呼吸道及腸道菌群在慢性阻塞性肺病發(fā)病機制中的研究進展

曹 楊，舒 磊，馮旰珠*

1南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京210011；2南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院呼吸科，江蘇 南京211166

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstractive pulmonary disease，COPD）是最常見的呼吸系統(tǒng)疾病之一，因慢性持續(xù)性氣道炎癥、小氣道病變、肺氣腫及肺彈性減退最終導(dǎo)致不可逆氣流受限和通氣功能障礙［1］。該病是肺部慢性疾病死亡的主要原因之一，它不僅增加了患者痛苦，而且增加了其經(jīng)濟負擔，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）推測，至2030年COPD將成為全球死亡率第三的疾病［2-3］。長期以來，煙草煙霧及生物燃料燃燒造成的室內(nèi)空氣污染被認為是COPD發(fā)病的主要危險因素，氣道內(nèi)細菌的定植與感染則是COPD急性加重的主要誘發(fā)因素［4-6］。

近年來隨著微生物菌群研究的不斷深入，呼吸道及腸道菌群與COPD的關(guān)系也成為研究熱點。運用經(jīng)典培養(yǎng)技術(shù)檢測后發(fā)現(xiàn)，健康人群下呼吸道及肺是無菌的，而COPD患者呼吸道則被條件致病菌定植［7］。然而，16S rRNA基因測序表明下呼吸道無論在健康還是患病狀態(tài)下均存在著大量微生物群落。早期的基因測序研究主要針對腸道菌群，近來研究表明，呼吸道如同腸道一樣也存在著大量定植菌，且因呼吸道和腸道是與外界直接相通的空腔臟器，有著共同的胚胎起源，故呼吸道和腸道之間存在“腸-肺”軸的內(nèi)在聯(lián)系［8-9］。甚至研究顯示，在COPD不同表型中，呼吸道菌群存在不同特征，且腸道菌群與COPD發(fā)生發(fā)展、治療也存在緊密聯(lián)系。本文就近年來國內(nèi)外關(guān)于COPD菌群特征的相關(guān)研究歸納總結(jié)，旨在為COPD的防治提供新思路。

1 16S rRNA基因測序技術(shù)在人體微生物組學(xué)中的應(yīng)用

早在1990年人類基因組計劃（human genome project，HGP）通過測序發(fā)現(xiàn)，人類基因組含有約2.6萬個基因，人類體表（皮膚）及體內(nèi)（消化道、口鼻、生殖道）擁有龐大的微生物群落，其總數(shù)達到人類自身細胞數(shù)的10～100倍［10］。作為HGP的延續(xù)，2007年美國國立衛(wèi)生研究院啟動了人體微生物組計劃（human microbiome project，HMP），分別對239例健康成人的5個身體部位（口、鼻、腸道、泌尿道及皮膚）樣本，進行微生物組基因測序，基本明確了健康人群正常微生物組的組成及分布［11］。而隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)，下呼吸道即使在健康狀態(tài)下也存在著不同的細菌群落［12］。

傳統(tǒng)細菌學(xué)診斷通常依賴于細菌培養(yǎng)，但陽性率低，16S rRNA基因測序則因其高靈敏性逐漸成為微生物的檢測和鑒定的重要方法［13］。16S rRNA基因廣泛存在于所有微生物中，具有高度保守性及特異性，包含10個恒定區(qū)和9個可變區(qū)（V1～V9），大規(guī)模的16S rRNA基因分析是基于V1～V3或V4～V5可變區(qū)進行測序，V1～V3區(qū)幾乎可鑒定除部分腸桿菌科以外所有的細菌，V4～V5區(qū)具有較高的特異性［14］。對相應(yīng)可變區(qū)采用聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）進行擴增，運用Illumina、454焦磷酸測序等高通量技術(shù)在短時間內(nèi)讀取大量短核苷酸序列［15-16］，使用微生物生態(tài)學(xué)定量解析（quantitative insight into microbial ecology，OIIME）工具包根據(jù)97%的序列相似度進行比對及聚類分析，從而得到一系列操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），并在不同微生物群落門、種、屬層面按OTU對物種多樣性及豐富度，如α多樣性、β多樣性進行鑒定與分析［17］。近年來，研究者運用這種快速敏感技術(shù)，對人體不同器官及不同疾病狀態(tài)下微生物群落的特征進行分析，得到一些明確結(jié)論，對疾病的診斷起到重要作用。

2 呼吸道微生物菌群組成

2010年，Hilty等［18］首次通過對健康人、哮喘患者和COPD患者的口咽、鼻咽及左上肺支氣管黏膜刷檢樣本進行測序，發(fā)現(xiàn)健康人支氣管樹并不是無菌的。后續(xù)研究結(jié)果顯示，健康下呼吸道高豐度菌群在門水平多為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidertes）、變形菌門（Proteobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）及放線菌門（Actinobacteria）；而在屬水平則多為鏈球菌（Streptococcus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、韋榮氏菌（Veillonella）、普雷沃氏菌（Prevotella）及嗜血桿菌（Hemophileae）［13，18-21］。這些細菌在健康人群呼吸道內(nèi)定植與人體共生，發(fā)揮著免疫調(diào)節(jié)作用。呼吸道菌群疾病狀態(tài)下與健康狀態(tài)下存在明顯差異，有研究通過對囊性肺纖維化（cystic fibrosis，CF）患者痰液測序后發(fā)現(xiàn)：CF患者肺內(nèi)厭氧菌（Anaerobe）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）菌群較健康者豐度顯著增高［22-23］。Strachan［24］則在1989年提出兒童期感染減少與哮喘的發(fā)生明顯關(guān)聯(lián)這一觀點，從而開創(chuàng)了“衛(wèi)生假說”這一理論。此后的研究發(fā)現(xiàn)，兒童期抗生素使用與哮喘發(fā)生呈正相關(guān)，表明哮喘的發(fā)生與微生物菌群的紊亂相關(guān)。研究顯示，哮喘患者支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中變形菌門豐度明顯增高，而擬桿菌門的豐度則顯著下降［18，25］。

3 COPD患者呼吸道菌群的特征

3.1 COPD患者呼吸道微生物菌群種類及其多樣性

通過對COPD患者呼吸道標本測序后發(fā)現(xiàn)，變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和厚壁菌門等4種高豐度門，鏈球菌、普雷沃氏菌、莫拉菌（Moraxella）、嗜血桿菌、不動桿菌（Acinetobacter）、梭桿菌（Fusobacterium）和奈瑟菌（Neisseria）等7種高豐度屬，占據(jù)總序列數(shù)的60%［26-27］。Hilty等［18］將COPD患者的氣道微生物多樣性與健康對照組對比后發(fā)現(xiàn)，COPD患者較對照組氣道內(nèi)變形菌門豐度明顯升高，尤其以嗜血桿菌屬變化最為顯著，而擬桿菌門，特別是其中的普氏菌屬，豐度較對照組明顯下降。

3.2 吸煙對COPD呼吸道內(nèi)菌群的影響

吸煙是COPD氣道慢性炎癥的主要危險因素，導(dǎo)致了COPD的發(fā)生與發(fā)展，且戒煙后對氣道的炎性損害可持續(xù)存在。煙草的暴露致使肺部先天性防御能力受損，上氣道潛的在定植菌（potentially pathogenic microorganisms，PPM）通過呼吸的抽吸過程進入下呼吸道，引起氣道上皮受損、誘發(fā)免疫細胞激活，此過程周而復(fù)始形成惡性循環(huán)，即“惡性循環(huán)假說”理論［28］。Sethi等［29］通過對穩(wěn)定期COPD戒煙者（戒煙＞1年）、健康戒煙者（既往吸煙目前已戒煙＞1年）及健康非吸煙者（既往從未吸煙）的BALF檢測后發(fā)現(xiàn)：34.6%（9/26）COPD患者，0%（0/20）的健康戒煙者及6.7%（1/15）非吸煙者存在PPM，如流感嗜血桿菌（占比26.9%），COPD組的中性粒細胞量、白介素-8（interleukin-8，IL-8）和金屬蛋白酶-9（metalloproteinase-9，MMP-9）水平顯著增加，且COPD組BALF中的內(nèi)毒素水平明顯高于另外兩組，僅COPD組可見PPM，該研究結(jié)果表明香煙煙霧是導(dǎo)致COPD發(fā)病及氣道內(nèi)致病菌群定植的一個獨立的危險因素，且戒煙后可持續(xù)存在。Wang等［30］對COPD目前吸煙、COPD已戒煙及健康對照組的吸煙、未吸煙狀態(tài)下的痰液菌群研究后發(fā)現(xiàn)，健康吸煙組較COPD吸煙組患者氣道中的變形菌門，嗜血桿菌屬豐度明顯增高；有趣的是，COPD吸煙組較COPD已戒煙組氣道內(nèi)變形菌門、嗜血桿菌屬反而顯著下降，從而驗證了“吸煙導(dǎo)致COPD氣道炎癥和菌群紊亂，且戒煙不能逆轉(zhuǎn)該進程”這一觀點，符合“惡性循環(huán)假說”理論。

3.3 COPD急性加重期菌群變化

COPD患者呼吸道菌群不僅與正常人群存在差異，而且即使同一患者，其急性加重前后微生物群落也有不同。Wang等［27］研究發(fā)現(xiàn)，在急性加重期呼吸道菌群較穩(wěn)定期有顯著變化，急性加重期菌群多樣性降低，變形菌門尤以嗜血桿菌、莫氏菌豐度增加，厚壁菌門中葡萄球菌顯著下降。Sun等［31］在研究了15例COPD患者急性加重D1（加重期）、D7及D14（緩解期）氣道分泌液的菌群后，得出與Wang等［27］類似的結(jié)果，加重期較緩解期莫氏菌豐度增加了5%，嗜血桿菌增加3.0%，鏈球菌則減少3.8%；Molyneaux等［32］研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者感染鼻病毒（rhinovirus）后其致病流感嗜血桿菌豐度顯著增加。這些研究表明，COPD急性加重在很大程度上與微生物多樣性降低及變形菌比例的增加有關(guān)。

由上述可見，COPD患者是無論穩(wěn)定期還是急性加重期，抑或吸煙，均可見下呼吸道以變形菌門尤其是嗜血桿菌增加為主。因此有理由推測，嗜血桿菌可能系COPD患者呼吸道的“關(guān)鍵物種”，其在擾亂呼吸道微生物生態(tài)系統(tǒng)，使之進入失調(diào)狀態(tài)，引發(fā)氣道促炎反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［33］。因此，針對變形菌門嗜血桿菌屬進行適當干預(yù)可能是COPD防治的一個潛在選擇。

3.4 藥物治療對COPD呼吸道菌群的影響

糖皮質(zhì)激素及抗生素治療是COPD急性加重期治療過程中最常用的藥物。相關(guān)研究表明，這兩類藥物的應(yīng)用可改變COPD患者下呼吸道的菌群。接受糖皮質(zhì)激素治療的COPD患者下呼吸道菌群α多樣性下降，嗜血桿菌和莫拉菌豐度增加，鏈球菌屬豐度下降，而抗生素的使用則可觀察到與上述相反的結(jié)果［27］。

微生物群落由多種微生物物種組成，各物種間既需要爭奪空間和資源，又需要相互協(xié)同相互作用，這種現(xiàn)象可用“關(guān)鍵物種”假說來解釋：即相對較低的細菌豐度的微小變化，也可能對其微生物群落組成結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響，從而改變機體的疾病狀態(tài)，似有“牽一發(fā)而動全身”的現(xiàn)象［34］。

4 腸道微生物菌群對COPD的影響及治療價值

HMP表明人類腸道中有1×1014～1×1015個微生物，其細菌種類達1 000多種［11］。在門水平上，高豐度菌門主要為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門，其中厚壁菌門和擬桿菌門占所有菌門的90%；在屬水平上，最常見菌為雙歧桿菌（Bifdobacterium），擬桿菌屬，乳桿菌（Lactobacillus），腸球菌（Enterococcus），鏈球菌和柔嫩梭菌（Faecalibacterium），其核心菌門與下呼吸道核心菌門相似［35-36］。

根據(jù)與宿主的關(guān)系腸道菌群可分為共生菌、條件致病菌和病原菌。其中，共生菌能刺激并提高身體的免疫機能，共生菌中的乳桿菌、擬桿菌、雙歧桿菌、梭狀芽胞桿菌（Clostridium）等可將膳食纖維發(fā)酵成短鏈脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA），這些SCFA包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等有機酸，它們在調(diào)節(jié)腸道及呼吸道微生物菌群平衡和機體免疫中發(fā)揮著重要作用［37-39］。近年來提出的“腸-肺”軸理論表明，呼吸道與腸道間存在病理生理的相互作用［40］。有研究表明，COPD患者腸道通透性較健康人群高，而腸道高通透性可引起細菌或其產(chǎn)物移位從而導(dǎo)致相應(yīng)組織部位的炎癥，腸道菌群代謝產(chǎn)物三聚氰胺-N-氧化物（trimethylamine-N-oxide，TMAO）與COPD患者的遠期病死率增加有關(guān)；另有研究顯示，腸道益生菌對常見呼吸系統(tǒng)疾病，如支氣管哮喘、COPD、CF及肺癌等有干預(yù)和治療效應(yīng)［41-43］。且不同人群可因吸煙、飲食、抗生素等多種因素影響著其腸道菌群的組成。

4.1 香煙煙霧的影響

有文獻復(fù)習(xí)了2000—2016年有關(guān)吸煙對腸道微生物菌群影響的相關(guān)文獻，發(fā)現(xiàn)吸煙可導(dǎo)致腸道放線菌門、厚壁菌門中雙歧桿菌屬和乳球菌屬減少，變形菌門和擬桿菌門中梭狀芽孢桿菌屬、擬桿菌屬和普氏桿菌屬增加，而戒煙后厚壁菌門和放線菌門數(shù)量增加，擬桿菌門和變形桿菌門數(shù)量減少，微生物多樣性增加［44-45］。動物模型研究證實，暴露于香煙煙霧后，小鼠腸道中SCFA水平顯著降低，雙歧桿菌、乳桿菌、瘤胃球菌（Ruminococcus）和分段絲狀桿菌（Segmental filamentous bacilli，SFB）數(shù)量減少［46-47］。

如前所述，吸煙是COPD發(fā)病的主要危險因素，吸煙患者下呼吸道菌群發(fā)生紊亂，其核心菌門的變化與患者腸道菌群變化方向一致。表明吸煙引起COPD發(fā)生風(fēng)險的增高與香煙煙霧導(dǎo)致腸道菌群紊亂密切相關(guān)。由于目前缺乏吸煙對COPD呼吸道及腸道菌群的大規(guī)模對照研究，下呼吸道與腸道菌群改變的先后次序尚難確定。

4.2 飲食的影響

飲食結(jié)構(gòu)在調(diào)節(jié)和維持機體腸道菌群穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。食物的類型塑造了腸道菌群的組成及豐度，影響宿主與微生物的相互作用［48］。富含水果、豆類纖維、碳水化合物的高膳食飲食，可增加腸道菌群多樣性及普氏菌屬的豐度，降低擬桿菌屬的豐度，膳食纖維還可被腸道菌群發(fā)酵產(chǎn)生SCFA，對腸道及全身的免疫起正性調(diào)節(jié)作用［37］；相反，高脂肪、高蛋白質(zhì)、高糖的低纖維膳食可降低腸道菌群的多樣性，減少厚壁菌門，增加變形菌門及擬桿菌門的豐度［49］。

Shaheen等［50］在研究了2 800余人飲食模式與肺功能關(guān)系后發(fā)現(xiàn)，長期高膳食纖維飲食（水果、蔬菜、全麥谷物）與1 s用力呼氣容積/用力肺活量（forced expiratory volume in one second/forced vital capacity，F(xiàn)EV1/FVC）及1 s用力呼氣容積占預(yù)計值之比（FEV1% pred）呈正相關(guān)，對預(yù)防肺功能受損和COPD發(fā)生發(fā)展，尤其對男性吸煙者的肺功能保護有積極意義。Szmidt等［51］研究表明，≥26.5 g/d的高膳食纖維、≥16.3 g/d的富含谷類食物及≥7.6 g/d水果纖維的攝入可使COPD發(fā)生風(fēng)險減少30%。

顯然，增加膳食纖維，減少脂肪、糖類的攝入可以改善腸道菌群紊亂，增加有益腸道菌群豐度及SCFA的產(chǎn)生，從而有利于調(diào)節(jié)遠處器官-呼吸系統(tǒng)的免疫功能，降低COPD的發(fā)生率、減少肺功能受損的機率。

4.3 益生菌的影響

“益生菌”概念首見于1960年，目前得到廣泛應(yīng)用的包括雙歧桿菌和乳酸桿菌。益生菌可耐受胃酸及膽汁，通過在腸道上皮細胞的附著，參與腸道菌群的穩(wěn)定調(diào)控。益生菌起初主要用于治療抗生素性相關(guān)性的腸道菌群紊亂，后來研究者發(fā)現(xiàn)它對克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激惹綜合征等腸道疾病中也能發(fā)揮明顯效應(yīng)［52］。

近年來越來越多的研究表明，益生菌在治療COPD的急性加重過程中能起到積極作用。文獻報道在COPD模型上觀察到，鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）及雙歧桿菌可顯著降低中性粒細胞和巨噬細胞向炎性組織遷移，減輕肺組織的病理損傷，從而降低炎癥因子的產(chǎn)生及肺組織的結(jié)構(gòu)重塑［53-55］。另有研究發(fā)現(xiàn)，口服乳酸桿菌或雙歧桿菌能誘導(dǎo)肺組織中抗炎因子mRNA的表達上調(diào)，增加血清中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的總數(shù)和百分率［56-57］。

5 COPD肺部免疫與腸道菌群的關(guān)系

COPD的發(fā)生與Treg/TH17細胞免疫失衡相關(guān)，白介素-10（interleukin-10，IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等細胞因子可促進Foxp3表達，誘導(dǎo)CD4+T細胞向Treg細胞分化，使之成為CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞，抑制免疫反應(yīng)；另一方面，白介素-6（interleukin-6，IL-6）則可完全抑制TGF-β誘導(dǎo)的Foxp3+Treg細胞的生成，誘導(dǎo)CD4+T細胞向Th17細胞分化及IL-17分泌，增加中性粒細胞、巨噬細胞的招募，從而促進氣道黏液分泌，引起氣道高反應(yīng)［58-60］。腸道作為人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，參與腸道自身及遠處器官免疫功能的調(diào)節(jié)，而腸相關(guān)淋巴組織（gut-associated lymphoid tissue，GALT）在維持肺部免疫調(diào)節(jié)功能方面起著重要作用。GALT分為上皮層和固有層，固有層分泌T細胞，腸道菌群在CD8+T細胞向CD4+T細胞轉(zhuǎn)化以及維持健康狀態(tài)的腸固有層Th17/TregT穩(wěn)態(tài)扮演著重要角色［61-63］。研究發(fā)現(xiàn)，香煙煙霧暴露可促進與Th17細胞分化相關(guān)的趨化因子表達上調(diào)，而腸道益生菌既能下調(diào)Th17的免疫反應(yīng)能力，又能通過SCFA的增加來提高Treg細胞的數(shù)量及功能，從而在抑制COPD的炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮特有效應(yīng)［39，64-65］。此外，GALT上皮層細胞含有Toll樣受體（toll like receptor，TLR）及核苷酸結(jié)合寡結(jié)構(gòu)域蛋白2（nucleotide binding oligo domain protein 2，NOD2）等模式識別受體（pattern recognition receptoers，PRR），TLR在固有免疫中起著至關(guān)重要的作用。業(yè)已證實益生菌含有TLR配體，參與固有免疫系統(tǒng)的激活，補充益生菌可增強機體固有免疫能力，從而對呼吸道感染發(fā)揮抑制效應(yīng)［61，66-68］。

6 總結(jié)

綜上所述，COPD患者呼吸道及腸道菌群多樣性下降，有益菌群減少，致病性變形菌門增多；香煙煙霧暴露影響了肺部免疫，降低呼吸道、腸道菌群多樣性及有益菌群豐度，抑制SCFA的產(chǎn)生；減少香煙煙霧暴露可減少COPD發(fā)病，改善預(yù)后。高膳食纖維飲食及腸道益生菌制劑（如乳桿菌、雙歧桿菌）有利于促進宿主免疫反應(yīng)提高，在抑制呼吸道感染、減輕COPD炎癥方面發(fā)揮積極效應(yīng)。隨著分子檢測技術(shù)的不斷成熟和生物信息學(xué)手段的日臻完善，有關(guān)COPD菌群特征的相關(guān)研究將會越來越深入。減少COPD患者下呼吸道“關(guān)鍵物種”病原菌、增加膳食纖維及腸道益生菌的攝入有利于改善呼吸系統(tǒng)免疫功能，這已成為一個新興的臨床研究視角，必將為COPD的治療帶來新的思路。