貉源綠膿桿菌分離鑒定

王建軍，莫玲，郭廣君，韓強(qiáng)，姚春陽，王玉茂

摘要：為確診引起山東省濰坊市某貉子養(yǎng)殖場的主要細(xì)菌性疾病，對該養(yǎng)殖戶送檢的病死貉子進(jìn)行剖檢，根據(jù)病貉的臨床癥狀、病理剖檢變化及其對分離純化的細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)特征觀察、生化試驗、細(xì)菌16S rDNA PCR鑒定、藥物敏感試驗，初步確診為綠膿桿菌感染。藥物敏感試驗結(jié)果表明，分離菌株對恩諾沙星、硫酸粘桿菌素、氟苯尼考中敏，對頭孢噻呋、慶大霉素、替米考星、多西環(huán)素、林可霉素、阿莫西林耐藥。

關(guān)鍵詞：貉;綠膿桿菌;藥敏試驗;PCR鑒定

Isolation and PCR Identification of Pseudomonas Aeruginosa from Raccoon

Wang Jianjun1， Mo Ling1， Guo Guangjun1， Han Qiang2， Yao Chunyang1， Wang Yumao1

（1.Shandong Binzhou Animal Science and Veterinary Medicine Academy; 2. Shandong LVDU Bio-science & Technology Co.， Ltd， Binzhou， Shandong， 256600）

Abstract： In order to diagnose the main bacterial diseases caused by a raccoon dog farm in Weifang City， Shandong Province， the dead raccoon dogs sent by the farmer for examination were dissected. According to the clinical symptoms and pathological changes of the sick raccoon dogs and the morphological characteristics observation， biochemical test， bacterial 16S rDNA PCR identification and drug sensitivity test of the isolated and purified bacteria， it was preliminarily diagnosed as Pseudomonas aeruginosa infection. The results of drug sensitivity test showed that the isolated strains were moderately sensitive to enrofloxacin， Colistin sulfate and florfenicol， but resistant to ceftiofur， gentamicin， timicosin， doxycycline， lincomycin and amoxicillin.

Keywords： Raccoon; Pseudomonas aeruginosa; drug sensitivity test; PCR identification

綠膿桿菌（pseudomonas aeruginosa），又稱銅綠假單胞菌，1882年首先由Gerssard從傷口膿液分離得到[1]，該菌廣泛存在于自然界中，是一種臨床上較為常見的人畜共患條件性致病[2]，主要經(jīng)呼吸道、消化道和接觸等多種途徑易引起多種動物及人原發(fā)或繼發(fā)或混合感染[3]，對多種畜禽均有不同程度的危害[4]，可導(dǎo)致水貂、狐、貉等毛皮動物出血性肺炎或經(jīng)產(chǎn)道感染導(dǎo)致狐貍、貉子的內(nèi)膜炎，經(jīng)創(chuàng)傷感染引起化膿。該病常發(fā)生于溫暖、潮濕的季節(jié)，在我國毛皮動物養(yǎng)殖區(qū)域廣泛流行，其特點是發(fā)病急、病程短、死亡快，多呈地方性暴發(fā)性流行[5]，給毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。

山東省濰坊市某貉子養(yǎng)殖合作社現(xiàn)有養(yǎng)殖量為1，500只，在3月齡出現(xiàn)咳嗽、流鼻涕、個別貉口、鼻有血液流出的疾病，發(fā)展迅速，嚴(yán)重時1d出現(xiàn)100余只發(fā)病，每天出現(xiàn)死亡，嚴(yán)重時日死亡60余只。死亡率在10%～30%左右。給養(yǎng)殖戶造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

對來診病死貉子進(jìn)行病理剖檢，病理變化為肺臟充血、出血，嚴(yán)重的有出血斑，肺臟有明顯的結(jié)節(jié)狀突起，切面流出血樣性泡沫液體。心肌呈松軟狀態(tài)，冠狀溝存在出血點，脾臟腫大、色暗，肺門淋巴結(jié)有出血、水腫變化。腎臟出血、嚴(yán)重的有出血斑。采集剖檢病貉的肺、肝、腎進(jìn)行病原分離和PCR鑒定，現(xiàn)將結(jié)果報告如下：

1 材料與方法

1.1 材料

1）試劑 藥敏紙片，藥敏紙片購自北京天壇生物制品股份有限公司;DNA Marker、Taq酶購自寶生物工程（大連）有限公司;基因組DNA抽提試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自上海華舜生物技術(shù)有限公司。

2）PCR引物設(shè)計 16SrRNA擴(kuò)增引物序列來自參考文獻(xiàn)[7]，引物序列為27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。引物委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

3）培養(yǎng)基 血清瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、5%小牛血清的馬丁液體培養(yǎng)基均由本實驗室自制。

1.2 方法

1）細(xì)菌分離培養(yǎng)、藥敏試驗 將病死貉子肺臟、肝臟、腎臟病料接種于血清瓊脂培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h。挑取典型菌落用生理鹽水稀釋后，涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，平鋪藥敏紙片繼續(xù)培養(yǎng)24h，進(jìn)行抑菌環(huán)直徑測定，根據(jù)參考文獻(xiàn)判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定[8]。并將細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色和鏡檢。

2）生化試驗 將純化菌接種不同生化管，37℃培養(yǎng)24～48h后，觀察生化反應(yīng)特性及氧化酶試驗。

3）PCR鑒定 將純化的單個菌落，接種于含5%小牛血清的馬丁液體培養(yǎng)基中，37℃ 200r/min，振蕩培養(yǎng)18h后，利用基因組DNA、抽提試劑盒（上海華舜生物技術(shù)有限公司）提取分離菌株的基因組DNA作為PCR的模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（50μL）：10×Buffer（含MgCl2）5μL，上、下游引物各2μL（20pmol/L），dNTP 4μL，TagDNA聚合酶0.5μL，模板1μL，加水補(bǔ)足至50μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃ 5min;94℃ 20s，58℃ 30s，72℃ 40s，30個循環(huán)，72℃ 10min。然后用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，并送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序鑒定。將測序結(jié)果與GenBank登錄的綠膿桿菌基因序列同源性進(jìn)行比較。

綠膿桿菌毒力基因的擴(kuò)增反應(yīng)體系（10μL）：2×PCR Mix 5μL，上、下游引物各0.5μL（20pmol/L），模板1μL，加水補(bǔ)足至10μL。反應(yīng)程序為94℃ 3min;94℃ 30s，50℃ 2min，72℃ 2min，35個循環(huán)，72℃10min。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

經(jīng)分離培養(yǎng)后，在營養(yǎng)瓊脂平板上均形成光滑、邊緣平坦、有芳香氣味、有藍(lán)綠色光澤菌落。菌體革蘭氏染色陰性，細(xì)菌桿狀單個或成對排列，無莢膜與芽胞形成。與已報道的文獻(xiàn)中對綠膿桿菌形態(tài)特征的描述基本一致[9]。

2.2 理化特性鑒定

用純化菌進(jìn)行生化反應(yīng)特性測定，本菌能分解葡萄糖、L-精氨酸，不分解乳糖、鼠李糖麥芽糖、菊糖、蔗糖、海澡糖、衛(wèi)矛醇。能液化明膠，不水解淀粉。能利用檸檬酸鹽、乙基酰胺。精氨酸脫氫酶試驗和氧化酶試驗陽性。

2.3 藥敏試驗

用該菌對9種動物常用藥物的進(jìn)行了敏感試驗（表1），細(xì)菌分離物對恩諾沙星、硫酸粘桿菌素、氟笨尼考中敏，對頭孢噻呋、慶大霉素、替米考星、多西環(huán)素、林可霉素、阿莫西林耐藥。

2.4 分離菌株的PCR鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小約為1，436bp，與預(yù)期結(jié)果一致。結(jié)果見圖1。16Sr DNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序后利用Blast進(jìn)行比對，將其與Gen Bank中不同來源的綠膿桿菌參考菌株16Sr DNA序列進(jìn)行同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析，同源性分析結(jié)果顯示該分離菌間的核苷酸序列同源性為99%～100%，表明該分離菌屬于綠膿桿菌。

3 討論與結(jié)論

通過對本次病貉的化驗室診斷，確診本次疫病系綠膿桿菌感染所致。綠膿桿菌是引起毛皮動物肺炎的主要病原菌之一，其感染率和死亡率均較高，嚴(yán)重影響我國毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[10]。隨著集約化毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)不斷發(fā)展，綠膿桿菌引起的出血性肺炎對養(yǎng)殖業(yè)的危害日益嚴(yán)重。

綠膿桿菌在毛皮動物的發(fā)病主要在6～9月份高溫高濕天氣季節(jié)，這次分離菌株對9種常用藥物藥敏結(jié)果表明，分離菌株對恩諾沙星、硫酸粘桿菌素、氟苯尼考中敏，對頭孢噻呋、慶大霉素、替米考星、多西環(huán)素、林可霉素、阿莫西林耐藥。本廠按照藥敏試驗選擇藥物，5d控制了本病。這次9種藥物未發(fā)現(xiàn)敏感藥物，可能是貉子用過相關(guān)藥物，造成了耐藥菌株的產(chǎn)生。因此防控本病時，尤其在高發(fā)季節(jié)，應(yīng)從加強(qiáng)養(yǎng)殖場生物安全措施著手，注重環(huán)境衛(wèi)生及消毒措施的應(yīng)用，保障飼料的新鮮并做好疫苗的防控。

當(dāng)疫情發(fā)生時，迅速做出疫情診斷和藥敏試驗，避免盲目投藥，造成經(jīng)濟(jì)損失。同時，可以參考已有研究的報道，采用中草藥進(jìn)行預(yù)防治療。周琦等[3]研究表明，金銀花、黃柏、板藍(lán)根、訶子、五味子對貉源綠膿桿菌地方流行株體外抑菌效果較好。張玉等[11]研究發(fā)現(xiàn)，中藥石榴皮、烏梅、地榆、五倍子、赤芍、白礬、生地榆、木瓜對臨床分離的致病性水貂源綠膿桿菌吉林株抑菌效果比較好。因此，綠膿桿菌病的預(yù)防需要從管理、消毒和藥物等幾個方面進(jìn)行，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、消毒殺菌、防治結(jié)合以加強(qiáng)本病的防控。

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