健脾疏肝方對(duì)非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和功能的影響

張寧怡 余軼群 寇富舜 張陽(yáng) 史雨宸 曲英迪 李軍祥 韓海嘯

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征[1]，根據(jù)不同病理階段可分為非酒精性單純性脂肪肝(nonalcoholic simple fatty liver，NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)及相關(guān)的肝硬化(non-alcoholic cirrhosis，NAC)，乃至肝癌(hepatocellular carcinom，HCC)[2]。NASH是NAFL向HCC轉(zhuǎn)變過(guò)程中的重要限速環(huán)節(jié)，普通成人NAFLD患病率介于6.3%～45%，其中10%～30%為NASH[3]。肝臟在全身代謝過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，是脂質(zhì)代謝的主要器官，包括游離脂肪酸、甘油三酯、膽固醇和膽汁酸的合成、氧化和轉(zhuǎn)運(yùn)。肝細(xì)胞線粒體是脂肪酸β氧化的重要場(chǎng)所，肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)度沉積后產(chǎn)生的過(guò)氧化反應(yīng)極易損傷線粒體，線粒體功能異常必然會(huì)導(dǎo)致整個(gè)肝臟功能活動(dòng)的異常[4]，更是肝臟疾病相關(guān)慢性代謝疾病(如肥胖、代謝綜合征和2型糖尿病)發(fā)病的關(guān)鍵因素[5]。當(dāng)肝臟發(fā)生NASH時(shí)，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的過(guò)氧化因子攻擊線粒體使其功能失常，雙層膜和線粒體嵴結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致呼吸功能受損。本課題組認(rèn)為，NASH的關(guān)鍵病機(jī)在于“脾虛肝郁，痰濁瘀阻”，治療宜肝脾同調(diào)，結(jié)合“見(jiàn)肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾”的中醫(yī)理論創(chuàng)制健脾疏肝方。本研究將通過(guò)觀察健脾疏肝方對(duì)NASH大鼠肝酶、血脂水平、肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，探究健脾疏肝方的作用靶點(diǎn)，以期為NASH的中醫(yī)藥防治方案提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境

SPF級(jí)SD雄性大鼠20只，6周齡，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SYXK(京)2016-0038，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。保證正常光照節(jié)律、溫度濕度、環(huán)境安靜，正常大鼠生長(zhǎng)繁殖飼料飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與模型飼料

健脾疏肝方：炒白術(shù)15 g、茯苓15 g、絞股藍(lán)10 g、澤瀉20 g、水飛薊15 g、決明子10 g、廣郁金10 g、丹參30 g、白芥子10 g、生山楂15 g。中藥配方顆粒由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院提供，給藥容積為10 mL/kg，給藥劑量根據(jù)動(dòng)物體表面積比值計(jì)算。

易善復(fù)(多烯磷脂酰膽堿膠囊)，228 mg/粒，賽諾菲(北京)制藥有限公司生產(chǎn)。

高脂飼料配方為88%基礎(chǔ)飼料+2%膽固醇+10%豬油，由科澳協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)，4℃低溫保存；基礎(chǔ)飼料常溫保存。

1.3 主要試劑、儀器

4%多聚甲醛(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；水合氯醛(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，使用蒸餾水配置成10%溶液備用；生化試劑盒均為江蘇澤成生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色相關(guān)染液均為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；油紅O染色相關(guān)染液為北京雷根生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

電子讀數(shù)分析天平(型號(hào)：SL202)，購(gòu)自上海精密科學(xué)儀器有限公司；光學(xué)顯微鏡(型號(hào)：DM3000)，購(gòu)自德國(guó)徠卡儀器有限公司；透射電子顯微鏡(型號(hào)：H-7650)，購(gòu)自日本日立公司。

1.4 分組、造模及給藥

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，根據(jù)體質(zhì)量將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、健脾疏肝方組、易善復(fù)組，每組5只。

正常組予普通飼料，其余3組飼喂高脂飼料8周，自由攝食飲水，建立NASH模型。

健脾疏肝方組和易善復(fù)組在造模期間同時(shí)給藥，給藥容積為10 mL/kg，健脾疏肝方按15.75 g/kg給藥，易善復(fù)組按137.3 mg/kg給藥；正常組與模型組每日根據(jù)體質(zhì)量予相應(yīng)體積去離子水灌胃。每日灌胃1次，持續(xù)8周。

1.5 動(dòng)物取材

取材前禁食不禁水12小時(shí)，麻醉按4 mL/kg的濃度腹腔注射10%水合氯醛。普通采血管(紅管)收集血液標(biāo)本，靜置2小時(shí)后以3000 r/min轉(zhuǎn)速離心10分鐘，分離血清并用凍存管分裝，置于-80℃冰箱中保存。

摘取大鼠完整肝臟，取肝最大葉，剪取體積約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm肝組織兩塊(低溫操作)，一塊迅速置于4%多聚甲醛固定，另一塊OCT膠包埋后于液氮中迅速冰凍，并以錫紙包裹密封，液氮封存。另剪取體積約0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm的肝組織，置于4℃預(yù)冷的電鏡液(2.5%戊二醛溶液)中固定2小時(shí)，1×PBS緩沖液(pH=7.4)反復(fù)浸泡沖洗3次，每次處理時(shí)間約15分鐘，沖洗結(jié)束后將肝組織浸入PBS緩沖液中，4℃保存。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 血清學(xué)指標(biāo) 全自動(dòng)血液生化分析儀檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)。

1.6.2 肝組織病理學(xué)改變 新鮮肝臟組織用4%組織固定液固定后，制作石蠟切片，行HE染色，光鏡下觀察肝組織病理改變，包括肝細(xì)胞脂肪變程度、是否存在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、氣球樣變、細(xì)胞壞死等改變，并參照《NAFLD活動(dòng)度積分組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)》(NAFLD activity score，NAS)進(jìn)行半定量評(píng)分(見(jiàn)表1)；新鮮肝臟組織冰凍切片行油紅O染色，光鏡下觀察肝細(xì)胞脂肪含量。

1.6.3 肝細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)改變 將取材所得的約1 mm3肝組織塊使用2.5%戊二醛進(jìn)行固定(保持在4℃環(huán)境)后用鋨酸固定，酒精梯度脫水。隨后分別以環(huán)氧丙烷∶樹(shù)脂(1∶1)、環(huán)氧丙烷∶樹(shù)脂(1∶3)、100%純樹(shù)脂浸透，包埋聚合，半薄定位，超薄切片，50%醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，雙蒸水漂洗，干燥后電鏡觀察肝細(xì)胞線粒體數(shù)量、形態(tài)及其他細(xì)胞器等超微結(jié)構(gòu)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 健脾疏肝方對(duì)NASH大鼠血清ALT、AST水平的影響

與正常組相比，模型組血清ALT、AST水平明顯升高(P<0.01)；給藥治療后，健脾疏肝方組和易善復(fù)組血清ALT、AST水平較模型組降低(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

表2 各組NASH大鼠血清ALT、AST比較

2.2 健脾疏肝方對(duì)NASH大鼠血脂水平的影響

與正常組相比，模型組血清TG、TC、LDL均明顯升高，HDL水平明顯降低(P<0.01)。給藥治療后，健脾疏肝方組、易善復(fù)組血清TG、LDL水平較模型組明顯降低(P<0.05)；健脾疏肝方組和易善復(fù)組血清HDL水平較模型組升高(P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 各組NASH大鼠血清TG、TC、HDL、LDL比較

2.3 健脾疏肝方對(duì)NASH大鼠肝組織病理學(xué)變化的影響

2.3.1 對(duì)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響 從HE染色切片可發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核居中，肝索排列整齊。模型組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性明顯，肝細(xì)胞腫脹，內(nèi)可見(jiàn)大小、數(shù)量各異的脂肪空泡，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，部分肝組織切片可見(jiàn)氣球樣變性。健脾疏肝方組大鼠肝臟可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)部分被破壞，肝細(xì)胞腫脹，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)氣泡樣變性和小脂滴沉積。易善復(fù)組大鼠部分肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)脂滴，無(wú)明顯大脂滴形成，肝細(xì)胞與結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)。見(jiàn)圖1。

注：A 正常組；B 模型組；C 健脾疏肝方組；D 易善復(fù)組。

NAS量表結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組出現(xiàn)了明顯的肝脂肪變、小葉內(nèi)炎癥和肝細(xì)胞氣球樣變，總分大于5分，得分明顯高于正常組(P<0.01)，符合NASH的組織學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，提示造模成功。與模型組相比，健脾疏肝方組和易善復(fù)組病理學(xué)評(píng)分總分均顯著下降(P<0.01)；其中健脾疏肝方組可顯著改善肝小葉內(nèi)炎癥、肝細(xì)胞氣球樣變，且評(píng)分顯著降低(P<0.05)，易善復(fù)組可顯著改善肝脂肪變、肝小葉內(nèi)炎癥、肝細(xì)胞氣球樣變，且評(píng)分顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組NASH大鼠肝臟NAS評(píng)分比較分)

2.3.2 對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況的影響 從油紅O染色切片可發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠肝組織內(nèi)有少量橘紅色脂滴，體積較小。模型組肝細(xì)胞內(nèi)有大面積脂肪沉積，主要為大脂滴，紅染較深，融合成片。健脾疏肝方組有小脂滴沉積，無(wú)大片融合。易善復(fù)組脂肪沉積明顯輕于模型組和健脾疏肝方組，脂滴較分散，無(wú)大片融合。見(jiàn)圖2。

注：A 正常組；B 模型組；C 健脾疏肝方組；D 易善復(fù)組。

2.4 健脾疏肝方對(duì)肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1 正常組 電鏡下可見(jiàn)該組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞核較大居中，核膜完整，核仁清晰，核內(nèi)常染色質(zhì)多；細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器豐富，可見(jiàn)大量線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布廣泛，結(jié)構(gòu)清晰，個(gè)別細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)少量小脂滴，未見(jiàn)髓鞘樣結(jié)構(gòu)。高倍鏡下(×10 000)可見(jiàn)肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)正常，雙層膜完整清晰，線粒體嵴排列正常，線粒體周?chē)鷩@大量?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)。見(jiàn)圖3。

注：黑色箭頭處為線粒體，白色箭頭處為脂滴。

2.4.2 模型組 低倍鏡下(×3 000)可見(jiàn)模型組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)有大量脂滴沉積，占細(xì)胞面積約1/3～1/2，部分肝細(xì)胞核被脂滴擠壓變形或擠向細(xì)胞邊緣，細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)異染色質(zhì)。線粒體較正常組體積增大，脂滴與線粒體互相擠壓，多個(gè)線粒體受壓聚集成團(tuán)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體數(shù)量明顯減少。高倍鏡下(×10 000)可見(jiàn)線粒體周?chē)鷩@的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量明顯少于正常組，結(jié)構(gòu)不清晰，伴隨核糖體減少或消失；線粒體結(jié)構(gòu)被破壞，雙層膜模糊或消失，與胞質(zhì)分界不清晰；線粒體嵴排列紊亂或數(shù)量減少，甚至消失。細(xì)胞質(zhì)中可見(jiàn)較多溶酶體，其內(nèi)可見(jiàn)吞噬物，偶爾可見(jiàn)髓鞘樣結(jié)構(gòu)。見(jiàn)圖4。

注：黑色箭頭處為線粒體，白色箭頭處為脂滴；ER為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，MF為髓鞘樣結(jié)構(gòu)。

2.4.3 健脾疏肝方組 低倍鏡下(×3 000)可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積，部分融合成片，線粒體數(shù)量大體與模型組一致，少數(shù)細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量較模型組增多，可能與肝腺泡分區(qū)有關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量較模型組明顯增多，且結(jié)構(gòu)較清晰；部分線粒體雙層膜及線粒體嵴結(jié)構(gòu)破壞，形成電子密度較高的致密團(tuán)體。高倍鏡下(×10 000)可見(jiàn)線粒體形態(tài)明顯較模型組好轉(zhuǎn)，雙層膜結(jié)構(gòu)較完整，仍有少量線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)不清晰，線粒體嵴排列紊亂或消失，或雙層膜結(jié)構(gòu)完整，線粒體嵴消失。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)髓鞘樣結(jié)構(gòu)，數(shù)量較模型組略增多。見(jiàn)圖5。

注：黑色箭頭處為線粒體，白色箭頭處為脂滴；ER為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，MF為髓鞘樣結(jié)構(gòu)。

2.4.4 易善復(fù)組 低倍鏡下(×3 000)可見(jiàn)易善復(fù)組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積，數(shù)量較模型組與健脾疏肝方組減少，占細(xì)胞面積1/2以下；線粒體數(shù)量較模型組明顯增多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)亦增多，結(jié)構(gòu)清晰，伴核糖體數(shù)量增加。高倍鏡下(×8 000，×10 000)可見(jiàn)線粒體形態(tài)多樣，大部分線粒體結(jié)構(gòu)完整，雙層膜清晰，線粒體嵴排列整齊，少數(shù)線粒體雙層膜破壞，或雙層膜結(jié)構(gòu)完整，但線粒體嵴被破壞。見(jiàn)圖6。

2.5 健脾疏肝方對(duì)NASH大鼠肝臟線粒體數(shù)目的影響

與正常組相比，模型組線粒體數(shù)目在低倍鏡(×3 000)視野下明顯少于正常組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00<0.05)；藥物干預(yù)后，健脾疏肝方組線粒體數(shù)量較模型組增加，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，易善復(fù)組線粒體數(shù)目與模型組相比明顯增加，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表5。

注：黑色箭頭處為線粒體，白色箭頭處為脂滴。

表5 電鏡下各組NASH大鼠肝細(xì)胞線粒體數(shù)目比較個(gè))

3 討論

2020年國(guó)際專(zhuān)家共識(shí)小組提議將NAFLD這一病名更改為代謝功能障礙相關(guān)性脂肪性肝病(metabolic associated fatty liver disease，MAFLD)，并且重新定義了MAFLD的相關(guān)診斷，即存在基于組織學(xué)、影像學(xué)或血液生物標(biāo)記物的肝臟脂肪變性證據(jù)，同時(shí)至少包含超重/肥胖、2型糖尿病或代謝紊亂的證據(jù)之一[6]。這一診斷標(biāo)準(zhǔn)的變更取代了本病的排他性診斷方法，并且著重強(qiáng)調(diào)了本病發(fā)生過(guò)程中至少存在的兩種代謝異常。專(zhuān)家小組同時(shí)指出，MAFLD活動(dòng)等級(jí)是一個(gè)連續(xù)的等級(jí)，在疾病評(píng)估和嚴(yán)重程度分層方面，以往的脂肪性肝炎和非脂肪性肝炎的二分法具有一定的局限性，最好使用活動(dòng)度和纖維化程度來(lái)描述。但有關(guān)本病的定義以及術(shù)語(yǔ)仍有待于在臨床診療及臨床試驗(yàn)中進(jìn)一步檢驗(yàn)才能真正達(dá)成國(guó)際共識(shí)并應(yīng)用[7]。

線粒體是肝臟脂肪β氧化最主要的細(xì)胞器[8]，也是肝細(xì)胞最重要的產(chǎn)能細(xì)胞器，可通過(guò)整合多個(gè)信號(hào)途徑來(lái)控制肝細(xì)胞的生理功能及凋亡，因此線粒體在能量代謝和細(xì)胞死亡起到?jīng)Q定性作用。相關(guān)證據(jù)表明，線粒體功能障礙是肝臟相關(guān)慢性代謝疾病的關(guān)鍵發(fā)病因素[9]。NASH的發(fā)病是由于肝細(xì)胞內(nèi)β氧化水平降低，脂肪生成增加，脂質(zhì)堆積產(chǎn)生活性氧導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，進(jìn)而激活枯否細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞，誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終導(dǎo)致肝臟炎癥和纖維化。與此同時(shí)，炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡程序啟動(dòng)會(huì)反過(guò)來(lái)對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器產(chǎn)生損害，其中最常見(jiàn)的是線粒體損害。NASH可以導(dǎo)致線粒體呼吸鏈異常、能量代謝障礙、氧化應(yīng)激損傷、mtDNA受損，誘發(fā)線粒體自噬異常，進(jìn)而發(fā)生線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。因此，維持肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)、數(shù)量、功能的正常，在NASH治療中不可忽視。

本課題組認(rèn)為，NASH病位在肝，與脾密切相關(guān)?！督饏T要略》言：“見(jiàn)肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾。”肝體失用，疏泄失常，氣機(jī)不暢則影響中焦脾胃氣機(jī)升降；脾失健運(yùn)，運(yùn)化失司則內(nèi)生濕、瘀、痰、脂濁等多種病理產(chǎn)物?！夺t(yī)宗必讀》言：“脾土虛弱，清者難升，濁者難降，留中滯膈，凝聚為痰”，痰瘀濁毒互結(jié)，進(jìn)一步影響中焦氣機(jī)，繼而發(fā)為NASH。故該病以肝郁脾虛為本，氣、濕、瘀、痰、脂濁等病理產(chǎn)物互結(jié)是本病發(fā)生發(fā)展的重要病機(jī)。

根據(jù)上述病機(jī)，本課題組認(rèn)為NASH的治療應(yīng)肝脾同調(diào)，在調(diào)理肝脾的同時(shí)注重化痰祛瘀，據(jù)此創(chuàng)制健脾疏肝方。該方以絞股藍(lán)健脾益氣、降脂化痰，郁金活血化瘀、疏肝解郁為君；以水飛薊疏肝利膽、降脂祛濁，生白術(shù)健脾燥濕化痰，澤瀉淡滲利濕、降脂化濁為臣；佐以茯苓健脾利濕、白芥子化痰散結(jié)、決明子清肝降脂、丹參活血化瘀、焦山楂祛瘀消積。全方共十味藥，共奏健脾疏肝、活血化痰、降脂祛濁之功。

現(xiàn)代藥理研究表明，健脾疏肝方的不同組成藥物對(duì)于改善NASH肝臟線粒體結(jié)構(gòu)和功能有不同程度的療效。蔡宇等[10]研究發(fā)現(xiàn)，中藥絞股藍(lán)的主要成分絞股藍(lán)總皂苷可降低非酒精性脂肪肝大鼠血清甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶含量，升高血清高密度脂蛋白膽固醇含量，有效抑制非酒精性脂肪肝大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)及肝細(xì)胞凋亡，恢復(fù)肝臟功能。姜黃素可通過(guò)改善線粒體形態(tài)并抑制細(xì)胞凋亡來(lái)預(yù)防NASH的發(fā)生發(fā)展[11]。郅敏等[12]研究發(fā)現(xiàn)水飛薊賓可改善NAFLD大鼠肝臟線粒體膜流動(dòng)性，恢復(fù)線粒體動(dòng)力學(xué)。白術(shù)多糖可穩(wěn)定肝臟線粒體結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)肝細(xì)胞清除氧自由基能力，從而調(diào)節(jié)線粒體功能[13]。林文津等[14]研究表明，澤瀉乙醇提取物具有顯著促進(jìn)線粒體能量代謝的作用，決明子乙醇提取物可提高D-氨基半乳糖所致急性肝損傷大鼠模型血清及肝線粒體超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶[15]。丹酚酸B可增加線粒體膜流動(dòng)性，減輕線粒體腫脹，增加呼吸鏈氧化功能，減少細(xì)胞凋亡引發(fā)的線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C釋放，保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，電鏡下模型組的肝細(xì)胞線粒體形態(tài)較正常組大，且電子密度更低，說(shuō)明氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，線粒體內(nèi)基質(zhì)增加，細(xì)胞器水腫。經(jīng)健脾疏肝方干預(yù)后，線粒體形態(tài)明顯較模型組好轉(zhuǎn)，腫脹減輕或消失，雙層膜結(jié)構(gòu)較完整，仍有少量線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)不清晰，線粒體嵴排列紊亂或消失。同時(shí)，線粒體數(shù)量較模型組略增加，說(shuō)明健脾疏肝方有減輕線粒體腫脹、改善線粒體膜通透性、恢復(fù)線粒體形態(tài)的作用。經(jīng)過(guò)健脾疏肝方干預(yù)后，NASH大鼠肝臟血清酶學(xué)和血脂水平均下降，提示該方可能通過(guò)保肝降酶和減輕肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積來(lái)降低胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而緩解線粒體功能的損傷。

除線粒體外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是肝臟發(fā)揮正常生理功能的另一個(gè)重要細(xì)胞器，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等合成和代謝活動(dòng)均在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上進(jìn)行。“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激”[17]是指因細(xì)胞應(yīng)激而導(dǎo)致正常的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊能力受損，與此同時(shí)，各種損傷因子引起的肝細(xì)胞損傷亦可反映于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，最常見(jiàn)的改變?yōu)閮?nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、分布面積縮小。研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與NAFLD發(fā)病機(jī)制相關(guān)[18-19]，當(dāng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白增多，激活一系列下游因子，觸發(fā)多種通路如PERK/eIF-2α信號(hào)通路[20]、XBP1和MEK1/ERK信號(hào)通路[21]從而增加肝臟脂質(zhì)沉積。而且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡，這是NASH發(fā)病機(jī)制中除線粒體階段凋亡之外的又一種細(xì)胞器介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，健脾疏肝方組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量較模型組明顯增多，結(jié)構(gòu)較清晰，分布較廣泛，提示健脾疏肝方有改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、增加其數(shù)量和改善其結(jié)構(gòu)的功能，可同時(shí)以線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)兩處為作用靶點(diǎn)，從亞細(xì)胞水平切入，減少細(xì)胞凋亡，恢復(fù)細(xì)胞功能，改善NASH。

易善復(fù)是臨床治療NAFLD的常用藥，主要成分為多聚磷脂酰膽堿二酰甘油，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與構(gòu)成生物膜的組分高度相似，可替換人體內(nèi)源性磷脂，從而修復(fù)受損的肝細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜。本研究發(fā)現(xiàn)，易善復(fù)組大鼠脂滴數(shù)量較模型組與健脾疏肝方組均有減少，線粒體數(shù)量較模型組明顯增多(P<0.01)，大部分線粒體結(jié)構(gòu)完整，雙層膜清晰，線粒體嵴排列整齊，少數(shù)線粒體膜結(jié)構(gòu)破壞，線粒體周邊內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，結(jié)構(gòu)清晰。易善復(fù)組的線粒體形態(tài)修復(fù)效果優(yōu)于健脾疏肝方組，結(jié)合易善復(fù)的作用機(jī)制，提示健脾疏肝方在組方方面可以結(jié)合現(xiàn)代藥理研究增加有修復(fù)生物膜作用的藥物，以提高全方療效。

綜上所述，健脾疏肝方可改善高脂飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠模型肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)損害，恢復(fù)線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)完整性，改善線粒體嵴排列紊亂，減輕線粒體腫脹；恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)和數(shù)量，增加核糖體數(shù)量。其作用靶點(diǎn)在于修復(fù)線粒體形態(tài)和功能，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量和形態(tài)，從而拮抗氧化應(yīng)激反應(yīng)所導(dǎo)致的線粒體損傷、凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從亞細(xì)胞水平調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝過(guò)程，進(jìn)而改善NASH。

多靶點(diǎn)、多途徑治療是中醫(yī)藥防治NASH的優(yōu)勢(shì)，本研究從亞細(xì)胞水平觀察了健脾疏肝方對(duì)肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，為中醫(yī)藥防治NASH的機(jī)制研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。除細(xì)胞器結(jié)構(gòu)之外，后續(xù)還可針對(duì)線粒體能量代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路等功能失常方面探究健脾疏肝方的作用靶點(diǎn)，為該方的臨床應(yīng)用提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)豐富中醫(yī)藥防治NASH方案有現(xiàn)實(shí)意義。