褪黑素對豬精液體外保存質(zhì)量影響的研究

張丹，殷茵，劉建文，崔茂盛

摘要：隨著養(yǎng)豬行業(yè)良種化水平逐漸提高和人工授精技術(shù)在集約化養(yǎng)豬場中的推廣與應(yīng)用，精液高效保存技術(shù)越來越受到重視。本文通過試驗的方式在現(xiàn)有豬精液稀釋液中加入0.5、0.8、1.2和2g/L等不同濃度的褪黑素，以豬精子體外存活時間、質(zhì)膜完整性和活率等為評價指標(biāo)，在豬精液體外保存技術(shù)體系下，篩選最佳的褪黑素添加量，同時根據(jù)試驗實際效果，用常溫保存3d的精液進(jìn)行了輸精試驗，驗證該稀釋粉對精子的保護(hù)效果。

關(guān)鍵詞：豬;精液保存;添加褪黑素

目前天津市乃至全國生豬養(yǎng)殖行業(yè)中，種公豬精液利用率不足，大多豬場人工輸精所用精液多數(shù)來自當(dāng)天采集，或來自17℃存儲1～2d的精液;市場上中效、中長效和長效等豬鮮精稀釋粉大部分被養(yǎng)豬發(fā)達(dá)國家所壟斷，價格較高，給養(yǎng)豬生產(chǎn)企業(yè)帶來較大經(jīng)濟(jì)壓力，增加了企業(yè)生產(chǎn)成本。

隨著養(yǎng)豬行業(yè)良種化水平逐漸提高和人工授精技術(shù)在集約化養(yǎng)豬場中的推廣與應(yīng)用，精液高效保存技術(shù)也變得重要，并日益顯示出降低公豬飼養(yǎng)量和飼養(yǎng)成本、加快豬群品種改良、減少疾病傳播等多方面優(yōu)勢;因可通過引進(jìn)優(yōu)秀公豬精液代替引進(jìn)活體公豬，減少了育種成本，故提高優(yōu)秀種公豬精液高效保存與利用技術(shù)意義變得尤為重大。

液態(tài)保存精液具有繁殖成績好、所需費用低、操作程序簡單、能創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)效益等優(yōu)點。因此，近年來常溫保存精液技術(shù)已廣泛應(yīng)用于豬的人工授精中，國內(nèi)外研究者圍繞豬精液常溫保存稀釋液開展了大量的研究工作。目前國內(nèi)外常用的豬精液常溫稀釋液中的主要成分有：稀釋劑、營養(yǎng)劑、保護(hù)劑和抗菌劑。除此之外，稀釋液中含有針對性的抗菌成分可預(yù)防精液中細(xì)菌的生長和生殖性疾病的傳播。稀釋劑中碳酸氫鈉和檸檬酸鈉作為緩沖液。氯化鉀以低濃度用于維持Na+-K+泵，防止細(xì)胞外K+耗竭而使細(xì)胞失去活力。EDTA能捕獲二價的金屬離子，尤其是Ca2+，可能抑制跨膜運動而阻止獲能的啟動和頂體反應(yīng)。稀釋劑中使用EDTA對推廣豬精子液態(tài)保存是很重要的一步。此外，在精液的兩個降溫平衡階段，精子的呼吸代謝會產(chǎn)生大量的活性氧族，其中的氧自由基（O2-、H2O2和-OH）能使精子細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致精子質(zhì)膜損傷[1]。

筆者基于前期在豬精液高效保存技術(shù)的研究成果，在現(xiàn)有豬精液稀釋液中加入0.5、0.8、1.2和2g/L等不同濃度的褪黑素，以豬有效精子數(shù)、畸形率和活率等為評價指標(biāo)，在豬精液體外保存技術(shù)體系下，篩選最佳的褪黑素添加量，同時根據(jù)試驗結(jié)果，用常溫保存3d的精液進(jìn)行了輸精試驗，驗證該稀釋粉對精子的保護(hù)效果。

1 試驗設(shè)計

將采集的精液平均分為兩部分，分別為對照組和試驗組。將對照組的精液采集后用37℃預(yù)熱的BTS稀釋并調(diào)節(jié)精子密度，使稀釋后的精子密度為0.4×108個/mL左右;而試驗組的精液采集后，用以BTS為基礎(chǔ)稀釋液，分別適當(dāng)添加不同濃度0.5、0.8、1.2和2g/L的褪黑素，探討抗氧化劑褪黑素對豬精液保存的效果。精液稀釋比例和對照組相同。

2 精液稀釋與分裝

首先將精液均分為2部分，然后將其中一部分用37℃預(yù)熱的BTS液根據(jù)原精密度、活力、活率等指標(biāo)進(jìn)行稀釋（對照組），使稀釋后的精子密度為0.4×108個/mL左右;另一部分用研發(fā)的稀釋液進(jìn)行稀釋，稀釋比例與對照組相同（試驗組）。將稀釋后的精液在室溫下（26～28℃）放置30min后，分裝于集精瓶中，每瓶分裝80mL。

3 精液保存

精液分裝后，對照組和試驗組各隨機(jī)留出2瓶，放入17℃恒溫箱中保存，每12h翻動一次集精瓶，以防止精子假死。

4 精液質(zhì)量檢測

4.1 有效精子數(shù)和精活力

筆者使用了“自動精液分析儀”，將待使用精液恢復(fù)到室溫后進(jìn)行檢測，以確定其指標(biāo)均在合格范圍內(nèi)。

4.2 精子的畸形率

筆者使用了快速染色法，為樣品染色，檢測精液的畸形率。

5 試驗結(jié)果

本試驗重復(fù)30余次，結(jié)果表明在BTS稀釋液中添加不同劑量的褪黑素均對精液保存有較好影響，其中0.8g/L的褪黑素組對豬鮮精保存效果最好，平均有效保存天數(shù)大于6d。而稀釋液中褪黑素含量達(dá)2g/L時，精液保存質(zhì)量又有所降低，平均有效保存天數(shù)為3d左右，但仍明顯好于對照組（無添加組：2.3d）。

6 結(jié)論與展望

不同品種、不同個體公豬精液質(zhì)量之間差異較大。公豬個體選擇非常重要，包括常規(guī)選擇和精液適用性選擇兩層次。常規(guī)選擇首先包括：年齡在2～4歲，體況：中等偏瘦、四肢健壯有力，性欲較好，無烈性傳染病史;然后，原精質(zhì)量較好：染色乳白色，無黃色或紅色摻雜其中、密度較高，3～5億/mL，氣味：略帶腥味，無惡臭等異常氣味;射精量在200～500mL，精子活率在0.85以上，精子畸形率低于5%等，通過前期試驗，筆者最終選擇了繁殖性能良好、性欲旺盛、沒有遺傳疾病、年齡在2～4歲的5頭種用公豬的精液為研究對象。

筆者根據(jù)試驗結(jié)果繼續(xù)分成試驗組和對照組進(jìn)行進(jìn)一步的驗證。其中試驗組是用稀釋液高倍稀釋后保存3d的精液，對適配母豬人工輸精。而對照組是用當(dāng)天采集的精液進(jìn)行人工輸，稀釋粉為豬場自購某國外品牌。

結(jié)果表明用保存3d的精液進(jìn)行深部輸精，輸精后母豬妊娠率、窩產(chǎn)子數(shù)等繁殖指標(biāo)仍高于對照組，而窩產(chǎn)子數(shù)、窩均初生重及28日齡斷奶體重等生長指標(biāo)與對照組無差異，足以證明合理量的加入褪黑素，對精液的保存以及質(zhì)量均存在有效的提高。

在鮮精保存中長效稀釋粉研發(fā)方面，精子活率維持在60%以上的天數(shù)達(dá)5～7d，效果穩(wěn)定。而且精液保存到3～4d時，精子活力比稀釋后的第1d有明顯提高。深部輸精資料結(jié)果統(tǒng)計表明，豬鮮精高倍稀釋后用保存3d的精液，深部輸精效果優(yōu)于豬場正常輸精組。本項目的研究成果將夠更好服務(wù)于我國生豬企業(yè)的快速、健康發(fā)展。

依據(jù)筆者的研究表明：精子活率維持在60%以上的天數(shù)達(dá)5～7d，效果穩(wěn)定，若公豬精子質(zhì)量本身較高，可以有效保存10d甚至更長時間。豬原精經(jīng)高倍稀釋后，3～4d精子活動能力卻明顯高于稀釋后當(dāng)天的精液，用保存3d的精液深部輸精后，妊娠率、產(chǎn)仔數(shù)等繁殖指標(biāo)高于正常輸精組[2，3]。

我國是養(yǎng)豬大國，豬精液鮮精保存技術(shù)體系及應(yīng)用可為豬場開展雜交改良、品種選育及代替種公豬引進(jìn)、促進(jìn)優(yōu)秀種公豬的種質(zhì)資源跨地域和時空傳播提供技術(shù)保障;中長效稀釋粉的研發(fā)成功，可為廣大的養(yǎng)豬企業(yè)和種公豬站降低飼養(yǎng)規(guī)模，充分發(fā)揮種公豬的種用價值，優(yōu)化豬場生產(chǎn)結(jié)構(gòu)，減少生產(chǎn)成本，提高企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益等多方面都具有重要作用。綜上分析，本項目成果市場推廣應(yīng)用前景廣闊，對畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和科技進(jìn)步具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] 孫琳琳.褪黑素對豬精液常溫保存效果的研究[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)，2020.

[2] 劉兆軍，謝景興，魏寧，等.稀釋劑添加物在豬精液常溫保存中的研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)雜志，2016，35（6）：67-69.

[3] 梅花，韓朝洛蒙，阿露斯，等.淺談褪黑素在動物生產(chǎn)中的作用[J].中國畜禽種業(yè)，2018，14（11）：73.