蘋果糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族篩選鑒定

◎ 闞東揚(yáng)，冉秋月，唐玉鳳，楊潤(rùn)森

（1.昭通學(xué)院 農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 昭通 657000；2.滇東北高原特色農(nóng)業(yè)研究中心，云南 昭通 657000）

可溶性糖積累由合成、降解、轉(zhuǎn)運(yùn)以及貯存等過程共同決定，而較為關(guān)鍵的是轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)[1]，研究糖相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)完善果實(shí)糖品質(zhì)性狀遺傳與發(fā)育機(jī)理具有重要意義[2]，而且糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫方面也起著重要作用。擬南芥作為一種模式植物，在糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白方面的研究已比較成熟，目前從擬南芥中分離出69種相關(guān)的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SWEET）。SWEET基因家族是一類植物己糖和蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，包含4個(gè)亞 家 族[3]，Clade I包 括SWEET1-SWEET3，Clade II包 括SWEET4-SWEET8，Clade III包 括SWEET9-SWEET15，Clade IV包 括SWEET16-SWEET17[4]，目前對(duì)于SWEET基因家族的研究較少。擬南芥中的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不僅能夠參與ABA誘導(dǎo)的糖代謝途徑[5]，而且可受低溫、鹽脅迫等的誘導(dǎo)參與逆境脅迫與糖信號(hào)代謝[6]。糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物碳水化合物的長(zhǎng)距離運(yùn)輸中起重要作用，并參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、能量運(yùn)輸與調(diào)節(jié)，與經(jīng)濟(jì)作物蘋果的產(chǎn)量和品質(zhì)直接相關(guān)[7]。

我國(guó)是蘋果生產(chǎn)大國(guó)，蘋果產(chǎn)量約占世界產(chǎn)量的一半，其中昭通蘋果以富含多種果糖以及微量元素而馳名國(guó)內(nèi)。昭通蘋果產(chǎn)區(qū)與全國(guó)其他蘋果產(chǎn)區(qū)相比，具有明顯的區(qū)位優(yōu)勢(shì)、早熟優(yōu)勢(shì)、生態(tài)優(yōu)勢(shì)和品質(zhì)優(yōu)勢(shì)，為中國(guó)南方高原蘋果優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)基地之一[8]。但昭通地處高寒山區(qū)，早春干旱、冬季過暖，并且冰雹和霜害等災(zāi)害性天氣頻繁發(fā)生，因此對(duì)培育抗逆性強(qiáng)且糖含量高的蘋果品種較為迫切。糖含量是決定蘋果風(fēng)味、品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一，而糖分的積累主要是多種糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白共同協(xié)作的結(jié)果，因此，鑒別這些糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)于蘋果選育和改善含糖量具有重要意義。本研究通過獲取糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列，進(jìn)行糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在逆境脅迫中的基因差異表達(dá)量分析，篩選抗性強(qiáng)的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，旨在為昭通蘋果分子育種和優(yōu)良品種選育提供參考依據(jù)。

1 選定基因家族

選擇擬南芥中糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的基因，通過NCBI，利用database數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其進(jìn)行聚類分析，如圖1。根據(jù)聚類分析圖，將得到的3種基因型植株的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)量數(shù)據(jù)繪圖，如圖2。

圖1 擬南芥糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因聚類分析圖

圖2 3種糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在逆境下表達(dá)量差異圖

由圖2可以看出，在強(qiáng)逆境環(huán)境下野生型植株的3種糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)量相較于突變體植株有極顯著的提高，在低強(qiáng)度逆境下野生型植株的3種糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)量也明顯高于突變體植株，這表明糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與抵御逆境脅迫有明顯的正相關(guān)關(guān)系。

2 蘋果糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白鑒定分析

2.1 蘋果糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族親緣關(guān)系分析

蘋果屬于薔薇科植物，糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族在進(jìn)化上又具有一定的保守性，因此選取擬南芥、其他薔薇科植物以及蘋果，對(duì)它們構(gòu)建糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的進(jìn)化樹，如圖3。

通過構(gòu)建進(jìn)化樹由圖3可以看出，可以看到在進(jìn)化樹上，大于72的區(qū)間內(nèi)，蘋果和擬南芥的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：sweet1、sweet4、sweet1和sweet3具有較近的親緣關(guān)系，在基因的進(jìn)化上具有一定的保守性。

圖3 糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因進(jìn)化樹圖

2.2 蘋果糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白染色體定位

通過對(duì)蘋果和擬南芥糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，sweet4、sweet1進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)蘋果的sweet1與擬南芥的sweet4在序列上有70%的相似性，進(jìn)化樹分析也支持蘋果和擬南芥的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族有較近的親緣關(guān)系，利用GDR（http://www.rosaceae.org/）庫(kù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在蘋果的16號(hào)染色體上存在與擬南芥sweet12具有很高相似性的一段序列，對(duì)其進(jìn)行染色體定位，如圖4所示。

圖4 sweet12在蘋果染色體上的定位圖

由圖4可以看出，該片段在蘋果16號(hào)染色體上，長(zhǎng)度約為2.2 kb，并鑒定出其相應(yīng)的內(nèi)含子與外顯子。

3 結(jié)論與討論

3.1 糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與抵御逆境脅迫有正相關(guān)關(guān)系

聚類分析表明，糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族與抗植物逆境脅迫有明顯的正相關(guān)關(guān)系，研究糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在不同時(shí)期、不同植物體內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量變化有助于人們更好地認(rèn)識(shí)植物與環(huán)境之間的互動(dòng)。

3.2 蘋果和擬南芥的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有較近的親緣關(guān)系

通過構(gòu)建糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)蘋果和擬南芥的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族具有較近的親緣關(guān)系，這為研究蘋果糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族提供了相近的模式植物，為蘋果糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的研究以及功能鑒定提供了便利。

3.3 SWEEET12可能是參與抵御逆境脅迫的關(guān)鍵酶基因

通過對(duì)擬南芥糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族序列的聚類比對(duì)，可以看出AtSWEEET12與抵御逆境脅迫有著明顯的正相關(guān)關(guān)系，說明SWEEET12極有可能是參與抵御逆境脅迫的關(guān)鍵酶基因。已有研究證明，蘋果糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因與擬南芥AtSWEET成員蛋白在同一個(gè)進(jìn)化枝上，參與糖代謝相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)功能[9]，MdSWEET12基因染色體定位預(yù)測(cè)結(jié)果也證實(shí)SWEET12基因在蘋果16號(hào)染色體上。利用NCBI上的擬南芥AtSWEEET12蛋白序列Blast比對(duì)蘋果基因組中MdSWEEET12，后續(xù)可對(duì)其進(jìn)行亞細(xì)胞定位、定量表達(dá)分析等一系列研究，進(jìn)一步分析其在蘋果中的功能，為蘋果育種和優(yōu)良品種選育奠定基礎(chǔ)。