野生與栽培百蕊草紫云英苷、百蕊草素Ⅰ和山柰酚含量的比較研究

張成才，向增旭

(南京農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，江蘇 南京 210095)

百蕊草(ThesiumchinenseTurcaz.)為檀香科百蕊屬多年生半寄生草本植物，以“百乳草”之名始載于《本草圖經(jīng)》。百蕊草作為傳統(tǒng)中藥在中國已有上千年的應(yīng)用歷史，具有清熱解毒、補腎澀精之功效，現(xiàn)代藥理學研究表明，百蕊草有良好的抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、抗菌等作用，有“植物抗生素”的美稱[1-2]。百蕊草在中國各地分布廣泛，生于靠近水體或水源充分的荒草坡、田埂雜草叢中，在沙地草叢中或石坎邊也常見分布，喜溫暖濕潤氣候，喜光照，忌干旱[3]。我國華北、東北、陜西及長江以南地區(qū)是百蕊草的主要分布區(qū)，目前江蘇茅山和安徽滁州為其主要產(chǎn)區(qū)，安徽定遠縣、明光市等地資源量尤為豐富。近年來，隨著百蕊草過度采挖和其寄主植物的減少，百蕊草資源越來越少，已不再列入藥典[4]。目前，百蕊草需求量不斷增加，百蕊草主要以野生品種供應(yīng)市場，隨著野生資源的逐漸減少，栽培品種越來越受重視，百蕊草的半寄生性、種子存在深度休眠、生長周期長及成活率低等生物學特性使人工栽培擴大百蕊草資源難度較大。本課題組通過設(shè)施栽培在南京地區(qū)成功進行百蕊草的引種栽培，但關(guān)于栽培技術(shù)研究結(jié)果和質(zhì)量評價標準尚未見系統(tǒng)研究，栽培百蕊草的應(yīng)用缺乏科學依據(jù)。因此，筆者選擇百蕊草素Ⅰ、紫云英苷和山柰酚作為指標成分并對其含量進行比較分析，以期為栽培百蕊草提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料采集

供試百蕊草ThesiumchinenseTurcaz.采集于2019年6-7月百蕊草成熟期，供收集了10批百蕊草樣品，野生與栽培樣品各5批，樣品編號為YS1-YS5的藥材由安徽九華藥業(yè)股份有限公司提供，來源信息見表1。經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院向增旭副教授鑒定，所購藥材均為檀香科植物百蕊草ThesiumchinenseTurcaz.的全草，編號為ZP1-ZP5的藥材均采自南京農(nóng)業(yè)大學八卦洲實驗基地。

1.2 儀器與試劑

AR5120電子天平(美國AHOMS公司)；Waters AC-QUITY UPLC(Waters公司)；便攜式超聲波清洗儀(深圳杰拓科技)。百蕊草素標準品(上海源葉公司)；紫云英苷標準品(上海源葉公司)；山柰酚標準品(上海源葉公司)；色譜級甲醇(購自Tedia公司)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱(Phenomenex，250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：40 ℃；流動相：甲醇-0.4%磷酸溶液；梯度洗脫(0 min→5 min→10 min→20 min→45 min，45%→50%→55%→60%甲醇)；進樣體積：20 μL；流速：1.0 mL/min；波長：365 nm。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取干燥至恒重的百蕊草素Ⅰ、紫云英苷、山柰酚對照品15 mg、10 mg、10 mg，分別置于10 mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成1.500 mg/mL、1.000 mg/mL、1.000 mg/mL的對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取干燥栽培品和野生品百蕊草全草藥材，剪成5～8 cm小段置于粉碎機中粉碎，準確稱取1 g樣品粉末，向粉末中加入25 mL甲醇溶液，稱定質(zhì)量；水浴加熱回流1 h，放冷，稱定質(zhì)量；用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液[5-6]。

2.4 方法學考察

2.4.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 分別精密吸取對照品與供試品溶液各20 μL，進樣分析，分別記錄色譜圖，各組分理論塔板數(shù)均>3 000，分離度>1.5[7]。結(jié)果見圖1。

2.4.2 線性關(guān)系考察 分別精密量取對照品溶液適量，分別置于10 mL容量瓶，用流動相稀釋，定容，配制成不同濃度(μg/mL)對照品溶液。上述對照品溶液各進樣20 μL，進樣3次，分別記錄峰面積，以對照品的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標，峰面積積分值(Y)為縱坐標，進行回歸處理，得到回歸方程，百蕊草素Ⅰ、紫云英苷和山柰酚的回歸方程分別為Y=8 301.2X-35 780，R2=0.998 9；Y=43 593X-4 721.2，R2=0.999 9；Y=77 591X+8 355.6，R2=0.999 8，表明百蕊草素Ⅰ、紫云英苷和山柰酚在2.00～1 000.00 μg/mL、2.00～400.00 μg/mL和0.05～50.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。結(jié)果見圖2。

圖2 (a)百蕊草素Ⅰ校正曲線；(b)紫云英苷校正曲線；(c)山柰酚校正曲線

2.4.3 精密度試驗 取同一供試品溶液(ZP1)，連續(xù)進樣6次，分別按照“2.1”所述方法測定供試品中各色譜峰的保留時間，對照品百蕊草素Ⅰ、紫云英苷、山柰酚的平均保留時間分別為5.110 min、7.354 min、13.674 min，其相對標準差RSD均小于1%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗 取同一批次百蕊草藥材(ZP1)6份，每份各約1.0 g，分別按照“2.1”所述方法測定供試品中各色譜峰的保留時間，其相對標準差RSD均小于1%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 取同一批次供試品溶液(ZP1)，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h按上述色譜條件進樣20 μL，記錄色譜圖和各成分峰面積。供試品百蕊草素Ⅰ、紫云英苷、山柰酚的平均峰面積分別為60 113 235.041、1 596 611.503、45 202.100，RSD(n=6)分別為0.93%、2.12%、1.32%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 稱取已知含量的百蕊草藥材粉末6份，每份約0.5 g精密稱定，精密加入濃度分別為1.500 mg/mL、1.000 mg/mL、1.000 mg/mL的對照品溶液1.0 mL，依據(jù)“2.3”所述方法制成供試品溶液，測定百蕊草素Ⅰ、紫云英苷、山柰酚的含量，計算回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果 (n=6)

2.5 樣品含量測定

取10批百蕊草藥材，栽培與野生品各5批(批號：YS1、YS2、YS3、YS4、YS5；ZP1、ZP2、ZP3、ZP4、ZP5)，按照“2.3”所述方法制備供試品溶液。對照品溶液和供試品溶液各進樣20 μL測定，記錄峰面積。采用外標法分別計算10批百蕊草栽培與野生品藥材中百蕊草素Ⅰ、紫云英苷、山柰酚的含量，結(jié)果見表3。

表3 百蕊草中3種成分含量測定結(jié)果 (n=10)

3 討論

研究表明，黃酮類化合物、有機酸、生物堿等活性物質(zhì)是百蕊草抑菌作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，以黃酮的抑菌活性最強[7-8]。山柰酚作為最常見的黃酮類化合物，具有顯著的抗炎、抗氧化、抗菌和抗病毒作用，是百蕊草發(fā)揮藥效的主要成分，目前多以山柰酚、百蕊草素Ⅰ和百蕊草素Ⅱ的含量作為百蕊草藥材品質(zhì)控制的主要指標[9-10]，百蕊草素Ⅰ和百蕊草素Ⅱ作為百蕊草特有成分，含量較高。因此，本研究選擇山柰酚、百蕊草素Ⅰ和百蕊草素Ⅱ作為測定指標，可以較全面地反映百蕊草野生和栽培藥材質(zhì)量。

本研究以百蕊草栽培和野生藥材為研究對象，采用外標法對兩者的3種活性成分進行測定，結(jié)果表明百蕊草野生品與栽培品中3種成分含量差異較大。以百蕊草素Ⅰ為例，百蕊草栽培品的含量是其野生品的將近2倍，但野生品的紫云英苷含量為栽培品的4.8倍，山柰酚在百蕊草藥材中含量較低，其含量在百蕊草栽培和野生藥材中差異顯著，野生百蕊草藥材山柰酚含量為其栽培品14.33倍，因山柰酚為百蕊草黃酮苷類成分的水解產(chǎn)物，其含量高低受外界環(huán)境條件影響[11]，百蕊草素Ⅰ和紫云英苷的含量在栽培品和野生品中差異顯著，由于中藥藥理作用的發(fā)揮并不依賴于單一化學成份，而是多種活性成分共同作用的結(jié)果。這些結(jié)果提示：基于目前的質(zhì)量評價標準，百蕊草栽培藥材還不能達到藥用要求，百蕊草栽培品與野生品質(zhì)量尚缺乏一致性，百蕊草野生變家種或野生培育還需進一步研究[12-13]。