作物基因克隆技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展

劉雨菲

(西南大學(xué)，重慶 400700）

基因克隆技術(shù)是19世紀(jì)70年代初開始發(fā)展起來的一項(xiàng)研究技術(shù)。它是研究某一特定基因的表達(dá)和功能研究的第一步?；蚩寺〖夹g(shù)的發(fā)展為作物研究提供了新的技術(shù)方法和研究方向。研究人員利用作物基因克隆技術(shù)，通過改變基因型實(shí)現(xiàn)了農(nóng)作物產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性等多種性狀的改良，顯著提高了農(nóng)作物的質(zhì)量。隨著基因克隆技術(shù)的不斷發(fā)展并投入實(shí)踐應(yīng)用，關(guān)于基因克隆的技術(shù)研究也在不斷改進(jìn)。目前幾乎作物研究的每個(gè)領(lǐng)域，都有基因克隆技術(shù)的身影。

作物基因的克隆技術(shù)是作物育種研究的重要組成部分。主要內(nèi)容是鑒別分離突變體特異基因并得到完整的基因序列種，進(jìn)行基因定位，篩選有利性狀，最后應(yīng)用到作物生產(chǎn)實(shí)踐中。作物基因克隆技術(shù)通常分為兩種。相對(duì)比較傳統(tǒng)的研究途徑的是正向遺傳學(xué)方式。反向遺傳學(xué)途徑是新型研究方法，它是先獲得遺傳基因片段，反向研究基因。本文主要從幾種基因克隆技術(shù)的角度出發(fā)，來介紹作物基因克隆技術(shù)的研究進(jìn)展，并展望了作物基因克隆技術(shù)的發(fā)展前景。

1.常用傳統(tǒng)基因克隆技術(shù)

1.1 功能克隆

功能克隆是出現(xiàn)最早的基因克隆技術(shù)之一。它主要通過研究表達(dá)的異常蛋白質(zhì)，在已知遺傳損傷所引起的蛋白質(zhì)缺陷信息的情況下，進(jìn)行基因定位并克隆。步驟的關(guān)鍵是先已知蛋白質(zhì)，再將其的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cRNA，然后作為探針，從而從基因組中克隆到所需基因。

更有趣的是，當(dāng)獲得某一個(gè)植株的相似基因，且核苷酸序列高度保守時(shí)，也可以通過利用這些已知基因片段，去篩選未知基因庫，從而分離出未知新基因。周兆斕等利用Kond等克隆和測(cè)序編碼了水稻巰基蛋白酶抑制劑的基因組，之后將其導(dǎo)入甘薯、馬鈴薯、茄子等多個(gè)作物，極大地改善了作物的抗蟲能力。

功能克隆是人們?cè)诳寺☆I(lǐng)域摸索出第一種最基本的克隆方法，它在作物基因克隆的研究中有重要地位。功能克隆是簡(jiǎn)單實(shí)用的方法，但是它需要已知基因信息才能進(jìn)行克隆，因此最初應(yīng)用功能克隆方法的時(shí)候，具有很大的局限性。

1.2 定位克隆

定位克隆又叫圖位克隆，是人們研究出的可以克服基因編碼序列未知對(duì)功能克隆限制性的一種克隆方法。定位克隆的主要方法是根據(jù)目標(biāo)基因在染色體上的表達(dá)位置進(jìn)行基因分離，即通過分子標(biāo)記技術(shù)將基因在染色體精確定位，構(gòu)建相關(guān)基因組文庫，利用探針篩選獲得目的基因。

定位克隆在作物基因研究領(lǐng)域中應(yīng)用很多，其中以研究抗病基因?yàn)橹鳌Ｔ缭?1世紀(jì)初，定位克隆就應(yīng)用在玉米莖基腐病抗性基因的研究中。2016年，黃雅敏等人在水稻葉片早衰的研究中對(duì)突變體psls1的進(jìn)行定位并克隆。

當(dāng)編碼序列不清楚的情況下無法進(jìn)行功能克隆時(shí)，定位基因克隆技術(shù)的優(yōu)勢(shì)就十分明顯。但定位克隆主要適用于基因組小的作物，像玉米、小麥這一類基因組大且構(gòu)建圖譜復(fù)雜的作物如，果采用這種方法會(huì)困難很多。但近年來隨著基因組學(xué)的發(fā)展，大多數(shù)作物的基因研究已經(jīng)非常深入，定位克隆也有新的發(fā)展。

1.3 表型克隆

有些作物的遺傳機(jī)理復(fù)雜，很難分析它的基因產(chǎn)物，進(jìn)行分離定位鑒定也十分煩瑣困難，但其在表型上有明顯差異。在多次嘗試以后，1995年首次有人提出了表型克隆。它主要是利用作物表型的差異來克隆作物基因。

目前人們已通過表型克隆的方法篩選出了多個(gè)作物的目的基因，如近年來水稻中得到的短根突變體ksr8和溫度敏感型黃葉突變體yl2(t)等。

表型克隆是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ募夹g(shù)方法，它利用的是連鎖作圖的方法，但與定位克隆不同的是，表型克隆不需要通過遺傳標(biāo)記進(jìn)行定位分析，更省時(shí)省力，大大提高了基因克隆速度。但是，表型克隆每次試驗(yàn)分離鑒別一部分基因片段，可能對(duì)于其他區(qū)域序列的敏感性會(huì)有所差異。

2.新型基因克隆技術(shù)

2.1 DNA芯片技術(shù)

DNA芯片技術(shù)又稱生物芯片技術(shù)，它是由核酸片段如以特定熒光標(biāo)記的不同的寡核苷酸探針，與游離靶序列雜交，或生物集成膜片上的固定的不同靶分子與游離的探針雜交，然后進(jìn)行雜交信號(hào)的檢測(cè)。

這項(xiàng)技術(shù)在作物中主要用于基因表達(dá)的研究。DNA芯片技術(shù)可有助于更了解生物在不同階段和生理狀態(tài)下的表達(dá)基因，更好地研究作物生長(zhǎng)發(fā)育和病變過程基因表達(dá)的內(nèi)在機(jī)制。2014年，陳建省等人利用該技術(shù)與傳統(tǒng)分子標(biāo)記結(jié)合，構(gòu)建小麥遺傳圖譜以及QTL定位分析。2019年，賀超等人在基于基因芯片的研究中，進(jìn)行了水稻胚乳發(fā)育相關(guān)基因生物信息學(xué)分析。

DNA芯片技術(shù)的出現(xiàn)是基因克隆研究史的一個(gè)重要節(jié)點(diǎn)。它有很多優(yōu)點(diǎn)，如檢測(cè)速度快、效率高、適用范圍廣、容量大。近些年各學(xué)科交叉融合發(fā)展，隨著未來技術(shù)的提高，DNA芯片技術(shù)在作物基因研究領(lǐng)域會(huì)有更多重要的應(yīng)用。

2.2 PCR擴(kuò)增技術(shù)

PCR擴(kuò)增技術(shù)的前提是已知克隆基因的基因序列。已知作物基因序列以后，根據(jù)已知基因的序列設(shè)計(jì)并合成引物，當(dāng)克隆該基因時(shí)可先提取相關(guān)基因序列，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增的基因片段進(jìn)行純化再連接到適宜的載體上。

目前PCR技術(shù)在作物基因克隆方面已經(jīng)得到大量應(yīng)用。2015年，姜婷等利用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)脅迫下玉米內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行了篩選驗(yàn)證。2021年陳璨等在研究Acc1內(nèi)參系統(tǒng)穩(wěn)定性時(shí)也利用了此方法。

PCR擴(kuò)增技術(shù)操作簡(jiǎn)單，高效經(jīng)濟(jì)且準(zhǔn)確可靠，特別是在作物抗病性基因檢測(cè)分析和定位和轉(zhuǎn)基因植物鑒定方面有重要意義。

2.3 同源序列克隆

同源序列克隆是通過設(shè)計(jì)引物利用被克隆基因編碼序列同源性完成基因克隆。它克服了傳統(tǒng)克隆耗時(shí)耗力的問題，在作物基因克隆技術(shù)的應(yīng)用中具備一定的優(yōu)越性。

同源序列克隆方法在水稻、馬鈴薯、番茄、小麥等作物中已經(jīng)有了較多應(yīng)用，特別是野生稻的研究。2004年，楊明摯在野生稻中克隆了抗稻瘟病基因。2009年，崔玲玲通過LA-PCR擴(kuò)增技術(shù)克隆了白葉枯病抗病基因RPS2。2014年，徐靖等通過T/A克隆技術(shù)，獲得了與抗病基因STK類相似的序列。2021年，陳立杰等人在對(duì)水稻OsUCH-L5基因試驗(yàn)中也應(yīng)用了該方法。

在同源序列克隆實(shí)際應(yīng)用時(shí)需要注意如何確定獲得是真正的目的基因。這就需要考慮克隆中PCR的檢測(cè)時(shí)引物的設(shè)計(jì)以及對(duì)獲得的RGA后續(xù)的檢驗(yàn)，進(jìn)而作出正確判斷。同時(shí)，在之后的研究中，也要更多地運(yùn)用現(xiàn)代新的分子生物技術(shù)來協(xié)助，使同源基因克隆的方法更加優(yōu)化，效率進(jìn)一步提高。

3.結(jié)語

基因克隆技術(shù)已經(jīng)發(fā)展了數(shù)十年，本文中出現(xiàn)的只是其中的一部分，相同的是，它們?cè)谧魑镅芯堪ㄗ魑锊±韺W(xué)研究、作物基因表達(dá)研究等領(lǐng)域中都起到了巨大的作用，為作物育種提供了寶貴的基因資源，它們中的許多方法技術(shù)都已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用，發(fā)展?jié)撃苁蔷薮蟮摹?/p>

展望未來，作物基因克隆技術(shù)的發(fā)展與創(chuàng)新是多方面的。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，對(duì)于作物功能基因的研究越來越定量化、綜合化。將對(duì)單個(gè)基因的調(diào)控研究上升到許多基因的綜合調(diào)控，可以更好地發(fā)展利用功能基因改良作物性狀相關(guān)研究。作物陸續(xù)完成全基因組測(cè)序，這對(duì)作物遺傳改良的研究是十分有利的。作物基因研究?jī)H僅靠之前的人為操作是不行的，未來的作物基因克隆技術(shù)研究將越來越多地通過計(jì)算機(jī)等現(xiàn)代電子技術(shù)，在基因研究方面實(shí)現(xiàn)突破。隨著基因研究的進(jìn)步，加速基因克隆策略將會(huì)大量應(yīng)用到未來的研究中。

作物基因克隆技術(shù)對(duì)于作物研究是至關(guān)重要的，未來應(yīng)始終尋求作物基因克隆技術(shù)在作物基因克隆研究領(lǐng)域有更好的發(fā)展，在作物性狀改良方面有更大的突破。