液，使藥脂比為1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40。結(jié)果包封率為24.1%、70.4%、77.8%、81.2%、85.6%。結(jié)果表明藥物濃度對包封率的影響較大，藥脂比減小則包封率增加，但隨著藥脂比減小，包封率并未繼續(xù)提高，而是達(dá)到一個平臺值，為了有較高的載藥量，所以選擇藥脂比為1∶20，此時加入藥物質(zhì)量濃度為7.5 mg/ml。

1.3.3.4 pH梯度對包封率的影響固定膽脂比1∶3，藥脂比1∶10，孵化時間為10 min, 孵化溫度50 ℃，SAC濃度為15 mg/ml，pH梯度為2、3、4，結(jié)果得到包封率為71.0%、62.4%、58.3%。由此可知, 外水相 pH 值對包封率的影響較復(fù)雜, pH 值較低和較高時, 包封率均較低, 最適 pH 梯度值為 2，此時外水相pH值為5.5，與SAC的等電點相近。

1.3.3.5 膽脂比對包封率的影響固定孵化時間為10 min，孵化溫度為60 ℃，藥脂比為1∶20，pH梯度為3，考察膽脂比為1∶20、1∶10、1∶5、1∶3、1∶2。結(jié)果包封率分別為45.3%、51.7%、60.6%、69.3%、68.9%。結(jié)果表明，較高膽脂比有利于提高包封率，但當(dāng)膽脂比過高，達(dá)到1∶2時，容易出現(xiàn)沉淀，所以選擇膽脂比為1∶3。

1.3.4 處方篩選優(yōu)化實驗

1.3.4.1 實驗設(shè)計根據(jù)優(yōu)化的處方，在單因素考察的基礎(chǔ)上，選取對SAC脂質(zhì)體制備工藝影響較顯著的藥脂比(X1)、膽脂比(X2)、藥物濃度(X3)3個因素進(jìn)行中心優(yōu)化設(shè)計?？紤]到包封率與載藥量在脂質(zhì)體處方設(shè)計評價中占有同等重要的地位，分別將兩者測量值最大的一組定為0.5，其余按比例縮放，得到相對得分Y1,Y2，以體現(xiàn)2者平衡的權(quán)重，引入綜合得分(Y3)，Y3=Y1+Y2為另一評價指標(biāo)。選擇各因素的水平，以Y1,Y2,Y3為評價指標(biāo)，分別對各因素用Design Expert軟件進(jìn)行判斷。根據(jù)二項式方程，應(yīng)用統(tǒng)計軟件分別繪制各個指標(biāo)與影響較顯著的3個因素的三位效應(yīng)面圖。

1.3.4.2 模型擬合用Design Expert軟件，以Y1，Y2個評價指標(biāo)分別對各因素(自變量)進(jìn)行多元線性回歸和二項式方程擬合。見表1。

表1 星點設(shè)計與結(jié)果

多元線性回歸方程： Y1=54.7-8.47X1+18.18X2-14.1X3(R2=0.8318)；Y2=8.24+5.71X1-1.5X2(R2=0.8921)。

從擬合方程的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2值可見，3個指標(biāo)采用二項式方程擬合效果較好。X1對Y1、Y2影響較為顯著。根據(jù)方程描繪因變量和自變量的三維效應(yīng)面和二維等高圖，選取較佳的制備工藝條件。

1.3.4.3 效應(yīng)面優(yōu)化和預(yù)測根據(jù)二項式方程，應(yīng)用Design Expert軟件分別繪制自變量的三維效應(yīng)面圖，從中篩選出較佳的工藝水平，部分結(jié)果各因素的最佳范圍見表2。優(yōu)化工藝驗證，自變量無論取值多少，都不能同時滿足Y1、Y2同時達(dá)到最優(yōu)值，為獲得最大包封率，所以將載藥量Y2以5%為預(yù)期目標(biāo)，得到以下幾種設(shè)計方案，其中第1項為最優(yōu)處方。見圖1。

表2 各因素預(yù)測最佳值

圖1 包封率(Y1)對SAC/磷脂(A)、膽固醇/磷脂(B)、藥物濃度(C)的預(yù)測效應(yīng)面(載藥量Y2確定為5%)

根據(jù)效應(yīng)面優(yōu)選的3個因素較佳處方范圍：X1：0.07～0.1；X2：0.32～0.35；X3：5～6 mg/ml。依據(jù)較佳處方：X1：0.07，X2：0.35，X3：5 mg/ml制備的SAC脂質(zhì)體，預(yù)測與實測值偏差較小。

2 烯丙基半胱氨酸脂質(zhì)體大鼠體內(nèi)藥物動力學(xué)的研究

2.1 實驗動物SD大鼠雌雄各半，體質(zhì)量范圍200～210 g，實驗前1 d，大鼠禁食12 h，隨機分成2組，分別給予SAC水溶液和SAC脂質(zhì)體，實驗期間自由飲水禁食。

2.2 體內(nèi)分析色譜條件高效液相檢測系統(tǒng)為Fluorescent HPLC 系統(tǒng)(Shimadzu Company，JAPAN)色譜柱為BDS C18色譜柱，柱溫為35 ℃。流動相：甲醇∶乙腈∶pH 7.2的醋酸鹽緩沖液(含20 mmol/L的醋酸鈉和0.6%的四氫呋喃)(90∶110∶300)。檢測波長：激發(fā)波長338 nm，發(fā)射波長為450 nm。

2.3 血漿樣品的處理

2.3.1 血漿樣品的處理取50 μl血漿，蒸餾水和內(nèi)標(biāo)(25.06 μg/ml青霉胺溶液，溶劑為水)各50 μl，200 μl乙腈沉淀蛋白，渦旋混合3 min，13 000 r/min離心10 min，取上清液待衍生化處理。

2.3.2 血漿樣品的柱前衍生化取已處理好的血漿樣品20 μl，加入40 μl的OPA衍生化試劑，避光反應(yīng)2 min，取20 μl后進(jìn)樣，記錄色譜圖。

2.3.3 衍生化試劑的配制稱取0.5 g的鄰苯二甲醛，溶于5 ml的甲醇中，加入500 μl的β-巰基乙醇，加入45 ml的硼酸鹽緩沖液(pH 10.4)，4 ℃保存，每周重配一次。

2.4 SAC脂質(zhì)體與SAC水溶液藥時曲線比較SAC脂質(zhì)體能延長藥物在體內(nèi)的滯留時間，AUC是溶液組的1.2倍，表明脂質(zhì)體改變了SAC在體內(nèi)的分布與消除過程，有一定的緩釋效果。

圖2 SAC脂質(zhì)體與SAC水溶液平均血藥濃度圖

2.5 SAC脂質(zhì)體體內(nèi)藥物動力學(xué)參數(shù)采用3P97實驗藥代動力學(xué)計算機程序，對SAC脂質(zhì)體緩釋混懸劑和普通水溶液的血藥濃度-時間曲線分別進(jìn)行單隔室和雙隔室模型擬合，根據(jù)AIC和r2擬合值與實測值相關(guān)系數(shù)[8]進(jìn)行綜合比較。結(jié)果顯示，SAC緩釋脂質(zhì)體、藥物水溶液體內(nèi)藥物動力學(xué)行為較符合雙隔室一級吸收模型。將烯丙基半胱氨酸制成脂質(zhì)體后，藥物的Cmax與Tmax由原來的0.59 μg/ml和1.02 h分別達(dá)到0.66 μg/ml和7.01 h，分別對SAC脂質(zhì)體緩釋制劑、藥物水溶液血藥濃度曲線下面積AUC0-∞，Cmax進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換，利用SAS軟件先對lnAUC0-∞，InCmax，Tmax進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果表明，AUC0-∞差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，相對生物利用度110.7%，Tmax,Cmax差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明SAC脂質(zhì)體緩釋制劑具有顯著的緩釋效果，且生物利用度與SAC水溶液相比等效。

3 討論

由于傳統(tǒng)被動載藥只能得到40%左右的包封率，所以采用pH梯度主動載藥法制備SAC脂質(zhì)體，以期提高包封率。較低的藥脂比可以達(dá)到較高的包封率，但此時載藥量卻難以達(dá)到臨床前試驗研究的要求，在獲得較高包封率的同時應(yīng)兼顧載藥量。本文在使用Design Expert軟件設(shè)計優(yōu)化處方時，設(shè)定5%為目標(biāo)載藥量，同時以包封率達(dá)到最大值為優(yōu)化方案，得到包封率為近80%的較優(yōu)處方。此時藥脂比范圍為1∶10～1∶14，膽脂比范圍為1∶2.85～1∶3.13?？紤]到水化后含藥量問題，設(shè)定藥物濃度范圍為5.00～6.00 mg/ml。

在采用主動載藥法制備氨基酸類藥物脂質(zhì)體時，應(yīng)嚴(yán)格控制外水相pH值，以獲得理想的包封率。由于分子型藥物易與脂質(zhì)體雙分子膜結(jié)合，加之60 ℃溫育時，脂質(zhì)體處于液晶態(tài)，雙分子膜的通透性增加，從而加快了藥物分子的跨膜內(nèi)轉(zhuǎn)過程。藥脂比提高可以有效包裹水溶性藥物，提高包封率，但粒徑也隨之增大。實驗中脂質(zhì)體采用3%的右旋糖酐作為凍干保護(hù)劑得到凍干產(chǎn)品，凍干前后包封率變化不明顯，凍干制劑以pH為5.3的PBS進(jìn)行水化，可以提高包封率，可能是由于氨基酸于此處呈電中性，易于與脂質(zhì)體的雙分子膜結(jié)合。

通過SAC脂質(zhì)體的體內(nèi)藥物動力學(xué)考察結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體作為小分子水溶性藥物的載體，以口服方式給藥，在大鼠體內(nèi)具有顯著的緩釋效果，可在一段時間內(nèi)維持一定的血藥濃度，且與SAC水溶液口服給藥生物等效，所以SAC脂質(zhì)體是較理想的口服緩釋液體制劑。SAC是治療急性心肌梗死的極具開發(fā)前景的創(chuàng)新藥物，脂質(zhì)體對于心肌缺血組織的靶向性更突出了其作為治療心肌缺血藥物SAC載體的優(yōu)勢。