健脾益氣口服液提取工藝的優(yōu)化

劉巧明，崔曉娟，黃曉燕，謝 勝，楊正騰，林憶龍，奉建芳,3*，王 劍*

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；3.廣西優(yōu)勢(shì)中成藥與民族藥開發(fā)工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530200)

健脾益氣方由陳皮、黃芪、制何首烏等8味藥材組成，具有健脾益氣的功效[1]，臨床上用于治療小兒功能性消化不良，療效良好，為進(jìn)一步滿足臨床需求，課題組前期按中藥1.1類新藥要求將其開發(fā)成健脾益氣口服液。中藥復(fù)方的提取工藝在新藥開發(fā)過程中至關(guān)重要，需要確定最佳的提取參數(shù)，保證有效成分盡可能提取出來，目前常用于篩選/優(yōu)化中藥復(fù)方提取工藝的方法有正交設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)、因子設(shè)計(jì)、混料設(shè)計(jì)、星點(diǎn)設(shè)計(jì)、響應(yīng)面法、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等[2-6]。其中，響應(yīng)面法已廣泛應(yīng)用于化工領(lǐng)域工藝參數(shù)、醫(yī)藥領(lǐng)域的生物活性成分提取的優(yōu)化過程，通過計(jì)算自變量的相對(duì)重要性，預(yù)測自變量最優(yōu)值[7]，但當(dāng)變量之間存在非線性關(guān)系時(shí)，會(huì)導(dǎo)致其預(yù)測結(jié)果的精確度下降；人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在中藥材質(zhì)量控制、中藥活性成分及其藥物動(dòng)力學(xué)、中藥生產(chǎn)過程等方面均開展了大量研究[8]，在復(fù)雜非線性多變量的優(yōu)化方面的準(zhǔn)確性較高[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法，分別建立響應(yīng)面法、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測提取參數(shù)最優(yōu)值，并通過中試放大試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，以期為健脾益氣口服液開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并評(píng)價(jià)上述2種方法的應(yīng)用潛力。

1 材料

1.1 儀器 SQP電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；KQ3200B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TGL-16G離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；GZX-9420MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；LC-20A高效液相色譜儀(配置SPD-M20A紫外檢測器，日本島津公司)。

1.2 試劑與藥物 黨參、陳皮、黃芪、白術(shù)、制何首烏、麥冬、浮小麥、雞內(nèi)金飲片均購自南寧市賓陽縣萬潤堂本草有限公司中藥飲片廠，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定為正品，符合2015年版《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號(hào)111920-201806，純度97.6%)、2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(批號(hào)110844-201814，純度91.0%)、橙皮苷(批號(hào)110721-201818，純度96.2%)對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇為色譜純(美國Fisher公司)；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 成分含量測定 參考文獻(xiàn)[10]報(bào)道。

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性考察 Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.2%甲酸(B)，梯度洗脫(0～12 min，17%～37%A；12～35 min，63%A；35～40 min，63～83%A；40～55 min，83%A)；體積流量1 μg/mL；柱溫30 ℃；檢測波長283 nm；進(jìn)樣量10 μL。在該色譜條件下，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷理論塔板數(shù)均大于3 000。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品適量，置于量瓶中，加甲醇制成每1 mL分別含三者0.012 8、0.194、0.384 μg/mL的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 稱取處方量藥材，按不同因素水平進(jìn)行試驗(yàn)，回流提取，濾過，濾液備用，按因素最低水平同法制備不含黃芪、陳皮、制何首烏的陰性樣品。取上述藥液，13 000 r/min離心10 min，即得。

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4.1 專屬性試驗(yàn) 精密吸取供試品、對(duì)照品溶液適量，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，供試品溶液中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷色譜峰對(duì)照品溶液相應(yīng)位置處無干擾，表明該方法專屬性良好。

注：A～E分別為對(duì)照品、供試品、缺黃芪陰性樣品、缺陳皮陰性樣品、缺制何首烏陰性樣品。1.毛蕊異黃酮葡萄糖苷 2.2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷 3.橙皮苷1.calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside 2.2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside 3.hesperidin圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.4.2 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液0.50、1.25、2.50、3.75、5.00 mL至10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL測定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得方程分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷Y=2.32×107X-1 957.07(R2=0.999 7)，線性范圍0.64～6.40 μg/mL；橙皮苷Y=8.57×106X-1 736.34(R2=0.999 9)，線性范圍9.70～76.80 μg/mL；2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷Y=4.53×107X-4 209.29(R2=0.999 9)，線性范圍19.20～192.00 μg/mL。

2.1.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰面積RSD分別為0.32%、0.30%、0.58%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，于0、2、8、10、12、24 h在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量RSD分別為0.76%、0.93%、0.81%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液6份，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量RSD分別為0.34%、0.61%、0.25%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取6份供試品溶液適量，分別加入質(zhì)量濃度與體積相近的對(duì)照品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.1 Results of recovery tests for various constituents (n=6)

2.2 干膏率測定 取提取液適量，13 000 r/min離心10 min，精密量取上清液50 mL，置于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在105 ℃下烘干至恒重，置于干燥器中冷卻至室溫，迅速精密稱定質(zhì)量，計(jì)算干膏率，公式為干膏率=(干膏質(zhì)量/50×提取液總體積/藥材投料量)×100%。

2.3 數(shù)據(jù)歸一化 本實(shí)驗(yàn)以毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量及干膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)其進(jìn)行歸一化處理。原始數(shù)據(jù)先轉(zhuǎn)換為歸一值(di)，公式為di=(yi-ymin)/(ymax-ymin)，其中ymax、ymin分別是各評(píng)價(jià)指標(biāo)所能接受的最大值、最小值，再轉(zhuǎn)換為總評(píng)“歸一”值(OD值)，公式為OD=(d1×d2×……×di)1/i。

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 浸泡時(shí)間 稱取1/10處方量的藥材4份，加10倍量水分別浸泡1、2、3、4 h后回流提取60 min，考察浸泡時(shí)間對(duì)OD值的影響，結(jié)果見圖2。由此可知，OD值隨著浸泡時(shí)間延長而升高，但浸泡3、4 h差別不大，因此確定浸泡時(shí)間為3 h。

2.4.2 溶劑量 稱取1/10處方量的藥材4份，分別加8、10、12、16倍量水浸泡3 h后回流提取60 min，考察溶劑量對(duì)OD值的影響，結(jié)果見圖2。由此可知，OD值隨著料液比增加而升高，溶劑量達(dá)到12倍后趨勢(shì)較為平緩。考慮到濃縮工藝等后道工序，還需對(duì)溶劑量作進(jìn)一步優(yōu)化。

2.4.3 提取時(shí)間 稱取1/10處方量的藥材4份，加12倍量水浸泡3 h后分別提取30、60、90、120 min，考察提取時(shí)間對(duì)OD值的影響，結(jié)果見圖2。由此可知，提取時(shí)間為30～90 min時(shí)，OD值隨著其延長而升高，而提取90、120 min時(shí)無顯著差異?？紤]到提取時(shí)間是影響提取效率的主要因素，還需對(duì)其作進(jìn)一步優(yōu)化。

2.4.4 提取次數(shù) 稱取1/10處方量的藥材4份，加12倍量水浸泡3 h后分別提取1、2、3、4次，每次90 min，考察提取次數(shù)對(duì)OD值的影響，結(jié)果見圖2。由此可知，OD值隨著提取次數(shù)增加而升高，但提取3次后上述趨勢(shì)較為平緩，故選擇提取次數(shù)為3次。

圖2 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Results of single factor tests

2.5 響應(yīng)面法 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇溶劑量(A)、提取時(shí)間(B)作為影響因素，OD值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，因素水平見表2，結(jié)果見表3。

表2 因素水平 Tab.2 Factors and levels

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Design and results of tests

通過Design Expert 7.1.3軟件進(jìn)行二次多元回歸分析，得到方程為OD=-0.996 6+0.117 9A+7.971 4×10-3B+2.925 1×10-4AB-4.677 9×10-3A2-3.272 7×10-5B2，方差分析見表4。由此可知，模型擬合度較高(R2=0.990 0)，具有顯著性(P<0.01)；A、B、A2對(duì)OD值有極顯著影響(P<0.01)，B2、AB對(duì)OD值有顯著影響(P<0.05)；失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，表明該模型可靠。

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

再通過MATLAB R2014b軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果見圖3，可知當(dāng)A、B分別為16.742 2倍、132.43 min時(shí)，預(yù)測OD值為0.796 3。

圖3 各因素響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface plot for various factors

2.6 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)

2.6.1 模型建立 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)由2個(gè)神經(jīng)元組成的輸入層、4個(gè)神經(jīng)元的隱藏層、1個(gè)神經(jīng)元的輸出層組成,設(shè)置主要參數(shù)為隱含層傳遞函數(shù)“Tansig”，輸出層傳遞函數(shù)“Purelin”，訓(xùn)練函數(shù)“Trainlm”，最大迭代次數(shù)200次，學(xué)習(xí)速率0.1，網(wǎng)絡(luò)計(jì)算精密度1.0×10-3，其余為默認(rèn)值。表2中70%的數(shù)據(jù)用于訓(xùn)練神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，15%的數(shù)據(jù)用于測試，15%的數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)用MATLAB R2014b編程運(yùn)行，得到回歸圖(圖4)和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練圖(圖5)，可知由于樣本量少，網(wǎng)絡(luò)得不到充分的訓(xùn)練，故擬合效果不佳。

圖4 隱藏層回歸圖Fig.4 Regression diagrams for hidden layer

圖5 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練圖Fig.5 Training diagram for artificial neural network

2.6.2 遺傳算法預(yù)測極值 以人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)，其輸出(即OD值)為遺傳算法的適應(yīng)度函數(shù)，經(jīng)種群初始化、計(jì)算適應(yīng)度、遺傳(反復(fù)選擇/交叉/變異)后獲得適應(yīng)度函數(shù)最大值，設(shè)置主要參數(shù)為迭代次數(shù)100，種群規(guī)模20，交叉概率0.4，變異概率0.2，流程圖見圖6。經(jīng)過10代左右的進(jìn)化，其適應(yīng)度達(dá)到最大值0.763 0，此時(shí)A、B分別為10.64倍、129.21 min，見圖7。

圖6 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)極值流程圖Fig.6 Flow chart for artificial neural network extremum

圖7 適應(yīng)度曲線Fig.7 Curve for fitness

2.7 預(yù)測精度比較 本實(shí)驗(yàn)比較了響應(yīng)面法、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測精度，結(jié)果見表5，可知后者預(yù)測能力更好，誤差更小。

表5 響應(yīng)面法、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測精度比較Tab.5 Comparison of prediction accuracies for response surface method and artificial neural network

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn) 按上述優(yōu)化工藝進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表6。由此可知，響應(yīng)面法、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)所得OD值與預(yù)測值均無顯著差異(P>0.05)，但后者平均偏差更小。因此，最優(yōu)提取工藝為溶劑量10.64倍，提取時(shí)間129.21 min，提取次數(shù)3次。

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.6 Results of verification tests (Ⅰ, n=3)

2.9 中試提取參數(shù)篩選和驗(yàn)證 上述小試階段所得的最優(yōu)提取工藝在中試、大生產(chǎn)過程中，可能會(huì)出現(xiàn)加入等量溶劑及在相同提取時(shí)間、提取次數(shù)下提取效率發(fā)生變化的問題，而且中試、大生產(chǎn)更重視生產(chǎn)成本。因此，本實(shí)驗(yàn)通過調(diào)整溶劑量、提取時(shí)間對(duì)中試提取參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，即取10 000個(gè)制劑單位的藥材，設(shè)定溶劑量為8倍，提取次數(shù)為3次(提取時(shí)間分別為60、30、30 min)，計(jì)算毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表7。由此可知，與小試階段比較，各成分轉(zhuǎn)移率無顯著差異(P>0.05)，表明中試階段提取效果未受明顯影響。

表7 3種成分轉(zhuǎn)移率測定結(jié)果Tab.7 Results of transfer rate determination of three constituents

再按30 000個(gè)制劑單位藥材投料，即取黨參等8味藥材加水提取3次，第1次60 min，第2、3次各30 min，濾過，合并濾液，進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表8。由此可知，各成分轉(zhuǎn)移率與10 000制劑單位藥材投料比較，無顯著差異(P>0.05)，表明該工藝穩(wěn)定可靠，可用于健脾益氣口服液的大規(guī)模生產(chǎn)。

表8 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.8 Results of verification tests (Ⅱ, n=3)

3 討論

毛蕊異黃酮葡萄糖苷(黃芪指標(biāo)成分)、2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(制何首烏指標(biāo)成分)、橙皮苷(陳皮指標(biāo)成分)是健脾益氣方中君藥和臣藥的重要有效物質(zhì)，與藥效密切相關(guān)，故將三者含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。中藥復(fù)方在提取過程中，各因素之間、因素與水平之間存在多維度的關(guān)系，當(dāng)變量為復(fù)雜非線性關(guān)系時(shí)易導(dǎo)致其建模能力及預(yù)測精確度下降[9,11]，故在有限的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中需要一種強(qiáng)大的建模及預(yù)測能力工具才能將該關(guān)系客觀映射。響應(yīng)面法是以數(shù)學(xué)方程式的表達(dá)形式描述響應(yīng)值與多個(gè)變量的關(guān)系并建立數(shù)學(xué)模型，再運(yùn)用圖形技術(shù)展示以供人們直觀判別優(yōu)化區(qū)域的數(shù)據(jù)處理方法[12-13]，該方法可將復(fù)雜問題簡單化，具有較高的擬合度，常與星點(diǎn)設(shè)計(jì)聯(lián)用以優(yōu)化醫(yī)藥領(lǐng)域的生物活性提取工藝參數(shù)[14-16]。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)原理是以神經(jīng)元為基本單位，模仿生物神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)與功能建立的數(shù)學(xué)計(jì)算模型，具有高容錯(cuò)性、能優(yōu)化的特性，在擬合實(shí)驗(yàn)響應(yīng)、預(yù)測、復(fù)雜非線性多元變量建模等方面具有更高的準(zhǔn)確性和效率，適用于處理中藥復(fù)方制劑提取工藝中多因素、多水平及非線性的問題[17-18]，研究表明，與響應(yīng)面法比較，該方法在自變量未知及非線性更能體現(xiàn)出其建模和預(yù)測的優(yōu)勢(shì)[8,11]。本實(shí)驗(yàn)比較了響應(yīng)面法、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在健脾益氣口服液提取參數(shù)尋優(yōu)中的建模、預(yù)測及優(yōu)化能力，發(fā)現(xiàn)雖然后者預(yù)測結(jié)果更接近實(shí)際值，但與前者無顯著差異(P>0.05)。

綜上所述，響應(yīng)面法、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)均具有強(qiáng)大的建模能力和高準(zhǔn)確度，適合于健脾益氣口服液提取工藝小樣本數(shù)據(jù)的優(yōu)化，再從生產(chǎn)效率、可行性考慮，對(duì)所得最優(yōu)參數(shù)進(jìn)行中試規(guī)模的再調(diào)整。結(jié)果顯示，中試規(guī)模、小試規(guī)模的提取效果無顯著差異，印證了該方法的合理性和可行性。

致謝：感謝廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥制劑共性技術(shù)研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室梁健欽研究員為本實(shí)驗(yàn)提供指導(dǎo)。