基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探討三棱-莪術(shù)治療慢性萎縮性胃炎的分子機制

涂文玲，林澤豪，連雄瀚，甘慧娟*

(1.福建中醫(yī)藥大學 中醫(yī)證研究基地，福建 福州 350122；2.福建省中醫(yī)健康狀態(tài)辨識重點實驗室，福建 福州 350122)

慢性萎縮性胃炎(Chronic atrophic gastritis，CAG)是胃癌發(fā)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，被視為胃癌前疾病，近年來發(fā)病率呈明顯上升趨勢，癌變率為1.2%～7.1%，并向低齡化發(fā)展。西醫(yī)治療CAG主要采取根除Hp、胃黏膜保護等方法[1]，臨床取得了一定療效，但多以對癥治療為主，易反復發(fā)作，因而迫切需要尋求新方法用以防治CAG。中醫(yī)藥在整體觀念指導下進行辨證論治，能夠有效改善CAG臨床癥狀和逆轉(zhuǎn)胃黏膜萎縮，具有很好的防治作用[2-3]。中醫(yī)認為CAG患者久病體虛，久病必瘀，血瘀始終是CAG的病理因素，貫穿始終[4-6]。三棱性平，莪術(shù)性溫，均歸肝、脾經(jīng)，均具有破血行氣、消積止痛之功效，兩者常常用來治療CAG，郭云協(xié)等[7]在治療CAG伴腸化過程中加入三棱、莪術(shù)破血消積，起到逆轉(zhuǎn)腸化生的作用。雖然三棱、莪術(shù)在臨床得到肯定，但是其作用機理并不明確，因此本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學對三棱、莪術(shù)治療CAG作用機理進行研究，并利用分子對接技術(shù)進行驗證，以期為后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 三棱-莪術(shù)中藥成分和靶點篩選

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(https：//tcmspw.com/tcmsp.php)檢索“三棱”“莪術(shù)”兩味中藥，以口服生物利用度(OB≥30%)和類藥性(DL≥0.18)進行篩選，收集三棱-莪術(shù)的活性成分，同時檢索活性成分的蛋白靶標，將蛋白靶標一一輸入Uniprot(https：//www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫進行基因名轉(zhuǎn)化。以“chronic atrophic gastritis”為檢索詞在Gene Cards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https：//omim.org/)、PharmGKB數(shù)據(jù)庫(https：//www.pharmgkb.org/)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(https：//go.drugbank.com/)進行檢索，綜合各個數(shù)據(jù)庫檢索得到的靶點，并去除重復項，得到CAG疾病相關(guān)靶點。

1.2 韋恩圖、蛋白網(wǎng)絡(luò)互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)及藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Venny(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)在線工具繪制韋恩圖，獲取三棱-莪術(shù)和CAG的共同靶點，將共同靶點輸入String數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)，設(shè)置置信度為0.4，制作PPI網(wǎng)絡(luò)圖，用Cytoscape3.8.0 軟件進行可視化，最后將活性成分-共同靶點信息導入Cytoscape3.8.0軟件，繪制出活性成分-共同靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 共同靶點的GO、KEGG富集分析和分子對接

利用R軟件進行GO和KEGG富集分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，在PDB、PubChem數(shù)據(jù)庫獲取三棱-莪術(shù)的主要活性成分和核心靶點的晶體結(jié)構(gòu)，再借助AutoDockTool Vina軟件將主要活性成分與核心靶點進行分子對接，搜集結(jié)合值，佐證三棱-莪術(shù)治療CAG的合理性。

2 結(jié)果

2.1 三棱-莪術(shù)中藥活性成分及靶點篩選結(jié)果

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫收集、篩選(OB≥30%、DL≥0.18)出三棱-莪術(shù)活性成分8個，其中三棱5個、莪術(shù)3個。對該活性成分進行靶點查找，剔除未找到靶點的活性成分，獲取5個有效活性成分，見表1。對通過TCMSP數(shù)據(jù)庫找到的藥物靶點進行基因名轉(zhuǎn)化，去除重復項，共得到66個靶點；從GeneCards、OMIM、PharmGKB、DrugBank數(shù)據(jù)庫獲得疾病靶點377個；將三棱-莪術(shù)的作用靶點和疾病靶點分別輸入Venny在線工具繪制韋恩圖取交集，匹配得到三棱-莪術(shù)治療CAG的共同靶點9個，見圖1。

注：A：韋恩圖；B：三棱-莪術(shù)與CAG的共同靶點。圖1 疾病共同作用靶點

表1 三棱-莪術(shù)的活性化合物

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及蛋白互作結(jié)果

利用Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建出活性成分-共同靶點模型，見圖2A，其中綠色節(jié)點代表該活性成分來自三棱(4個)，綠色和藍色各半節(jié)點代表該活性成分來自三棱和莪術(shù)(1個)，黃色節(jié)點代表藥物與疾病的共同靶點(9個)。最后利用String數(shù)據(jù)庫和Cytoscape 3.8.0軟件進行制作共同靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2B。依據(jù)所構(gòu)建的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)CASP3、PPARG、PTGS2、JUN、NOS2是三棱-莪術(shù)治療CAG的核心靶點(Degree>4.89(平均值))，見表2；且β-谷甾醇、芒柄花黃素是三棱-莪術(shù)治療CAG的主要活性成分(Degree>3.6(平均值))，見表3。

注：A：活性成分-靶標網(wǎng)絡(luò)圖；B：核心靶點的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。圖2 藥物與CAG 之間網(wǎng)絡(luò)

表2 PPI網(wǎng)絡(luò)中靶點的相關(guān)參數(shù)

表3 活性成分-共同靶點網(wǎng)絡(luò)圖中活性成分的相關(guān)參數(shù)

2.4 GO和KEGG富集分析

通過R軟件對9個共同靶點進行GO功能富集分析，根據(jù)P<0.05，得到生物過程(Biological process，BP)條目878個，細胞組成(Cell composition，CC)條目21個，分子功能(Molecular function，MF)77個，其中生物過程主要富集于對細菌源分子的反應(yīng)、細胞對外界刺激的反應(yīng)等，細胞組成主要富集于RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復合物、線粒體外膜等，分子功能主要富集于半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與細胞凋亡過程、死亡受體結(jié)合等，見圖3，紅色越深代表P值越小，節(jié)點越大代表富集靶點數(shù)量越多。

圖3 GO富集結(jié)果信息(top10)

通過R軟件對9個共同靶點進行KEGG通路富集分析，根據(jù)P<0.05篩選到74條信號通路，主要涉及IL-17信號通路、TNF信號通路、P53信號通路、HIF-1信號通路等，見圖4，紅色越深代表P值越小，節(jié)點越大代表富集靶點數(shù)量越多。

圖4 KEGG富集結(jié)果信息(top30)

2.5 分子對接結(jié)果

核心靶點CASP3、PPARG、PTGS2、JUN、NOS2在PDB數(shù)據(jù)庫進行搜索，獲得晶體結(jié)構(gòu)ID依次為2C1E、2Q59、5F19、1JNM、2NSI，再與核心活性成分進行分子對接，得出其對接的結(jié)合能(kcal/mol)數(shù)值，見表4。結(jié)合能為負值表明配體和受體可以自發(fā)結(jié)合[8]，并且結(jié)合能越低，該結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定，發(fā)生作用的可能性越大[9]。

表4 分子對接結(jié)合能信息

3 討論

當前CAG被認為是胃癌的癌前病變，其經(jīng)歷的過程為：正常胃黏膜-慢性淺表性胃炎-萎縮性胃炎-腸上皮化生-異型增生-胃癌，隨著病情加重，胃黏膜萎縮可發(fā)展為腸上皮化生，這其實與葉天士“久病入絡(luò)”“久痛入絡(luò)”學說有異曲同工之處[10]?，F(xiàn)代醫(yī)學認為胃黏膜血流量減少、微循環(huán)灌注差，進而導致CAG，這與中醫(yī)瘀血具有很大相似性。研究發(fā)現(xiàn)胃黏膜萎縮伴重度腸上皮化生多以胃絡(luò)瘀血證為主[11]。三棱、莪術(shù)作為活血化瘀的代表中藥，現(xiàn)代藥理學研究表明，兩藥均有改善血液流變學、擴張血管、調(diào)節(jié)血管通透性和抗癌作用[12]；臨床研究發(fā)現(xiàn)三棱-莪術(shù)藥對可通過顯著抑制內(nèi)皮細胞增殖、 抑制腫瘤細胞生成、直接殺死腫瘤細胞、抑制血管生成、阻斷信號傳導通路等機制起到治療胃癌的作用[13-15]。近年來，愈來愈多研究者對活血化瘀治療CAG進行臨床研究，在治療一些腸上皮化生CAG患者過程中，可以適當選加具有一定防癌、治癌作用的清熱活血之品，通過改善胃黏膜微循環(huán)狀態(tài)，增加胃黏膜血流，可逆轉(zhuǎn)黏膜腺體萎縮和腸上皮化生等病變[16]。

通過分析PPI網(wǎng)絡(luò)分析和“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)參數(shù)，可知三棱-莪術(shù)治療CAG的核心活性成分是 β-谷甾醇和芒柄花黃素，β-谷甾醇是一種安全的天然藥物，具有抗炎、抑制腫瘤等廣泛的藥理活性，研究表明β-谷甾醇可通過提升血清 NO 含量而提高受損胃黏膜的修復能力[17]。芒柄花黃素為一種生物活性異黃酮，具有完善的生物功能和抗腫瘤作用[18]，研究發(fā)現(xiàn)芒柄花黃素可防止血管生成和癌轉(zhuǎn)移，可抑制人胃癌 MKN-45 細胞株的增殖[19]。三棱-莪術(shù)主要作用靶點是CASP3、PPARG、PTGS2、JUN、NOS2。CASP3 是在整個凋亡通路中起到樞紐作用的重要凋亡信號分子[20]，研究發(fā)現(xiàn)CASP3的表達在人的胃癌組織比正常組織要明顯降低[21]。PPARG是由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)PPARG在胃癌組織的低表達可能是胃癌轉(zhuǎn)移的早期事件[22]。PTGS2是一種促炎癥因子，其高表達與腫瘤細胞快速生長、凋亡受抑制以及浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)[23]。JUN原癌基因的激活在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，能調(diào)控細胞的生長、分化、凋亡[24]。NOS2在多種生物過程中充當生物介質(zhì)，包含抗腫瘤活性，研究發(fā)現(xiàn)，NOS2與腫瘤血管形成有關(guān)，可能通過抑制NOS2的表達來抑制腫瘤血管的發(fā)生，這可能是治療腫瘤的一種方法[25]。因此，三棱-莪術(shù)的β-谷甾醇、芒柄花黃素這兩種核心成分可能是通過抗炎、調(diào)控細胞凋亡、抑制腫瘤血管的形成對CAG起到治療作用。

GO功能富集發(fā)現(xiàn)，三棱-莪術(shù)活性成分的生物學過程涉及脂多糖、細菌源分子的反應(yīng)等，分子功能主要富集于半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與細胞凋亡過程等，KEGG通路富集分析可知其主要涉及IL-17信號通路、TNF信號通路、P53信號通路、HIF-1信號通路等。IL-17 由輔助性 T 細胞(Th17)及先天性免疫細胞等分泌的促炎癥因子，在多種炎性反應(yīng)發(fā)揮關(guān)鍵作用，研究發(fā)現(xiàn) IL-17可通過NF-κB 信號通路刺激下游效應(yīng)因子發(fā)生轉(zhuǎn)錄，參與胃癌的免疫調(diào)控以及促進胃癌的發(fā)生發(fā)展[26]。TNF具有多種生物學功能，可誘導細胞增殖分化，抑制細胞凋亡，促進炎癥和腫瘤發(fā)展，加重CAG[27]。P53是一種抑癌基因，能抑制細胞增殖、生長和轉(zhuǎn)化，在CAG過程中，病情越嚴重，p53的表達率越高[28]。HIF-1由HIF-α和HIF-β組成[29]，其中HIF-1α在缺氧環(huán)境下可促進腫瘤血管生成，因此抑制HIF-1α的表達可減少腫瘤血管生成[30]。因此，三棱-莪術(shù)可能是通過抗炎、調(diào)控細胞凋亡、抑制腫瘤血管形成來達到治療CAG的效果。分子對接顯示三棱-莪術(shù)的核心活性成分與核心靶點有著很好的結(jié)合性，發(fā)揮作用的可能性極大。

綜上，本研究從三棱-莪術(shù)中篩選出兩個核心活性成分(β-谷甾醇和芒柄花黃素)和5個核心靶點(CASP3、PPARG、PTGS2、JUN、NOS2)進行結(jié)合的潛能，并且得出三棱-莪術(shù)治療CAG的可能機制是通過抗炎、調(diào)控細胞凋亡、抑制腫瘤血管形成，這為治療CAG的中藥天然藥物和單體藥物的研發(fā)提供了新思路。但計算機生物方法本身具有局限性，我們在接下來將結(jié)合動物實驗來進行驗證。