基于HPLC-RID的花生籽仁可溶性糖含量檢測(cè)方法的建立

李威濤 郭建斌 喻博倫 徐思亮 陳海文 吳 貝 龔?fù)h 黃 莉 羅懷勇 陳玉寧 周小靜 劉 念 陳偉剛 姜慧芳

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北武漢 430062

花生(Arachis hypogaeaL.)是我國(guó)重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物?；ㄉ讶矢缓鞍踪|(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素、白藜蘆醇、礦物質(zhì)、植物營(yíng)養(yǎng)素等[1], 深受人們喜愛(ài)。隨著生活水平的提高和營(yíng)養(yǎng)科學(xué)的發(fā)展, 其較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值將會(huì)不斷的通過(guò)科學(xué)試驗(yàn)被確認(rèn)[2]。目前, 我國(guó)花生產(chǎn)量的 50%～60%用來(lái)榨油, 約 30%是食品工業(yè)的重要原材料[3]。國(guó)外對(duì)花生的利用與我國(guó)有很大的差別, 特別是美國(guó)和歐盟各國(guó), 其花生總產(chǎn)的 70%～90%以上用于食用及食品加工[4]。近年來(lái), 我國(guó)花生食品加工業(yè)發(fā)展迅速,食用花生的需求也呈逐年上升趨勢(shì)[5]。食用花生品質(zhì)評(píng)價(jià)重要因素之一是口味, 包括甜度、香味、脆度、柔嫩度、細(xì)膩度、異味6個(gè)指標(biāo), 它直接影響花生的食用體驗(yàn)及經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3]。其中甜度與籽仁中的可溶性糖含量緊密相關(guān),可溶性糖主要有果糖、葡萄糖和蔗糖。研究表明, 甜度與花生籽仁的口味品質(zhì)相關(guān)系數(shù)達(dá) 0.88, 花生籽仁中蔗糖含量達(dá)到 5%以上時(shí), 口感較好[6]。目前, 我國(guó)關(guān)于食用型花生品種的培育及與之相關(guān)的品質(zhì)性狀研究進(jìn)展緩慢,尚未形成食用花生品種專(zhuān)用化[3]。對(duì)花生資源及育種后代材料進(jìn)行可溶性糖含量快速準(zhǔn)確測(cè)定, 一方面可以選育可溶性糖含量高的后代, 培育口感好的新品種, 提高育種的效率; 另一方面還可以將鑒定到的可溶性糖含量高和低的材料構(gòu)建群體, 對(duì)花生籽仁中可溶性糖含量的積累機(jī)制進(jìn)行深入的研究, 定位相關(guān)主效 QTL, 進(jìn)而克隆基因并開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記, 為甜花生高效的分子育種奠定基礎(chǔ)。

目前花生籽仁中的果糖、葡萄糖和蔗糖含量多采用比色法測(cè)定, 如3,5-二硝基水楊酸比色法、菲林試劑比色法等[6]。比色法檢測(cè)效率較低, 難以大規(guī)模應(yīng)用, 而且比色法檢測(cè)糖含量的準(zhǔn)確性低, 重復(fù)性差[7-8]。近年來(lái)也出現(xiàn)了應(yīng)用紅外光譜法測(cè)定花生籽仁中的蔗糖含量, 雖可快速檢測(cè)蔗糖含量, 但需要復(fù)雜的前期工作, 需要先測(cè)出大量樣品的蔗糖含量來(lái)建立模型[9-11]。對(duì)蜂蜜[7-8]、洋蔥[12]、甘蔗[13]等的研究結(jié)果表明, 高效液相-示差折光法(HPLC-RID)可以同時(shí)分析樣品中果糖、葡萄糖和蔗糖的含量, 且檢測(cè)的準(zhǔn)確性高, 前期樣品處理也簡(jiǎn)單, 可大規(guī)模高效測(cè)定樣品中的可溶性糖含量。有關(guān)利用HPLC-RID快速測(cè)定花生可溶性含量的應(yīng)用尚未見(jiàn)系統(tǒng)報(bào)道。本研究以花生為材料, 建立了利用 HPLC-RID快速測(cè)定花生籽仁中可溶性糖含量的方法, 旨在為花生資源可溶性糖含量的快速檢測(cè)及食用型花生高效育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選用20份花生品種, 其基本信息見(jiàn)表1。花生莢果收獲曬干后剝殼, 選取成熟飽滿(mǎn)、無(wú)發(fā)芽、無(wú)破損、無(wú)病斑的籽仁為試驗(yàn)材料。

表1 試驗(yàn)所用花生樣品Table 1 Peanut samples used in the study

1.2 樣品處理?xiàng)l件探索

將30?；ㄉ讶蕵悠酚梅鬯闄C(jī)碎成粉末, 過(guò)20目篩,稱(chēng)量1 g樣品至50 mL離心管中, 加一定量(10、15和20 mL)80%乙醇(乙醇∶水 = 80∶20)[14], 混勻后置于80℃水浴鍋中水浴, 期間每隔10 min混勻1次, 結(jié)束后冷卻至室溫,取上清液1.5 mL至2.0 mL離心管中, 12,000×g離心5 min, 然后用0.45 μm濾膜將樣液過(guò)濾入樣品瓶中供液相色譜測(cè)定。

1.3 色譜條件

本研究在楊成聰?shù)萚15]方法的基礎(chǔ)上, 略有調(diào)整, 選擇流動(dòng)相中乙腈和水的體積比為75∶25, 流速0.8 mL min-1,進(jìn)樣量10 μL, 檢測(cè)器和色譜柱溫度均為40℃, 進(jìn)行色譜分析。

1.4 蔗糖含量的計(jì)算

蔗糖含量(mg g-1) = 測(cè)定的糖濃度(mg mL-1)×提取液體積(mL)。根據(jù)測(cè)定峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算獲得測(cè)定的糖濃度。

1.5 重復(fù)性、精密度和加標(biāo)回收率試驗(yàn)

多次重復(fù)取樣, 按照1.2 (20 mL 80%乙醇)和1.3所述方法測(cè)定含糖量, 根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)考察樣品重復(fù)性。對(duì)色譜分析樣品連續(xù)進(jìn)樣多次, 測(cè)定可溶性糖含量, 通過(guò)計(jì)算測(cè)定結(jié)果的RSD考察試驗(yàn)的精密度。按照1.2 (20 mL 80%乙醇)方法制備樣品, 依次加入不同體積的80%乙醇和糖儲(chǔ)備液, 按照1.3方法測(cè)定可溶性糖含量, 通過(guò)計(jì)算加標(biāo)回收率考察試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。加標(biāo)回收率的計(jì)算公式如下:P=(c2-c1)/c3×100%, 其中P為加標(biāo)回收率,c2為加標(biāo)后測(cè)定可溶性糖濃度(mg g-1),c1為不加標(biāo)測(cè)定的濃度(mg g-1),c3為加標(biāo)量(mg)。

1.6 國(guó)標(biāo)法測(cè)定花生籽仁中的可溶性糖含量

參照國(guó)標(biāo)法(GB 5009.8-2016)中脂肪大于10%的食品的處理方法制備樣品, 利用高效液相色譜法測(cè)定可溶性糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

通過(guò)材料與方法1.3確定的色譜條件檢測(cè)蔗糖標(biāo)品發(fā)現(xiàn), 基線(xiàn)平穩(wěn), 果糖和葡萄糖可以很好的分離(圖1-A)。分別取葡萄糖、果糖和蔗糖分析純2.5 g, 在80℃烘箱中烘干至恒重, 分別準(zhǔn)確稱(chēng)取烘干后葡萄糖、果糖和蔗糖2.0 g至100 mL容量瓶中, 加80%乙醇90 mL, 超聲助溶, 然后定容至100 mL, 配制成20 mg mL-1的糖儲(chǔ)備液, 4℃保存,按照表2配制標(biāo)準(zhǔn)液。以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo), 樣品峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn), 得回歸方程, 葡萄糖y1=92225x–13864,R2 = 0.9991; 果糖y2= 81506x+10534,R2 =0.999; 蔗糖y3= 91367x+2270.2,R2= 0.9991。說(shuō)明葡萄糖、果糖和蔗糖濃度在0.5～6.5 mg mL-1之間線(xiàn)性關(guān)系良好。

表2 蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液的配制Table 2 Preparation of sucrose standard solution

2.2 樣品處理時(shí)間和提取液體積對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

將花生籽仁磨成粉末后, 分別加入10、15、20 mL的80%乙醇提取液, 分別在80℃水浴鍋中水浴30、35和40 min, 測(cè)定不同條件下的果糖、葡萄糖和蔗糖含量。在花生籽仁(中花12)中只檢測(cè)到蔗糖的存在, 果糖和葡萄糖沒(méi)有檢測(cè)到(圖1-B)。進(jìn)一步對(duì)其他花生品種(徐花13、中花6號(hào)、中花21、中花9號(hào)等)的籽仁進(jìn)行檢測(cè), 仍然是只有蔗糖, 沒(méi)有檢測(cè)到果糖和葡萄糖。對(duì)不同處理中花12籽仁蔗糖的測(cè)定結(jié)果(表3)進(jìn)行方差分析表明, 提取液的體積和水浴時(shí)間對(duì)蔗糖測(cè)定的結(jié)果影響不顯著(表4)。由于10 mL 80%乙醇, 水浴30 min比較經(jīng)濟(jì), 而且快速, 因此, 本試驗(yàn)選擇10 mL 80%乙醇, 水浴30 min作為后續(xù)試驗(yàn)條件。

表3 不同處理時(shí)間和提取液體積下的蔗糖含量Table 3 Sucrose content under different treatment time and extraction liquid

2.3 方法的準(zhǔn)確性驗(yàn)證

2.3.1 方法的精密度試驗(yàn) 將中花12籽仁研磨成細(xì)粉后, 按照1.2和2.2確定的樣品處理方法處理樣品, 然后對(duì)待測(cè)的同一樣品連續(xù)進(jìn)樣10次, 測(cè)定峰面積, 并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算蔗糖濃度, 通過(guò)1.4所示公式計(jì)算蔗糖含量, 進(jìn)而計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)考察測(cè)定的精密度, 得出蔗糖的RSD為0.59%, 精密度良好(表5)。

2.3.2 方法的重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)中花12花生籽仁重復(fù)取樣6次, 按照1.2和2.2確定的樣品處理方法處理樣品, 然后測(cè)定峰面積, 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算蔗糖濃度, 通過(guò)1.4所示公式計(jì)算蔗糖含量, 進(jìn)而計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)考察測(cè)定的精密度, 得出蔗糖的RSD為0.73%, 該方法的穩(wěn)定性良好(表6)。

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Results of ANOVA analysis

表5 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of precision test

表6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Result of repetitive test

2.3.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 將中花12籽仁研磨成細(xì)粉,過(guò)20目篩, 稱(chēng)取1 g至編號(hào)為1～4的50 mL離心管中, 依次加入80%乙醇20、19.5、19和18.5 mL, 然后在2～4號(hào)管中分別加0.5、1.0和1.5 mL糖儲(chǔ)備液, 然后按照1.2的方法提取可溶性糖并制備供色譜分析的樣品, 并按照1.3的色譜條件測(cè)可溶性糖含量, 通過(guò)計(jì)算加標(biāo)回收率考察試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示加標(biāo)后的平均回收率為97.6% (表7), 表明該方法準(zhǔn)確可靠。

2.4 HPLC-RID和國(guó)標(biāo)法測(cè)定蔗糖含量的結(jié)果比較

以本實(shí)驗(yàn)室20份花生品種為材料, 用HPLC-RID法測(cè)定的蔗糖含量最高的品種為冀花甜1號(hào) [(83.81±0.59) mg mL-1], 其次為冀9402 [(60.26±0.90) mg mL-1], 最低的為中花12 [(16.19±0.20) mg mL-1], 其次為豫花9805[(16.58±0.44) mg mL-1](表8)。通過(guò)國(guó)標(biāo)法測(cè)定的蔗糖含量最高的品種為冀花甜1號(hào) [(81.38±3.67) mg mL-1], 其次為冀9402 [(59.52±1.73) mg mL-1], 最低的為豫花9805[(15.60±0.75) mg mL-1], 其次為中花12 [(17.39±0.73) mg mL-1](表8)。由此可見(jiàn), 2種方法鑒定出的蔗糖含量高和低的材料一致。將2種方法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析, 其相關(guān)系數(shù)為r= 0.99, 表明2種方法測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性很高。另外, 經(jīng)過(guò)配對(duì)樣本T檢驗(yàn)分析可知,t= 0.774,P=0.448 > 0.05, 表明2種方法所測(cè)結(jié)果差異不顯著。綜上所述,HPLC-RID可以作為花生種子中蔗糖含量測(cè)定的有效方法。

3 討論

花生是我國(guó)傳統(tǒng)的油料作物, 近年來(lái)品質(zhì)相關(guān)性狀研究工作主要集中在含油量[16-21]、脂肪酸[22-26]和蛋白質(zhì)[27-31]上, 而有關(guān)花生籽仁中含糖量的研究鮮有報(bào)道。對(duì)花生品質(zhì)的研究結(jié)果顯示, 甜度與花生的口味緊密相關(guān)[6],而甜味來(lái)源于花生籽仁中的可溶性糖(果糖、葡萄糖和蔗糖)。先前的研究結(jié)果顯示, 花生籽仁中存在果糖、葡萄糖和蔗糖, 且蔗糖是最主要的糖[32-37]。也有研究結(jié)果顯示,花生籽仁中主要含蔗糖, 而果糖和葡萄糖是在樣品處理過(guò)程當(dāng)中產(chǎn)生的[14]。其測(cè)定結(jié)果的差異主要是由于樣品的不同處理方式造成的, 本方法采用80%乙醇(乙醇∶水= 80∶20) 80℃水浴30 min抽提花生籽仁中可溶性糖, 不會(huì)改變真實(shí)的糖成分及含量, 其結(jié)果顯示中花12成熟的花生籽仁中主要含蔗糖, 而果糖和葡萄糖并未檢測(cè)到。利用本研究摸索得到的條件對(duì)本實(shí)驗(yàn)室其他花生品種徐花13、中花6號(hào)、中花21、中花9號(hào)等進(jìn)行糖含量的測(cè)定, 結(jié)果也顯示籽仁中只檢測(cè)到蔗糖。其原因可能是成熟花生籽仁中果糖和葡萄糖的含量極小, 不能有效的被檢測(cè)。將未成熟的花生籽仁研磨成粉后, 利用該方法可同時(shí)檢測(cè)到果糖、葡萄糖和蔗糖的存在, 因此該方法可以有效地測(cè)定花生籽仁中3種可溶性糖的含量。綜合前人研究結(jié)果和本研究的結(jié)果, 蔗糖是花生籽仁中最主要也是含量最高的可溶性糖。其含量是影響花生口味的重要因素, 含量越高,口感越好。

表7 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Results of spike recovery test

檢測(cè)花生籽仁中可溶性糖含量的方法有很多種, 如比色法、氣相色譜法、高效液相法。其中比色法步驟繁瑣且準(zhǔn)確性較差[7-8]。氣相色譜雖然也可以測(cè)定不同糖的含量, 但是測(cè)定過(guò)程含將樣品置于三氟乙酸中加熱到70℃的轉(zhuǎn)化步驟, 這會(huì)導(dǎo)致部分低聚糖的降解, 導(dǎo)致檢測(cè)的結(jié)果與實(shí)際籽仁中糖的含量有明顯差別, 得出不符實(shí)際的結(jié)論[14]。近年來(lái)紅外光譜技術(shù)也在花生籽仁中含油量[38]、脂肪酸[39-41]、蛋白質(zhì)[42]和糖含量[6]的測(cè)定得到了應(yīng)用, 但測(cè)定之前需要根據(jù)參試樣品建立模型, 一旦建模完成, 也可以對(duì)大量育種材料進(jìn)行可溶性糖含量的測(cè)定, 測(cè)定精度能滿(mǎn)足育種工作需要。利用國(guó)標(biāo)法測(cè)定可溶性糖的樣品需要經(jīng)過(guò)石油醚(沸程30～60℃)除去其中的油脂、蒸干、加水溶解以及乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液沉淀蛋白質(zhì)等復(fù)雜的處理步驟, 導(dǎo)致樣品測(cè)定效率較低。

本研究利用HPLC-RID建立了花生籽仁中果糖、葡萄糖和蔗糖的快速測(cè)定的方法。選擇提取溫度80℃, 以水浴時(shí)間和80%乙醇的體積為變量, 以測(cè)定的可溶性糖含量為指標(biāo), 探索出最佳的水浴時(shí)間為30 min, 提取液體積為10 mL, 在該條件下, 花生籽仁中的可溶性糖能完全溶解在80%乙醇中。HPLC-RID檢測(cè)可溶性糖一般用乙腈和水的混合溶劑作為流動(dòng)相, 乙腈和水的比例變化會(huì)影響出峰時(shí)間和峰信號(hào)。乙腈在流動(dòng)相中的比例增大可有效改善色譜峰形, 有利于果糖、葡萄糖和蔗糖的基線(xiàn)分離, 但糖在乙腈中的溶解度很小, 乙腈比例增大不利于糖的溶解,各組分出峰時(shí)間也顯著延長(zhǎng), 且峰信號(hào)較弱; 當(dāng)增加流動(dòng)相中水的比例時(shí), 各組分出峰時(shí)間縮短, 峰信號(hào)增強(qiáng), 但水的比例過(guò)大會(huì)造成果糖和葡萄糖基線(xiàn)不能分離, 影響結(jié)果[43]。流動(dòng)相流速, 檢測(cè)器溫度和柱溫也會(huì)顯著影響各組分出峰時(shí)間和峰信號(hào)。該方法采用流動(dòng)相乙腈和水的體積比為75∶25, 流速0.80 mL min-1, 進(jìn)樣量10 μL, 檢測(cè)器和色譜柱溫度均為40℃時(shí), 果糖、葡萄糖和蔗糖的基線(xiàn)在13 min內(nèi)達(dá)到分離, 可以有效的進(jìn)行可溶性糖含量的準(zhǔn)確測(cè)定。

利用該方法在花生樣品中只檢測(cè)到蔗糖的存在, 精密性試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值為0.59%, 重復(fù)性試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值為0.73%, 平均回收率為97.59%, 說(shuō)明測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定且準(zhǔn)確。以該方法和國(guó)標(biāo)法檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)室20份花生材料籽仁中的蔗糖含量表明, 成熟的花生籽仁中的蔗糖含量存在豐富的變異, 蔗糖含量最高的約是蔗糖含量最低的5倍。2種方法的測(cè)定結(jié)果相關(guān)性很高(r= 0.99), 樣本配對(duì)T檢驗(yàn)的結(jié)果表明, 兩者的測(cè)定結(jié)果差異不顯著。由此可見(jiàn), 本研究建立的方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠, 適用于花生籽仁中蔗糖含量的定量分析。有研究報(bào)道, 花生籽仁的甜味是可遺傳的性狀, 而蔗糖又是花生籽仁中最主要的可溶性糖[44], 因該方法可大規(guī)?？焖贉?zhǔn)確測(cè)定蔗糖含量, 可以為甜花生資源篩選、花生籽仁中控制蔗糖含量關(guān)鍵基因的定位、分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)以及我國(guó)未來(lái)花生品質(zhì)育種提供技術(shù)支持。