◎ 闞東揚,冉秋月,唐玉鳳,楊潤森
(1.昭通學(xué)院 農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,云南 昭通 657000;2.滇東北高原特色農(nóng)業(yè)研究中心,云南 昭通 657000)
可溶性糖積累由合成、降解、轉(zhuǎn)運以及貯存等過程共同決定,而較為關(guān)鍵的是轉(zhuǎn)運環(huán)節(jié)[1],研究糖相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白對完善果實糖品質(zhì)性狀遺傳與發(fā)育機理具有重要意義[2],而且糖轉(zhuǎn)運蛋白在植物應(yīng)對逆境脅迫方面也起著重要作用。擬南芥作為一種模式植物,在糖轉(zhuǎn)運蛋白方面的研究已比較成熟,目前從擬南芥中分離出69種相關(guān)的糖轉(zhuǎn)運蛋白(SWEET)。SWEET基因家族是一類植物己糖和蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白,包含4個亞 家 族[3],Clade I包 括SWEET1-SWEET3,Clade II包 括SWEET4-SWEET8,Clade III包 括SWEET9-SWEET15,Clade IV包 括SWEET16-SWEET17[4],目前對于SWEET基因家族的研究較少。擬南芥中的糖轉(zhuǎn)運蛋白不僅能夠參與ABA誘導(dǎo)的糖代謝途徑[5],而且可受低溫、鹽脅迫等的誘導(dǎo)參與逆境脅迫與糖信號代謝[6]。糖轉(zhuǎn)運蛋白在植物碳水化合物的長距離運輸中起重要作用,并參與植物的生長發(fā)育、能量運輸與調(diào)節(jié),與經(jīng)濟作物蘋果的產(chǎn)量和品質(zhì)直接相關(guān)[7]。
我國是蘋果生產(chǎn)大國,蘋果產(chǎn)量約占世界產(chǎn)量的一半,其中昭通蘋果以富含多種果糖以及微量元素而馳名國內(nèi)。昭通蘋果產(chǎn)區(qū)與全國其他蘋果產(chǎn)區(qū)相比,具有明顯的區(qū)位優(yōu)勢、早熟優(yōu)勢、生態(tài)優(yōu)勢和品質(zhì)優(yōu)勢,為中國南方高原蘋果優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)基地之一[8]。但昭通地處高寒山區(qū),早春干旱、冬季過暖,并且冰雹和霜害等災(zāi)害性天氣頻繁發(fā)生,因此對培育抗逆性強且糖含量高的蘋果品種較為迫切。糖含量是決定蘋果風(fēng)味、品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一,而糖分的積累主要是多種糖轉(zhuǎn)運蛋白共同協(xié)作的結(jié)果,因此,鑒別這些糖轉(zhuǎn)運蛋白對于蘋果選育和改善含糖量具有重要意義。本研究通過獲取糖轉(zhuǎn)運蛋白序列,進(jìn)行糖轉(zhuǎn)運蛋白在逆境脅迫中的基因差異表達(dá)量分析,篩選抗性強的糖轉(zhuǎn)運蛋白基因,旨在為昭通蘋果分子育種和優(yōu)良品種選育提供參考依據(jù)。
選擇擬南芥中糖轉(zhuǎn)運蛋白家族的基因,通過NCBI,利用database數(shù)據(jù)庫對其進(jìn)行聚類分析,如圖1。根據(jù)聚類分析圖,將得到的3種基因型植株的糖轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)量數(shù)據(jù)繪圖,如圖2。
圖1 擬南芥糖轉(zhuǎn)運蛋白基因聚類分析圖
圖2 3種糖轉(zhuǎn)運蛋白在逆境下表達(dá)量差異圖
由圖2可以看出,在強逆境環(huán)境下野生型植株的3種糖轉(zhuǎn)運蛋白基因表達(dá)量相較于突變體植株有極顯著的提高,在低強度逆境下野生型植株的3種糖轉(zhuǎn)運蛋白基因表達(dá)量也明顯高于突變體植株,這表明糖轉(zhuǎn)運蛋白與抵御逆境脅迫有明顯的正相關(guān)關(guān)系。
蘋果屬于薔薇科植物,糖轉(zhuǎn)運蛋白家族在進(jìn)化上又具有一定的保守性,因此選取擬南芥、其他薔薇科植物以及蘋果,對它們構(gòu)建糖轉(zhuǎn)運蛋白基因的進(jìn)化樹,如圖3。
通過構(gòu)建進(jìn)化樹由圖3可以看出,可以看到在進(jìn)化樹上,大于72的區(qū)間內(nèi),蘋果和擬南芥的糖轉(zhuǎn)運蛋白:sweet1、sweet4、sweet1和sweet3具有較近的親緣關(guān)系,在基因的進(jìn)化上具有一定的保守性。
圖3 糖轉(zhuǎn)運蛋白基因進(jìn)化樹圖
通過對蘋果和擬南芥糖轉(zhuǎn)運蛋白基因,sweet4、sweet1進(jìn)行序列比對,發(fā)現(xiàn)蘋果的sweet1與擬南芥的sweet4在序列上有70%的相似性,進(jìn)化樹分析也支持蘋果和擬南芥的糖轉(zhuǎn)運蛋白基因家族有較近的親緣關(guān)系,利用GDR(http://www.rosaceae.org/)庫進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在蘋果的16號染色體上存在與擬南芥sweet12具有很高相似性的一段序列,對其進(jìn)行染色體定位,如圖4所示。
圖4 sweet12在蘋果染色體上的定位圖
由圖4可以看出,該片段在蘋果16號染色體上,長度約為2.2 kb,并鑒定出其相應(yīng)的內(nèi)含子與外顯子。
聚類分析表明,糖轉(zhuǎn)運蛋白家族與抗植物逆境脅迫有明顯的正相關(guān)關(guān)系,研究糖轉(zhuǎn)運蛋白基因在不同時期、不同植物體內(nèi)的相對表達(dá)量變化有助于人們更好地認(rèn)識植物與環(huán)境之間的互動。
通過構(gòu)建糖轉(zhuǎn)運蛋白基因進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)蘋果和擬南芥的糖轉(zhuǎn)運蛋白家族具有較近的親緣關(guān)系,這為研究蘋果糖轉(zhuǎn)運蛋白家族提供了相近的模式植物,為蘋果糖轉(zhuǎn)運蛋白家族的研究以及功能鑒定提供了便利。
通過對擬南芥糖轉(zhuǎn)運蛋白家族序列的聚類比對,可以看出AtSWEEET12與抵御逆境脅迫有著明顯的正相關(guān)關(guān)系,說明SWEEET12極有可能是參與抵御逆境脅迫的關(guān)鍵酶基因。已有研究證明,蘋果糖轉(zhuǎn)運蛋白基因與擬南芥AtSWEET成員蛋白在同一個進(jìn)化枝上,參與糖代謝相關(guān)轉(zhuǎn)運功能[9],MdSWEET12基因染色體定位預(yù)測結(jié)果也證實SWEET12基因在蘋果16號染色體上。利用NCBI上的擬南芥AtSWEEET12蛋白序列Blast比對蘋果基因組中MdSWEEET12,后續(xù)可對其進(jìn)行亞細(xì)胞定位、定量表達(dá)分析等一系列研究,進(jìn)一步分析其在蘋果中的功能,為蘋果育種和優(yōu)良品種選育奠定基礎(chǔ)。