抗根腫病甘藍(lán)型油菜新品種華油雜62R的選育

李 倩 Nadil Shah 周元委 侯照科 龔建芳 劉 玨 尚政偉 張 磊 戰(zhàn)宗祥 常海濱 傅廷棟 樸鐘云 張椿雨,*

1 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 湖北武漢 430070; 2 宜昌市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 湖北宜昌 443000; 3 德宏傣族景頗族自治州農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心, 云南德宏 678400; 4 黃岡市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 湖北黃岡 438000; 5 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院, 遼寧沈陽 110000

根腫病是由蕓薹根腫菌(Plamodiophora brassicaeWoron)侵染引起的一種世界性土傳病害。該病原菌專性侵染十字花科植物, 包括油菜、大白菜、小白菜、甘藍(lán)、蘿卜、花椰菜、芥菜等在內(nèi)的多種栽培和野生種[1]。被該病原菌侵染后, 植物根系細(xì)胞經(jīng)過非正常擴(kuò)增和分裂, 從而產(chǎn)生腫瘤, 導(dǎo)致營養(yǎng)與水分的吸收被限制, 地上部分植株發(fā)黃并枯萎, 生長(zhǎng)發(fā)育不良, 作物產(chǎn)量和品質(zhì)均受到嚴(yán)重影響。根腫菌休眠孢子在土壤中存活時(shí)間長(zhǎng)(可長(zhǎng)達(dá) 15年以上), 其傳染性強(qiáng)、傳播途徑廣、傳播速度快、防治難度大[2-4]。十字花科油菜是我國最重要的油料作物,長(zhǎng)江流域常年種植面積約 667萬公頃, 所產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菜籽油占國產(chǎn)植物油的 50%以上。近年, 我國油菜生產(chǎn)受根腫病影響較大, 據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)發(fā)病面積約在66.7萬公頃(約占總種植面積的10%), 并且隨著機(jī)械化程度的不斷提高, 油菜根腫病在我國有大面積爆發(fā)的趨勢(shì), 特別是我國所有甘藍(lán)型油菜品種均不抗根腫病, 因此油菜產(chǎn)業(yè)面臨嚴(yán)重威脅。

已有研究表明, 選育并種植抗病品種是防治根腫病最經(jīng)濟(jì)、最有效的途徑。目前應(yīng)用最廣泛的根腫病抗源材料主要為歐洲飼用蕪菁(Brassica rapassp.rapifera, AA, 2n=20), 包括‘ECD01-04’、‘Gelria R’、‘Siloga’、‘Debra’以及‘Milan White’等[5-6]。日韓等國研究人員以蕪菁為抗源材料, 培育出一些抗根腫病的大白菜品種。進(jìn)一步在白菜中QTL定位了多個(gè)抗病位點(diǎn), 主要包括Crr1、Crr2、Crr3、Crr4、CRa、CRb、CRc、CRk等[7-9], 這些位點(diǎn)分布在不同的染色體上。目前已成功分離克隆的位點(diǎn)有CRa與Crr1a, 這 2個(gè)基因均編碼 TIR-NB-LRR結(jié)構(gòu)蛋白,能夠識(shí)別病原菌并引起植物的免疫反應(yīng)[10-11]。CRa與CRb均定位于 A03染色體, 物理位置緊密連鎖,最新研究認(rèn)為CRa和CRb是同一個(gè)抗病位點(diǎn)[12]。

由于國外油菜根腫病發(fā)生較早, 在抗病育種方面也率先取得了一些進(jìn)展。Diederichsen等[13]利用抗病蕪菁和抗病甘藍(lán)材料進(jìn)行種間雜交, 人工合成了抗病甘藍(lán)型油菜品種 Mendel, 經(jīng)室內(nèi)和田間抗病性鑒定均表現(xiàn)抗病, 并發(fā)現(xiàn)該抗性至少由 2個(gè)不連鎖的顯性基因控制。加拿大在油菜抗根腫病育種方面也開展了一些工作, 培育出了油菜抗病新品種[14]。我國油菜抗根腫病的育種工作起步較晚, 主要集中在對(duì)現(xiàn)有主栽品種或資源材料的抗病性篩選方面[15-18],而利用蕪菁等高抗資源材料改良我國油菜品種的工作還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室戰(zhàn)宗祥博士等人以含多個(gè)抗病位點(diǎn)的蕪菁ECD04為父本與優(yōu)良甘藍(lán)型油菜常規(guī)品種華雙 5號(hào)雜交, 結(jié)合回交育種策略及分子標(biāo)記輔助選擇手段, 成功將 ECD04中的抗病位點(diǎn)PbBa8.1轉(zhuǎn)育到優(yōu)良油菜常規(guī)品種華雙5號(hào)中, 育成了我國首個(gè)抗根腫病甘藍(lán)型油菜常規(guī)新品系[19]。

本研究以含有CRb抗病位點(diǎn), 對(duì)多種生理小種(2、4、7、10號(hào))均具較好抗性的大白菜 CR Shinki為供體父本, 與國審甘藍(lán)型油菜優(yōu)良雜交種華油雜62的波里馬恢復(fù)系Bing409為母本, 通過雜交、回交以及分子標(biāo)記輔助選擇和抗病性鑒定等策略, 將CRb抗病位點(diǎn)精準(zhǔn)導(dǎo)入到Bing409中, 創(chuàng)建了抗根腫病的新恢復(fù)系 Bing409R, 并在此基礎(chǔ)上配制了抗根腫病雜交油菜新品種華油雜 62R, 為抵抗油菜根腫病, 穩(wěn)定和保障我國油菜產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展提供有力保障。

1 材料與方法

1.1 材料

供體親本(父本)為含有CRb位點(diǎn)(位于 A03染色體)的抗根腫病大白菜材料 CR Shinki (AA,2n=20), 根據(jù)威廉姆斯寄主鑒別系統(tǒng)鑒定結(jié)果, 該位點(diǎn)對(duì)根腫菌2號(hào)、4號(hào)、7號(hào)和10號(hào)生理小種具有優(yōu)異抗性; 感病輪回親本(母本)為波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育(Pol.CMS)三系雜交種華油雜62 (國審)的恢復(fù)系Bing409, 同時(shí)在本研究作為感病對(duì)照材料。

1.2 方法

1.2.1 技術(shù)路線 親本材料于2013年10月種植于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)日光溫室, 2014年2月完成授粉獲得F1, 并利用4號(hào)生理小種進(jìn)行室內(nèi)接菌鑒定。2014年5月于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)播種, 8月完成F1代植物的回交, 10月獲得含有492株單株的BC1群體。為加快育種進(jìn)程, 從 BC1代開始, 利用與抗病位點(diǎn)CRb緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行前景選擇篩選含有CRb位點(diǎn)的單株, 淘汰無CRb的植株; 再利用均勻覆蓋甘藍(lán)型油菜A基因組的123個(gè)多態(tài)性標(biāo)記(附表1), 對(duì)含CRb抗病前景位點(diǎn)的植株進(jìn)行遺傳背景篩選, 保留背景回復(fù)率高的植株。經(jīng)過3次回交1次自交后, 于2016年春獲得CRb位點(diǎn)純合、背景恢復(fù)率在95%以上的抗病植株, 命名為Bing409R。2016年夏繁, 利用華油雜62的不育系與Bing409R配制了抗病新組合(命名為華油雜62R), 于2016年秋將Bing409R和華油雜 62R種植在不同病區(qū)(枝江、黃山等)進(jìn)行田間抗病性鑒定。技術(shù)路線如圖1所示。

1.2.2 根腫病溫室接種體系 溫室接種采用菌土法接種。取出-20℃保存的油菜病根, 室溫下解凍稱量并用勻漿機(jī)磨碎, 與風(fēng)干的草炭土按照 1∶20的比例混勻, 25℃密封保存48 h以上[20]。將培養(yǎng)土裝到 50孔穴盤中并灌足底水, 少量菌土放到穴盤中后, 在菌土上播種1～2粒種子, 25℃培養(yǎng), 6周后進(jìn)行表型鑒定并分級(jí)。0級(jí)為沒有根瘤, 1級(jí)在側(cè)根處有小根瘤, 2級(jí)在主根側(cè)根處有較小根瘤, 3級(jí)在主根側(cè)根有較大根瘤, 4級(jí)在主根側(cè)根有較大的明顯根瘤[21]。

1.2.3 根腫病田間接種及表型鑒定 田間表型鑒定通過選取近幾年發(fā)病嚴(yán)重且相對(duì)比較均一的田塊為病圃, 直接分成不同的小區(qū)進(jìn)行直播, 一般在 9月下旬播種, 并于6～10周后或在感病對(duì)照組有明顯受害表型時(shí)開始進(jìn)行表型鑒定, 發(fā)病等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)與室內(nèi)接種相同。

1.2.4 病情指數(shù) 病株率(%) = 發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100; 病情指數(shù) = ∑(病株數(shù)×相應(yīng)病害級(jí)別)/(調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)別) × 100。校正系數(shù)K= 50/對(duì)照品種的實(shí)際病情指數(shù); 相對(duì)病情指數(shù) =K×鑒定材料的病情指數(shù)。品種資源的抗病性差異根據(jù)相對(duì)病情指數(shù)進(jìn)行分類: 免疫(I) = 0; 0<高抗 HR≤5;5<抗 R≤10; 10<中抗 MR≤20; 20<中感 MS≤30;30<感病 S≤50; 50<高感HS≤100[21]。

1.2.5 DNA提取及 PCR程序 利用改良 CTAB法提取親本和各世代單株幼嫩葉片DNA, 10 μL的PCR的反應(yīng)體系, 包含2 ng的DNA模板、正向反向引物各 250 nmol L-1、0.25 nmol L-1dNTP、1 μLTaq酶。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min; 94℃ 1 min, 55℃ 30 s, 72℃ 1 min, 35個(gè)循環(huán); 72℃ 10 min;10℃ 保存。PCR產(chǎn)物在6%的變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳, 結(jié)束后進(jìn)行銀染、顯影。

1.2.6 前景選擇 用于CRb抗病位點(diǎn)前景選擇的標(biāo)記由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)樸鐘云教授課題組提供或本實(shí)驗(yàn)室開發(fā), Pol.CMS恢復(fù)基因前景選擇標(biāo)記由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)易斌教授提供。經(jīng)過兩親本間多態(tài)性檢測(cè),選擇具有多態(tài)性的分子標(biāo)記進(jìn)行前景選擇(表1), 其中 CRb_ssr541、CRb_ssr01和 CRb_ssr413是位于CRb抗病位點(diǎn)兩側(cè)的連鎖標(biāo)記, Rfp_ssr52和Rfp_rt5標(biāo)記分別是與甘藍(lán)型油菜Pol.CMS恢復(fù)基因Rfp的連鎖的分子標(biāo)記和功能標(biāo)記[22]。需要說明的是, 每一代回交分離群體中含有前景抗病位點(diǎn)CRb的個(gè)體,其恢復(fù)基因Rfp都需要進(jìn)行標(biāo)記選擇, 保留同時(shí)具有CRb及Rfp的個(gè)體, 繼續(xù)進(jìn)行遺傳背景篩選, 故本文將Rfp位點(diǎn)的篩選歸在前景選擇中。

表1 CRb抗病位點(diǎn)及Rfp恢復(fù)基因連鎖標(biāo)記Table 1 Linkage markers of CRb resistant locus and Pol.CMS restore gene Rfp

1.2.7 背景選擇 在親本材料 Bing409與 CR Shinki中篩選出了 225對(duì)多態(tài)性標(biāo)記, 通過本地BLAST, 篩選得到物理位置均勻分布于油菜A基因組的124對(duì)標(biāo)記, 且相鄰標(biāo)記間平均物理距離2 Mb左右, 用于回交群體背景回復(fù)率鑒定(表2, 附表1)。

遺傳背景回復(fù)率 = 基因型恢復(fù)到輪回親本背景的標(biāo)記數(shù)/總共標(biāo)記數(shù)。

表2 均勻覆蓋甘藍(lán)型油菜A基因組的標(biāo)記統(tǒng)計(jì)Table 2 Uniformly covered markers on genome A of B. napus

1.2.8 農(nóng)藝性狀測(cè)定與測(cè)驗(yàn) 2017—2018年度,在黃岡市農(nóng)業(yè)科學(xué)院梅家墩試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)(非根腫病發(fā)病區(qū))進(jìn)行油菜品種產(chǎn)量及主要農(nóng)藝性狀分析試驗(yàn)。供試品種為根腫病抗病品種華油雜62R, 對(duì)照品種為長(zhǎng)江中游優(yōu)異品種華油雜12, 每個(gè)品種各種植3個(gè)重復(fù), 小區(qū)面積20 m2?？疾斓闹饕a(chǎn)量性狀包括株高、有效分枝數(shù)、單株有效角果、每角粒數(shù)、千粒重及單株產(chǎn)量等, 每一性狀每個(gè)重復(fù)調(diào)查植株15株,最后實(shí)測(cè)小區(qū)產(chǎn)量。采用近紅外分析儀檢測(cè)的方法測(cè)定含油量、芥酸及硫苷含量等油菜品質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 F1及BC1的獲得、分子標(biāo)記檢測(cè)及抗病性鑒定

以國審甘藍(lán)型油菜雜交種華油雜 62的 Pol.CMS恢復(fù)系 Bing409為母本與含CRb抗病位點(diǎn)的CR shinki為父本, 雜交獲得F1, 以Bing409為輪回親本回交獲得了 BC1代材料。先后對(duì) F1、BC1及兩親本以根腫菌 4號(hào)生理小種在溫室進(jìn)行接種鑒定,接種40 d后調(diào)查上述材料的根部受侵染情況, 不同發(fā)病等級(jí)株數(shù)統(tǒng)計(jì)見附表2。

對(duì)F1表型鑒定發(fā)現(xiàn), F1對(duì)4號(hào)生理小種表現(xiàn)出100%抗病, 病情指數(shù)為0, 與抗病父本CR shinki表型一致, 而輪回親本材料 Bing409則表現(xiàn)出極度感病, 發(fā)病指數(shù)高達(dá)93.6% (圖2-a, b)。表明CR shinki中所含的CRb抗病位點(diǎn)對(duì)根腫菌4號(hào)生理小種表現(xiàn)為顯性抗病。

對(duì) BC1群體各單株的表型鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn), 發(fā)病等級(jí)呈現(xiàn)出兩極分布, 分別為抗病(0級(jí), 24株)以及感病(4級(jí), 19株)(圖2-c, d)?？ǚ綔y(cè)驗(yàn)結(jié)果顯示, BC1群體抗病、感病分離比符合 1∶1分離(N=43, χ2=0.58 < χ20.05(1)= 3.84), 符合理論預(yù)期。用連鎖標(biāo)記CRb_ssr413(表 1)對(duì)以上植株進(jìn)行基因型鑒定(圖 2-e),其中 A、H、B分別代表 Bing409基因型、雜合基因型、抗病CR Shinki基因型。表明BC1群體中所有感病植株的基因型均為 A, 抗病植株基因型均為H, 基因型鑒定結(jié)果與表型一致。F1及BC1代群體分子鑒定和接種鑒定的結(jié)果都表明,CRb抗病位點(diǎn)對(duì)我國油菜疫區(qū)的 4號(hào)優(yōu)勢(shì)生理小種為顯性抗病遺傳。

2.2 利用分子標(biāo)記對(duì) BC1F1～BC3F1各世代株系的前景和背景篩選

利用與抗病位點(diǎn)連鎖標(biāo)記, 對(duì) BC1F1～BC3F1群體進(jìn)行前景選擇, 篩選出含CRb抗病位點(diǎn)的植株,然后利用附表 1中所列的分子標(biāo)記對(duì)這些單株進(jìn)行遺傳背景分析, 根據(jù)每一個(gè)標(biāo)記基因型計(jì)算并統(tǒng)計(jì)遺傳背景回復(fù)率, 每一代保留遺傳背景回復(fù)率較高的株系繼續(xù)進(jìn)行回交。圖3是BC1F1～BC3F1代含抗病位點(diǎn)的入選株系的遺傳背景回復(fù)率從低到高排列的柱形圖。本試驗(yàn)中 BC1群體背景回復(fù)率在0.29～0.71之間, 均值為 0.49, 低于 BC1群體的理論恢復(fù)率 75%。BC2F1入選單株背景回復(fù)率在0.73～0.93 之間, BC3F1在 0.87～0.97之間。

表3列出了BC1～BC3代各群體單株數(shù)、含CRb位點(diǎn)的株數(shù)及最后保留的較高遺傳背景的單株數(shù)。BC1選擇輪回親本基因組回復(fù)率>60%的5個(gè)單株編號(hào)分別為 438A、65B、128C、464D、94E, 繼續(xù)進(jìn)行下一代回交。由 438A回交群體(含 46株)、65B回交群體(含68株)、128C回交群體(含118株)組成的 BC2群體共 232株, 經(jīng)過前景和背景篩選獲得了含有CRb位點(diǎn)、輪回親本基因組回復(fù)率>90%的 4個(gè)株系, 編號(hào)分別為438A1、65B1、65B2和65B3, 各自對(duì)應(yīng)的背景回復(fù)率分別為92%、92%、91%和91%。其中, 編號(hào)464D和94E的回交后代只進(jìn)行了抗病位點(diǎn)前景選擇, 未進(jìn)行背景篩選。438A1、65B1、65B2和65B3這4個(gè)株系繼續(xù)回交, 獲得了BC3后代總共267株, 經(jīng)過同樣的篩選, 獲得含CRb位點(diǎn)、輪回親本基因組背景回復(fù)率高達(dá) 97%的 2個(gè)單株, 分別為438A1-1和65B2-2。

2.3 高世代當(dāng)選株系抗病性鑒定、分子標(biāo)記分析及主要品質(zhì)性狀檢測(cè)

2.3.1 高世代分離群體抗病性鑒定及恢復(fù)基因的分子檢測(cè) 本研究在對(duì) BC3F1回交后代進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)之前, 隨機(jī)抽取了編號(hào)為65B2的BC3F1回交后代用4號(hào)生理小種進(jìn)行了接種鑒定?？共⌒澡b定結(jié)果顯示, BC3F1分離群體中含CRb雜合抗病位點(diǎn)的(H基因型)材料對(duì) 4號(hào)生理小種表現(xiàn)出免疫抗病性(R, 24株), 不含CRb位點(diǎn)的材料(A基因型)的均為感病表型(S, 19株), 抗感基因型與表型相對(duì)應(yīng)(圖4-a, b, c), BC3F1抗感表型分離比符合1∶1分離(N=43, χ2= 0.58 < χ20.05(1)= 3.84), 這一結(jié)果與 BC1群體的鑒定結(jié)果相吻合。由此可見, 該連鎖標(biāo)記能夠準(zhǔn)確鑒定抗病位點(diǎn), 不用每一代都進(jìn)行抗病性鑒定,以有效節(jié)省時(shí)間。

隨后, 利用與波里馬恢復(fù)基因連鎖標(biāo)記Rfp-ssr52[22], 對(duì)65B2的BC3F1回交后代中分離出的部分抗病單株(30株)的基因型進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖4-d所示, 這些單株的基因型均與輪回親本Bing409的基因型一致(A)。最后將經(jīng)過抗病性鑒定及恢復(fù)基因位點(diǎn)鑒定、遺傳背景回復(fù)率高的抗病單株65B2-2經(jīng)自交獲得了純合抗病株系, 并正式命名為Bing409R。

表3 BC1～BC3各世代前景及背景選擇概況Table 3 Detail of foreground and background selection in BC1 to BC3

2.3.2 抗病近等基因系材料 Bing409R對(duì)不同生理小種的抗性評(píng)價(jià) 本研究在選育 Bing409R的過程中, 主要選取了根腫菌 4號(hào)生理小種進(jìn)行抗性鑒定, 為了增加結(jié)果的可靠性, 還選取了我國油菜根腫病發(fā)病較為嚴(yán)重地區(qū)的根腫菌, 包括云南、四川、湖北、安徽等省, 對(duì)Bing409R進(jìn)行接菌鑒定。接種我國不同地區(qū)根腫菌株數(shù)統(tǒng)計(jì)見附表 3, 表型調(diào)查結(jié)果見表4。Bing409R對(duì)湖北宜昌和枝江、安徽黃山以及四川省不同地區(qū)的根腫菌均表現(xiàn)出免疫抗性(I); 對(duì)云南不同地區(qū)根腫菌的抗性存在較大差異,分別表現(xiàn)為免疫抗性(I)、抗(R)、中抗(MR)、中感(MS)和高感(HS)等表型; 對(duì)湖北恩施巴東的根腫菌表現(xiàn)為高感(HS)。說明我國根腫病生理小種的類型是多樣的, 四川地區(qū)根腫菌生理小種比較單一, 而云南地區(qū)生理小種種類復(fù)雜多樣。這一結(jié)果的獲得可為抗病品種的合理應(yīng)用提供重要依據(jù)。

2.3.3 Bing409R不同株系的籽粒品質(zhì)檢測(cè) 隨機(jī)選取65B2-2自交后代衍生出的BC3F2純合抗病株系自交種子(共9個(gè)系, 編號(hào)分別為622-22、622-37、622-30、624-04、625-17、630-11、18ZP06、18ZP07和18ZP08), 利用近紅外分析儀進(jìn)行品質(zhì)檢測(cè)。由表5可知, 所有被檢測(cè)株系含油量均與未改良的輪回親本Bing409 (409S01、409S02和409S03為Bing409不同株系的3個(gè)重復(fù))相當(dāng), 芥酸及硫苷含量都符合我國“雙低油菜”的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 華油雜62R的田間根腫病抗性鑒定

表4 Bing409R抗病材料對(duì)我國不同地區(qū)根腫菌的抗性評(píng)價(jià)Table 4 Evaluation of resistance of Bing409R to P. brassica in different regions of China

表5 BC3F3不同抗病株系品質(zhì)測(cè)定Table 5 Seeds quality determination of different resistant lines derived from BC3F3 generation

2016年夏, 將華油雜62的不育系與Bing409R配制了雜交組合, 正式命名為華油雜62R。收獲的華油雜62R分別于2016年秋種植于湖北枝江和安徽黃山病區(qū)進(jìn)行抗病性鑒定。苗期(播種后約2個(gè)月)田間抗性調(diào)查發(fā)現(xiàn), Bing409R及華雜62R在黃山地區(qū)表現(xiàn)出全抗(各調(diào)查 60株), 而對(duì)照材料 Bing409發(fā)病率100% (調(diào)查40株); Bing409R及華油雜62R在枝江地區(qū)也表現(xiàn)全抗(各調(diào)查 80株); 進(jìn)一步基因型分析表明, F1植株(隨機(jī)檢測(cè)12株)及Bing409R植株(隨機(jī)檢測(cè) 7株)均含有CRb抗病位點(diǎn), 而感病對(duì)照Bing409 (隨機(jī)檢測(cè)12株)均不含有該位點(diǎn)(圖5)。苗后期(播種后約3個(gè)半月), 在枝江病區(qū)華雜62R與當(dāng)?shù)夭豢共≈魍茖?duì)照品種相比, 表現(xiàn)出極強(qiáng)抗性且田間長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng), 明顯優(yōu)于對(duì)照(圖6)。

2.5 抗根腫病新品種華油雜 62R的產(chǎn)量及農(nóng)藝性狀測(cè)試

2017—2018年度, 在黃岡市農(nóng)業(yè)科學(xué)院梅家墩試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行了根腫病抗病新品種華油雜 62R的產(chǎn)量及主要農(nóng)藝性狀考察, 以長(zhǎng)江中游優(yōu)良品種華油雜12號(hào)為對(duì)照, 每個(gè)品種各種植3個(gè)重復(fù), 小區(qū)面積 20 m2, 考察主要與產(chǎn)量相關(guān)的農(nóng)藝性狀并測(cè)定小區(qū)產(chǎn)量, 每一性狀調(diào)查植株15株。株高、有效分枝數(shù)、單株有效角果、每角粒數(shù)、千粒重、單株產(chǎn)量等主要產(chǎn)量性狀的考察結(jié)果如表6所示, 其中株高、每角粒數(shù)均低于對(duì)照華油雜12, 單株有效角果數(shù)及千粒重均高于對(duì)照華油雜 12, 單株產(chǎn)量與對(duì)照相比無差異。華油雜62R的小區(qū)產(chǎn)量與對(duì)照品種華油雜12相比基本相當(dāng), 折合單產(chǎn)3183.5 kg hm–2。由此可見, 華油雜 62R不僅對(duì)根腫菌 4號(hào)生理小種表現(xiàn)出免疫抗性, 并且還表現(xiàn)出較高的產(chǎn)量生產(chǎn)能力。

表6 抗根腫病雜交種華油雜62R主要產(chǎn)量性狀考察及小區(qū)產(chǎn)量測(cè)定Table 6 Examination of main yield characteristics and determination of yield of clubroot resistant hybrid Huayouza 62R

3 討論

本研究以抗根腫病大白菜CR Shinki為供體, 通過遠(yuǎn)緣雜交和分子標(biāo)記篩選, 成功地將甘藍(lán)型油菜國審三系雜交種華油雜62的恢復(fù)系Bing409進(jìn)行了抗性改良(命名為Bing409R)。在改良過程中, 從BC1代開始采用對(duì)抗病位點(diǎn)和遺傳背景篩選, 并結(jié)合適當(dāng)表型鑒定的策略, 極大縮短了育種時(shí)間, 顯著提高了育種效率。然后, 以此為基礎(chǔ)利用Bing409R與華油雜62的波里馬不育系配制雜交組合, 成功選育了甘藍(lán)型油菜抗根腫病雜交新品種華油雜62R, 并完成了品種登記(GDP油菜(2018) 420213), 為我國選育的第一個(gè)抗根腫病油菜雜交種。近年來, 我國油菜根腫病的發(fā)生面積逐年擴(kuò)大, 重災(zāi)區(qū)主要分布在四川、湖北、安徽等地[23], 室內(nèi)及病區(qū)接菌鑒定結(jié)果表明, 華油雜62R對(duì)我國油菜主產(chǎn)區(qū)四川、湖北、安徽等地的根腫菌具免疫或高抗抗性。因此該品種應(yīng)用范圍較大, 產(chǎn)量水平較高, 如在安徽績(jī)溪發(fā)病田塊產(chǎn)量可達(dá) 3000 kg hm–2以上, 因此其應(yīng)用前景廣闊。近年來, 雖然華油雜 62R年推廣面積在30,000～50,000 hm2左右, 但仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足油菜生產(chǎn)的需要, 目前全國主要油菜育種單位利用這個(gè)抗源正在加緊抗病新品種的選育工作, 這對(duì)保障我國油菜產(chǎn)業(yè)免受油菜根腫病的威脅具有重要意義。

根腫病菌是十字花科專性寄生菌, 生理小種多樣, 長(zhǎng)期種植含單一抗病基因的品種容易造成抗性喪失[24]。因此, 未來將不同的抗病位點(diǎn)如CRb與PbBa8.1[19]進(jìn)行聚合, 可培育出對(duì)根腫病多個(gè)生理小種同時(shí)具有抗性的優(yōu)良油菜品種, 以降低品種抗性喪失的風(fēng)險(xiǎn)。今后, 還需要加大不同抗源材料的創(chuàng)制力度, 以增加抗病基因的遺傳多樣性, 為抗病位點(diǎn)聚合育種奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

通過對(duì)雜交、回交及自交等育種程序, 結(jié)合前景和遺傳背景的分子標(biāo)記輔助篩選, 將CRb根腫病抗病位點(diǎn)導(dǎo)入到甘藍(lán)型油菜國審品種華油雜 62的父本Pol CMS恢復(fù)系Bing409中; 在改良了波里馬恢復(fù)系 Bing409根腫病抗性的基礎(chǔ)上, 選育了我國第一個(gè)抗根腫病油菜雜交新品種華油雜 62R。根腫病抗病性遺傳改良并未對(duì)抗病新恢復(fù)系 Bing409R及由其配制的雜交種華油雜62R的產(chǎn)量、品質(zhì)造成不良影響; Bing409R及華油雜62R對(duì)我國四川、湖北、安徽等地區(qū)根腫菌生理小種具有免疫抗性。本研究的開展, 為我國油菜抗根腫病育種提供了寶貴的資源, 為我國抵抗油菜根腫病的威脅提供了重要支撐。

附表1 用于遺傳背景篩選的多態(tài)性分子標(biāo)記Table S1 Polymorphic molecular markers used for genetic background screening

(續(xù)附表 1)

(續(xù)附表 1)

(續(xù)附表 1)

附表2 F1、BC1及兩親本的發(fā)病率統(tǒng)計(jì)Table S2 Number of plants of F1, BC1, and two parents at different disease resistant levels

附表3 Bing409R抗病材料接種我國不同地區(qū)根腫菌株數(shù)統(tǒng)計(jì)Table S3 Number of resistant materials Bing409R inoculated with P. brassica in different areas of China