加味藿香正氣丸中5種重金屬殘留量測(cè)定及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

袁秀澤，黃招光，朱建蒙，周云峰

(1.淳安縣第一人民醫(yī)院，浙江 杭州 311700；2.宜春市食品藥品檢驗(yàn)所，江西 宜春 336000)

加味藿香正氣丸是由廣藿香、紫蘇葉、白芷、白術(shù)(炒)、陳皮、半夏(制)、厚樸(姜制)、茯苓、桔梗、甘草等中藥組成的復(fù)方制劑，其大蜜丸和水丸收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第二十冊(cè)[1]，濃縮丸收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十四冊(cè)[2]，具有解表化濕、理氣和中的功效，臨床主要用于外感風(fēng)寒、內(nèi)傷濕滯、頭痛昏重、胸膈痞悶、脘腹脹痛、嘔吐泄瀉等癥狀[1-2]。在現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，加味藿香正氣丸控制指標(biāo)單一，相關(guān)文獻(xiàn)也只對(duì)相關(guān)藥材有效成分的含量測(cè)定進(jìn)行過(guò)研究，對(duì)制劑中藥外源性污染因素如重金屬幾乎沒(méi)有報(bào)道，而方中含有白芷、白術(shù)(炒)、半夏(制)、桔梗、甘草等植物的根或根莖部位，重金屬易在根或根莖部位吸收富集[3-7]，很有可能將質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)引入成藥中。為了保證成品的療效和用藥安全，有必要對(duì)加味藿香正氣丸外源性有害元素重金屬進(jìn)行安全性限量檢查?；诖?，本文采用采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)測(cè)定加味藿香正氣丸中銅(Cu)、砷(As)、鎘(Cd)、汞(Hg)、鉛(Pb)五種重金屬的殘留量，對(duì)其帶來(lái)的健康安全風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估，為中藥復(fù)方制劑安全評(píng)價(jià)及有害元素殘留限度控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Mars 6 微波消解儀(美國(guó)CEM公司)；Nexlon 305D 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國(guó)PerkinElmer公司)。加味藿香正氣丸共23批，購(gòu)自16個(gè)廠家(A～P)。鎘標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(批號(hào)B1803129，100 mg/L)、砷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(批號(hào)B1803079，100 mg/L)、汞標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(批號(hào)B1810088，1 000 mg/L)、鉛標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(批號(hào)B1805054，1 000 mg/L)、銅標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(批號(hào)B1706021，1 000 mg/L)均來(lái)源于壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；鉍、鈰、鐵、銦、鋰、鎂、鉛、鈾優(yōu)化調(diào)諧液(1 μg/L)，鉍、鍺、銦、鋰、鈧、鋱、釔內(nèi)標(biāo)混合液(10 mg/L)，金元素標(biāo)準(zhǔn)液(1 000 mg/L)均購(gòu)于美國(guó)珀金埃爾默公司；柑橘葉成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW10020)購(gòu)于中國(guó)地質(zhì)科學(xué)院地球物理地球化學(xué)勘查研究所。優(yōu)級(jí)純硝酸購(gòu)于太倉(cāng)滬試劑有限公司；水為純化水。

1.2 儀器參數(shù) Standard 掃描模式；檢測(cè)器雙模式；等離子體射頻功率1 200 W；等離子氣體積流量18 L/min，霧化器體積流量0.98 L/min，輔助氣體積流量1.2 L/min。數(shù)據(jù)采集重復(fù)次數(shù)3次，停留時(shí)間50 ms，積分時(shí)間1 000 ms，測(cè)試時(shí)選取的同位素63Cu和75As分別以89Y 和111Cd、115In為內(nèi)標(biāo)，202Hg和208Pb以209Bi 為內(nèi)標(biāo)。

1.3 溶液的制備

1.3.1 內(nèi)標(biāo)溶液 精密量取內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液適量，10%硝酸制成質(zhì)量濃度為10 μg/L的溶液，即得。

1.3.2 對(duì)照品溶液 精密量取重金屬標(biāo)準(zhǔn)液適量，10%硝酸稀釋成含銅(5、20、40、100、200 μg/L)、汞(0.25、0.5、1、4、10 μg/L)、鎘(1、2、4、10、20 μg/L)、砷(1、5、10、20、40 μg/L)、鉛(1、4、10、20、40 μg/L)的溶液，即得。

1.3.3 供試品溶液 取重量差異下丸劑，研細(xì)或剪細(xì)后稱取約0.4 g，置于聚四氟乙烯消解罐中，加8 mL硝酸，混勻，蓋上內(nèi)蓋，旋緊外套，過(guò)夜，置于微波消解儀內(nèi)進(jìn)行消解，程序見表1，待溫度低于60 ℃時(shí)取出消解罐，消解液轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用水多次清洗消解罐，合并洗液，加入金單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 μg/mL)200 μL，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。稱取柑橘葉成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)約0.2 g，同法制備相應(yīng)溶液。再制備空白溶液(不加金元素)。

表1 微波消解程序

1.3.4 樣品測(cè)定 將儀器的樣品管依次插入不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液中，內(nèi)標(biāo)溶液通過(guò)蠕動(dòng)泵在線加入，以各重金屬與對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物計(jì)數(shù)值的比值為縱坐標(biāo)(Y)，其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，在“1.2”項(xiàng)儀器參數(shù)下進(jìn)樣測(cè)定。在相同分析條件下進(jìn)行空白試驗(yàn)，以扣除空白干擾。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系考察 按“1.3.4”項(xiàng)下方法測(cè)定空白溶液10次，以各重金屬信號(hào)響應(yīng)值的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差所對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度作為檢出限，結(jié)果見表2，可知各重金屬在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系客良好。

表2 各重金屬線性關(guān)系

2.2 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液適量，在“1.2”項(xiàng)儀器參數(shù)下進(jìn)樣測(cè)定6次，結(jié)果見表3，可知儀器精密度良好。稱取6份丸劑(編號(hào)20)，在“1.2”項(xiàng)儀器參數(shù)下進(jìn)樣測(cè)定6次，結(jié)果見表3，可知該方法重復(fù)性良好。取同一份丸劑(編號(hào)20)，于0、1、2、8 h在“1.2”項(xiàng)儀器參數(shù)下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見表3，可知溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3 各重金屬精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 回收率試驗(yàn) 取各重金屬含量已知的丸劑(編號(hào)20)，研細(xì)，精密稱取約0.2 g，置于聚四氟乙烯消解罐中，精密加入對(duì)照品溶液(銅4 000 μg/L、砷1 000 μg/L、鎘600 μg/L、汞150 μg/L、鉛1 000 μg/L)0.5 mL，混勻，制得加樣回收溶液，平行6次，計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。選擇柑橘葉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為對(duì)照，以實(shí)際測(cè)得值與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中各重金屬真實(shí)值進(jìn)行比對(duì)，見表5，可知該方法具有良好的準(zhǔn)確性。

表4 各重金屬回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表5 各重金屬標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

2.4 樣品殘留量測(cè)定 結(jié)果見表6。

表6 各重金屬殘留量測(cè)定結(jié)果(mg/kg，n=2)

2.5 非致癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 非致癌性風(fēng)險(xiǎn)是指有毒有害物質(zhì)進(jìn)入人體，其劑量高于不良反應(yīng)閾值時(shí)，會(huì)對(duì)人體健康造成可探查到的危害。以銅、砷、鎘、汞、鉛為代表的有害元素是中藥最主要的外源性污染物之一[8-9]，容易在人體器官和組織如皮膚、肝臟、腎臟等蓄積，造成中毒損傷。采用美國(guó)環(huán)境保護(hù)署推薦的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估(HRA)模型、美國(guó)毒物與疾病登記署提出的靶器官毒性劑量(TTD)模型，進(jìn)行非致癌健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

HRA模型為計(jì)算各重金屬的日均暴露量(ADD)、危害系數(shù)(HQ)、風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)(HI)，并將HI值與風(fēng)險(xiǎn)閾值(1.00)進(jìn)行比較，公式為ADD=F×C/BW、HQ=ADD/ADI、HI=ΣHQ=HQ1+ HQ2+……+ HQn，其中F為藥品每日服用量，單位為g，根據(jù)規(guī)定用量，加味藿香正氣丸每次6 g，每天2次；C為重金屬殘留值，加味藿香正氣丸中銅、鎘、砷、汞、鉛平均殘留量分別為4.82、0.06、0.26、0.28、1.51 mg/kg；BW是人體的平均體質(zhì)量，此處采用國(guó)際通用標(biāo)準(zhǔn)，即成人55.9 kg，兒童32.7 kg；ADI為聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)發(fā)布的每千克體質(zhì)量每日可接受攝入量[10-11]，銅、鎘、砷、汞、鉛該數(shù)值分別為50、0.83、2.1、0.57、3.6 μg/kg。結(jié)果，成人重金屬銅、鎘、砷、汞、鉛日均暴露量(ADD)分別為1.034、0.013、0.056、0.060、0.324 μg/kg，HQ值分別為0.026、0.016、0.027、0.105、0.090，HI為0.264，而兒童HI為0.451；5種重金屬風(fēng)險(xiǎn)依次為汞>鉛>砷>銅>鎘，即加味藿香正氣丸重金屬及有害元素的HI均小于1，表明該品種不存在非致癌風(fēng)險(xiǎn)。

TTD模型[12]為當(dāng)重金屬濃度超過(guò)某一靶器官產(chǎn)生敏感效應(yīng)的閾值時(shí)，也可能會(huì)對(duì)其他靶器官產(chǎn)生毒性效應(yīng)[13]。鎘產(chǎn)生效應(yīng)的靶器官為腎臟、血液、神經(jīng)系統(tǒng)、睪丸，鉛產(chǎn)生效應(yīng)的靶器官為腎臟、血液、神經(jīng)系統(tǒng)、睪丸，砷產(chǎn)生效應(yīng)的靶器官為腎臟、血液、皮膚、神經(jīng)系統(tǒng)。在對(duì)重金屬進(jìn)行非致癌健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)時(shí)，由于各重金屬的靶器官和在靶器官中的相互作用是非常必要的，故采用TTD模型將重金屬能夠生效應(yīng)的靶器官均考慮在內(nèi)，進(jìn)行非致癌健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估(成人)，公式為HQ=ADD /TTD，其中TTD為有害元素每天對(duì)靶器官的毒性劑量，結(jié)果見表7。腎臟、血液、神經(jīng)均為3種或3種以上重金屬共同作用的靶器官，考慮到重金屬在三者中的相加作用，測(cè)得砷、鎘、鉛的HIAs+Cd+Pb值分別為0.579 91、0.187 28、0.329 37，根據(jù)皮膚和睪丸的HI值(分別為0.186 67、0.023 77)可知，3種重金屬毒性效應(yīng)的疊加HI值為1.307，而兒童為2.234，可知在未疊加銅、汞的毒性效應(yīng)下已超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)閾值(1.000)，表明加味藿香正氣丸中5種重金屬殘留量所產(chǎn)生的共同毒性效應(yīng)超過(guò)非致癌健康風(fēng)險(xiǎn)安全閾值，對(duì)成人、兒童都具有非致癌健康風(fēng)險(xiǎn)。

表7 各重金屬TTD值、HQ值、HI值測(cè)定結(jié)果(成人)

2.6 重金屬殘留限量制訂 在2020年版《中國(guó)藥典》一部中，只對(duì)加味藿香正氣丸組方藥材中甘草、白芷所含的重金屬進(jìn)行檢查[14]，其限量規(guī)定為鉛不得超過(guò)5 mg/kg，鎘不得超過(guò)1 mg/kg，砷不得超過(guò)2 mg/kg，汞不得超過(guò)0.2 mg/kg，銅不得超過(guò)20 mg/kg，按此限度評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)23批樣品中有9批汞超標(biāo)，超標(biāo)率為39.1%；有1批鉛超標(biāo)，超標(biāo)率為4.3%。但加味藿香正氣丸是由多味藥材組成的中藥復(fù)方制劑，服用劑量與單一藥材攝入量會(huì)有差別，故僅依據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)可能不夠準(zhǔn)確。

2020年版《中國(guó)藥典》四部規(guī)定，中藥注射劑中銅、砷、鎘、汞、鉛每日最大允許暴露量分別為150、6、3、2、12 μg[15]?？诜o藥與注射給藥的劑量關(guān)系為以口服量為100時(shí)，皮下注射量為30～50，肌肉注射量為20～30，靜脈注射量為25[16]，按照注射/5倍最大口服吸收產(chǎn)生同等效應(yīng)折算，口服制劑中銅、砷、鎘、汞、鉛的每日最大允許暴露量分別為750、30、15、10、60 μg；加味藿香正氣丸日服用量為12 g，則五者限度分別為62.50、2.50、1.25、0.83、5.00 mg/kg，可知23批樣品中有2批汞超標(biāo)，有1批鉛超標(biāo)，共3批超過(guò)擬定限度。

另外，還可采用聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)和美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生基金會(huì)發(fā)布的數(shù)據(jù)，來(lái)計(jì)算加味藿香正氣丸中有害重金屬殘留量閾值[17](MRL)，公式為MRL=ADI×BW×10%/F，結(jié)果成人耐受銅、砷、鎘、汞、鉛的MRL分別為23.29、0.99、0.39、0.27、1.68 mg/kg，兒童分別為13.62、0.58、0.23、0.16、0.98 mg/kg。按照此標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)23批樣品，發(fā)現(xiàn)成人服用時(shí)有1批砷超標(biāo)，7批汞超標(biāo)，5批鉛超標(biāo)，超標(biāo)率分別為4.3%、30.4%、21.7%；兒童服用時(shí)有1批砷超標(biāo)，9批汞超標(biāo)，11批鉛超標(biāo)，超標(biāo)率分別為4.3%、39.1%、47.8%。

3 結(jié)論

采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定加味藿香正氣丸中重金屬的殘留量，方法學(xué)考察良好，適用于銅、砷、鎘、汞、鉛五種有害元素的測(cè)定。通過(guò)樣品測(cè)定和分析可知，經(jīng)過(guò)TTD 法修正后，加味藿香正氣丸中所殘留的重金屬有害元素對(duì)人體非致癌健康風(fēng)險(xiǎn)超過(guò)安全閾值，同時(shí)對(duì)加味藿香正氣丸重金屬殘留限量進(jìn)行擬定時(shí)，不少樣品的重金屬殘留量超過(guò)MRL，這表明，重金屬外源性污染總體上帶來(lái)一定安全風(fēng)險(xiǎn)，兒童的風(fēng)險(xiǎn)率高于成人。建議企業(yè)應(yīng)加強(qiáng)質(zhì)量管理和風(fēng)險(xiǎn)把控，重視重金屬外源性污染帶來(lái)的健康安全問(wèn)題，把控原料藥材和飲片質(zhì)量，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，從源頭上減少中成藥重金屬污染的風(fēng)險(xiǎn)。