四川省食品動(dòng)物源大腸桿菌mcr-1與ESBLs基因共轉(zhuǎn)移分析

仇劍宇 舒 剛 楊承霖 甘 婷 林居純

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611130)

多黏菌素類是醫(yī)學(xué)臨床上治療多重耐藥陰性菌感染的關(guān)鍵抗生素，被認(rèn)為是臨床用藥最后一道防線[1]。上世紀(jì)80年代初，多黏菌素在我國(guó)被批準(zhǔn)用于養(yǎng)殖業(yè)，作為藥物飼料添加劑以防治動(dòng)物腸道感染和促進(jìn)生長(zhǎng)[2]。在較長(zhǎng)一段時(shí)間，臨床檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌對(duì)多黏菌素的耐藥性維持在較低水平，且耐藥性由染色體介導(dǎo)，只能垂直傳播[3]。近年來，耐藥性監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)食品動(dòng)物源細(xì)菌對(duì)多黏菌素耐藥率明顯上升。2015年Liu等[4]首次從豬源大腸桿菌攜帶的質(zhì)粒中檢出mcr-1基因，且發(fā)現(xiàn)該基因編碼的MCR-1蛋白能導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜上脂質(zhì)A被磷酸乙醇胺共價(jià)修飾，使細(xì)菌細(xì)胞外膜與多黏菌素親和力下降，導(dǎo)致對(duì)多黏菌素類耐藥。此后，在全球各地，包括患者、環(huán)境、食品、家養(yǎng)和野生動(dòng)物源分離菌中均檢出mcr-1[5]?；仡櫺员O(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，早在上世紀(jì)80年代，我國(guó)雞源大腸桿菌中就存在mcr-1。隨時(shí)間推移，該基因檢出率呈爆發(fā)式上升，尤其在食品動(dòng)物源菌株中檢出率非常高[3,5]，如2018年我國(guó)豬源大腸桿菌中mcr-1檢出率高達(dá)76.2%[6]。通過動(dòng)物源和人源mcr-1陽性菌株分子特性比較發(fā)現(xiàn)，通過食物鏈、水等自然環(huán)境或與動(dòng)物直接接觸，該基因存在從動(dòng)物擴(kuò)散到人的可能，這給公共安全造成了威脅[5]。

研究表明，攜帶mcr-1的質(zhì)粒類型具有多樣性，最常見有IncI2，IncHI2和IncX4型質(zhì)粒。這些質(zhì)?？梢栽谀c桿菌科細(xì)菌間發(fā)生接合轉(zhuǎn)移，其中IncI2和IncHI2可同時(shí)攜帶ESBLs、PMQR和其他耐藥基因，導(dǎo)致多耐藥基因共轉(zhuǎn)移[7-8]。多耐藥基因共轉(zhuǎn)移會(huì)造成在使用其他抗生素時(shí)，也會(huì)對(duì)mcr-1產(chǎn)生選擇作用，使得mcr-1的擴(kuò)散和耐藥問題更加嚴(yán)重。四川省是中國(guó)畜牧業(yè)大省，養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴(kuò)大，多重耐藥菌株的出現(xiàn)嚴(yán)重威脅著畜牧生產(chǎn)的健康發(fā)展。大腸桿菌作為食品動(dòng)物體內(nèi)最常見的致病菌和共棲菌，是耐藥性傳播的重要細(xì)菌，也是目前報(bào)道最易攜帶mcr-1的菌種，約占mcr-1陽性菌株91%[5]，可將多耐藥基因傳遞給其他致病菌，甚至通過環(huán)境、食品等再傳播給其他動(dòng)物和人類。因此，調(diào)查大腸桿菌中耐藥基因的流行情況，對(duì)四川省的耐藥性檢測(cè)是非常重要的。本次研究以四川省各地收集的不同動(dòng)物源大腸桿菌為對(duì)象，檢測(cè)mcr-1以及超廣譜β-內(nèi)酰胺酶ESBLs基因流行情況，通過質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)揭示耐藥基因發(fā)生共轉(zhuǎn)移的耐藥機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 菌株

190株大腸桿菌于2017—2018年從四川省不同養(yǎng)殖場(chǎng)患病豬、雞、兔體內(nèi)分離鑒定獲得，其中156株雞源大腸桿菌，25株豬源大腸桿菌，9株兔源大腸桿菌；質(zhì)控菌ATCC25922和耐疊氮鈉大腸桿菌J53 AZr由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)系獸醫(yī)藥理學(xué)教研室惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑

氨曲南等購(gòu)自四川制藥制劑有限公司；小量質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；2×Taq PCR MasterMix等購(gòu)自成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司。

1.3 藥物敏感性試驗(yàn)

采用微量肉湯稀釋法檢測(cè)190株大腸桿菌對(duì)氨芐西林(AMP)、頭孢噻肟(CTX)、氨曲南(ATM)、慶大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、環(huán)丙沙星(CIP)和多黏菌素E(COL)最小抑菌濃度(MIC)，以大腸桿菌ATCC25922株作為質(zhì)控菌株。藥敏折點(diǎn)參考CLSI-M100-S29[9]和EUCAST9.0標(biāo)準(zhǔn)判讀[10]。

1.4 菌株mcr-1及ESBLs基因檢測(cè)

采用E.Z.N.A.?Plasmid DNA Mini Kit I提取190株大腸桿菌的質(zhì)粒DNA。mcr-1陽性菌株的ESBLs基因(blaTEM、blaCTX-M-1 group、blaCTX-M-2 group、blaCTX-M-9 group、blaCTX-M-8/25 group、blaSHV和blaOXA)采用PCR檢測(cè)，靶基因、引物序列等見表1。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至成都擎科梓熙生物測(cè)序，將獲得的耐藥基因序列和GenBank核酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。

1.5 質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)

將mcr-1陽性大腸桿菌(供體菌)與大腸桿菌J53 AZr(受體菌)進(jìn)行肉湯接合試驗(yàn)。接合子用含藥(2 μg/mL多黏菌素E和200 μg/mL疊氮鈉)胰蛋白胨大豆瓊脂平板進(jìn)行篩選[14]。采用微量肉湯稀釋法檢測(cè)接合子藥物敏感性，提取接合子質(zhì)粒DNA擴(kuò)增相關(guān)耐藥基因。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

使用SAS9.0軟件FREQ程序進(jìn)行耐藥率組間差異性分析，P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株mcr-1基因檢測(cè)及耐藥分析

190株大腸桿菌的mcr-1檢出率為36.84%(70/190)(圖1)，其中，雞源和豬源菌株mcr-1檢出率分別為41.67%(65/156)和20.00%(5/25)，尚未在兔源菌中檢出該基因。

表1 mcr-1及ESBLs基因擴(kuò)增引物信息Table 1 Information of specific primers for mcr-1 and ESBLs genes

M，DNA標(biāo)記DL 2 000；1～2，mcr-1陰性菌株； 3～6，mcr-1陽性菌株 M， DNA Marker DL 2 000； 1-2, mcr-1 negative strain； 3-6, mcr-1 positive strain 圖1 部分雞源大腸桿菌mcr-1基因PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplifications of mcr-1 of E.coli in chickens

藥敏試驗(yàn)顯示，190株菌除對(duì)慶大霉素(GEN)耐藥率為27.37%，對(duì)其余藥物的耐藥率均超過30%，其中對(duì)氨芐西林(AMP)高達(dá)95.79%，其次是氨曲南(ATM)65.26%、多黏菌素E(COL)47.89%、頭孢噻肟(CTX)35.26%、阿米卡星(AMK)32.63%和環(huán)丙沙星(CIP)32.11%。比較mcr-1陽性和陰性菌株的耐藥性可見，mcr-1陽性菌株對(duì)氨曲南(ATM)、頭孢噻肟(CTX)和多黏菌素E(COL)耐藥率極顯著高于mcr-1陰性菌(P<0.01)，對(duì)其他藥物的耐藥率差異均不顯著(P>0.05)(圖2)，其中mcr-1陽性大腸桿菌對(duì)多黏菌素E(COL)耐藥率高達(dá)92.9%。

2.2 mcr-1陽性菌的ESBLs基因檢測(cè)

70株mcr-1陽性菌攜帶質(zhì)粒大小約為2 kb>15 kb，75.71%菌株檢出了ESBLs基因。測(cè)序結(jié)果顯示，blaTEM-1、blaCTX-M-55和blaCTX-M-14的檢出率分別為71.43%、22.86%和17.14%，未檢出其他ESBLs基因(圖3)。

2.3 mcr-1陽性菌株的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移分析

mcr-1陽性菌株質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移率為47.14%(33/70)。33株mcr-1陽性接合子及其供體菌的MICs、耐藥率比較可見，接合子及其供體菌對(duì)多黏菌素E的MIC在2～8 μg/mL，說明菌株對(duì)多黏菌素E(COL)呈低水平耐藥。接合子對(duì)頭孢噻肟(CTX)、氨曲南(ATM)、慶大霉素(GEN)、阿米卡星(AKM)、環(huán)丙沙星(CIP)和多黏菌素E(COL)的MIC50值低于供體菌，但兩者的MIC90值和耐藥率無顯著性差異(表2)。

**表示差異極顯著(P<0.01)，ns表示差異不顯著(P>0.05)。 ** indicates extremely significant difference (P<0.01). ns indicates no significant difference (P>0.05). AMP：氨芐西林；CTX：頭孢噻肟；ATM：氨曲南；GEN：慶大霉素；AMK：阿米卡星；CIP：環(huán)丙沙星；COL：多黏菌素E AMP： ampicillin； CTX： cefotaxime； ATM： aztreonam； GEN： gentamicin； AMK： amikacin； CIP： Ciprofloxacin； COL：Colistin 圖2 mcr-1陽性和陰性菌株耐藥率比較Fig.2 Comparison of resistant rates between mcr-1 positive and negative strains

M，DNA標(biāo)記DL2 000；(a)-1、(b)-1、(c)-1、(d)-4為陽性菌株；其余為陰性菌株。 M， DNA Marker DL2 000； (a) -1， (b) -1, (c) -1 and (d) -4 were positive strains； The rest were negative strains.圖3 β-內(nèi)酰胺類基因(ESBLs)PCR 擴(kuò)增Fig.3 PCR amplifications of β-lactamase genes (ESBLs)

對(duì)33株接合子基因檢測(cè)顯示，19株接合子只檢出mcr-1基因，14株同時(shí)檢出mcr-1和ESBLs基因，其中同時(shí)檢出blaTEM-1(13株)、blaCTX-M-55(9株)和blaCTX-M-14(2株)；與供體菌相比，盡管14株共轉(zhuǎn)移接合子對(duì)慶大霉素(GEN)、阿米卡星(AKM)、環(huán)丙沙星(CIP)等藥物的MIC值僅為供體菌的1/2或1/32，但卻是受體菌J53 AZr的幾十甚至幾百倍，而且保留了對(duì)多黏菌素、β-內(nèi)酰胺類藥物較高的耐藥率(表3)；分析接合子質(zhì)?？梢?，大小分別約為5、8和>15 kb質(zhì)粒，其中～5 kb質(zhì)粒僅攜帶mcr-1，～8和～>15 kb質(zhì)粒同時(shí)攜帶mcr-1和ESBLs基因(表3)。

3 討論與結(jié)論

隨著抗生素的長(zhǎng)期使用或?yàn)E用，耐藥性問題已成為全球公共安全最嚴(yán)重的威脅之一?！癘ne health”理念中，動(dòng)物在“人類—?jiǎng)游铩h(huán)境”整體健康中占重要地位。目前對(duì)食品動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)，更注重那些在醫(yī)學(xué)臨床使用的關(guān)鍵藥物，如第三代頭孢、氟喹諾酮類和多黏菌素等[15]。本研究耐藥性檢測(cè)結(jié)果顯示，四川省食品動(dòng)物源大腸桿菌除對(duì)氨芐西林、慶大霉素、環(huán)丙沙星等獸醫(yī)臨床常用藥物耐藥外，對(duì)頭孢噻肟、氨曲南、阿米卡星等獸醫(yī)臨床未批準(zhǔn)使用的藥物也呈嚴(yán)重耐藥性(耐藥率范圍32.63%～65.26%)。這說明耐藥性的產(chǎn)生不僅與抗菌藥物使用強(qiáng)度有關(guān)，可能還與不同抗菌藥物間存在交叉或共耐藥相關(guān)[16]。

表2 33株接合子(TCs)及其供體菌的MIC50，MIC90及耐藥率Table 2 MIC50, MIC90 and resistant rate of 33 transconjugants and their donors

表3 14株供體菌和接合子(TCS)的MICs、攜帶質(zhì)粒大小及ESBLs基因Table 3 The MICs, plasmid size and ESBLs gene of 14 donors and their transconjugants (TCs)

表3(續(xù))

本研究中190株食品動(dòng)物源大腸桿菌中mcr-1檢出率達(dá)36.84%，其中雞源和豬源菌株中mcr-1檢出率分別為41.67%和20.00%，高于華東地區(qū)雞源菌株檢出率36.66%[17]，與廣東等5省2011—2014年豬源菌株檢出率21%接近[4]，低于我國(guó)其他省份豬、雞源菌株該基因的檢出率(43.86%～76.20%)[6,18]，說明在我國(guó)食品動(dòng)物源大腸桿菌中mcr-1廣泛存在，但該基因流行存在地區(qū)差異。

研究表明，mcr-1可以與其他耐藥基因共存在[19]。本研究從70株mcr-1陽性菌中檢出75.71%菌株攜帶ESBLs基因，這與其他報(bào)道認(rèn)為mcr-1常與ESBLs共存在和共轉(zhuǎn)移一致[19-21]。這也詮釋了mcr-1陽性菌株比陰性菌株對(duì)第三代頭孢類具有更強(qiáng)的耐藥性的原因。目前，在我國(guó)食品動(dòng)物源大腸桿菌中blaCTX-M是ESBLs最主要的基因型，其中以blaCTX-M-55和blaCTX-M-14為主[17,22]。本研究在mcr-1陽性菌株中blaCTX-M-55和blaCTX-M-14的檢出率分別達(dá)22.86%和17.14%，與本研究發(fā)現(xiàn)的2010—2016年菌株blaCTX-M基因流行以blaCTX-M-55和blaCTX-M-14為優(yōu)勢(shì)基因型相符，所編碼的CTX-M酶介導(dǎo)對(duì)青霉素類和第3代頭孢菌素耐藥[23]。此外，mcr-1陽性大腸桿菌中blaTEM-1檢出率高達(dá)71.43%，說明blaTEM-1在四川省食品動(dòng)物源大腸桿菌中已經(jīng)獲得了穩(wěn)固存在和傳播的能力。盡管blaTEM-1介導(dǎo)窄譜β-內(nèi)酰胺酶，但由于該基因容易發(fā)生突變導(dǎo)致新的TEM酶出現(xiàn)，擴(kuò)大水解底物譜，導(dǎo)致多重耐藥菌株流行[24]。

R質(zhì)粒作為介導(dǎo)耐藥基因轉(zhuǎn)移的可移動(dòng)元件，在耐藥性水平傳播中發(fā)揮重要作用。本研究中70株mcr-1陽性菌經(jīng)質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移獲33株接合子(轉(zhuǎn)移率47.14%)，其中14株發(fā)生了mcr-1與ESBLs基因共轉(zhuǎn)移，且參與菌株耐藥性的表達(dá)，使受體菌對(duì)多黏菌素和β-內(nèi)酰胺類藥物產(chǎn)生耐藥性。關(guān)于37株mcr-1陽性菌株未結(jié)合轉(zhuǎn)移成功，可能是菌株攜帶的質(zhì)粒屬于非結(jié)合型質(zhì)粒，需要通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)方式在不同菌株間傳播。

綜上所述，本研究表明在四川省食品動(dòng)物源大腸桿菌耐藥性較嚴(yán)重，且對(duì)醫(yī)學(xué)臨床使用的關(guān)鍵藥物也呈耐藥性。耐藥菌株中mcr-1流行率較高，與ESBLs基因共存在較普遍，耐藥基因借助質(zhì)粒易發(fā)生水平傳播，導(dǎo)致多重耐藥菌株的產(chǎn)生和流行。這給動(dòng)物、人類或環(huán)境造成巨大威脅，動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)應(yīng)加強(qiáng)mcr基因與其他耐藥基因的監(jiān)測(cè)，針對(duì)耐藥性問題采取嚴(yán)格防控措施，謹(jǐn)慎和合理有效地使用抗生素，緩解耐藥性的產(chǎn)生和傳播，保障動(dòng)物養(yǎng)殖健康發(fā)展和畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全。