短梗菝葜乙酸乙酯部位抗腫瘤活性譜效關(guān)系

陳藝粼，晁利芹，蘇秀紅,3*，董誠(chéng)明,3，蘭金旭,3，陳隨清,3

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院，河南 鄭州 450046；3.呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046)

短梗菝葜(SmilaxscobinicaulisC.H.Wright)，又名黑刺菝葜，其根及根莖入藥，在我國(guó)北方作為鐵絲靈仙藥用也已有多年歷史，具有祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)、解毒散結(jié)等功效，臨床用于治療風(fēng)濕痹痛，關(guān)節(jié)不利、瘡癤、腫毒、瘰疬、癌癥等功效[1-3]。從短梗菝葜正丁醇部位中提取分離出少數(shù)甾體皂苷類單體成分具有體外抗腫瘤活性[2]，但關(guān)于短梗菝葜更多抗腫瘤活性成分的篩選研究較少，且未闡明其作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

中藥材種類多，成分復(fù)雜，其功效是多種化學(xué)成分共同作用的結(jié)果，中藥指紋圖譜是對(duì)中藥整體的化學(xué)成分組成的質(zhì)量控制，與中藥的功效沒有直接的內(nèi)在聯(lián)系，而建立中藥指紋圖譜譜效關(guān)系，將指紋圖譜中化學(xué)成分的變化與藥效結(jié)合，可更好的對(duì)中藥的質(zhì)量控制和藥效評(píng)價(jià)[4]。

對(duì)短梗菝葜不同提取部位，采用MTT法，考察各部位對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞、人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞、人胃癌MGC80-3細(xì)胞存活率影響，并確定其抗腫瘤活性部位；建立活性部位指紋圖譜，通過指紋圖譜特征與藥效的之間的相關(guān)性，并運(yùn)用偏最小二乘法，構(gòu)建譜效關(guān)系，初步確定具體發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，為短梗菝葜質(zhì)量控制和臨床應(yīng)用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 短梗菝葜產(chǎn)地見表1，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)蘇秀紅教授鑒定為百合科菝葜屬短梗菝葜SmilaxscobinicaulisC.H.Wright的根及根莖。

表1 短梗菝葜產(chǎn)地

1.2 細(xì)胞 人肝癌SMMC-7721細(xì)胞、人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞、人胃癌MGC80-3細(xì)胞，由河南中醫(yī)藥大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.3 儀器 e2695-2489型高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；MS105DU電子分析天平(萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司)；VARIOSKAN LUX型自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛世爾公司)；AE2000倒置顯微鏡(德國(guó)Motic公司)；371型CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher Scilentific公司)；EYELAN-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、FDU-1200型冷凍干燥機(jī)(上海愛朗儀器有限公司)。

1.4 試劑 胎牛血清(批號(hào)SA190501)、MEM培養(yǎng)基(批號(hào)WH0111201911SP)(武漢普諾賽生命科技有限公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(批號(hào)20191129)、噻唑藍(lán)(MTT，批號(hào)725C0511)、DMSO(批號(hào)11001G031)、0.25%胰酶(批號(hào)20150302)、青霉素-鏈霉素混合液(雙抗)(批號(hào)20190712)(北京索萊寶科技有限公司)。白藜蘆醇(純度≥98%)。乙腈為色譜純；水為超純水；其余試劑為分析純。

2 方法

2.1 抗腫瘤活性部位篩選

2.1.1 樣品制備 稱取藥材粉末(S1，過四號(hào)篩)100 g，加入70%乙醇，在料液比1∶10條件下回流提取3次，每次1.5 h，冷卻，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇，得到乙醇總提物，蒸干后加200 mL熱水，取1/5作為乙醇總提取液，剩余4/5依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取至近無色為止，減壓回收各部位萃取液，浸膏加適量水成混懸液，置于超低溫冰箱中保存3 d，放置冷凍干燥機(jī)中1 d，得到乙醇總提物(得率0.519%)、石油醚部位(得率0.159%)、乙酸乙酯部位(得率1.27%)、正丁醇部位(得率2.812%)、剩余液(得率1.672%)，加入DMSO至0.1 g/mL，臨用前用培養(yǎng)基稀釋成不同質(zhì)量濃度的供試液，所含DMSO的體積分?jǐn)?shù)不超過千分之一。

2.1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 在5%CO2、37 ℃下，用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞，含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)A549、MGC80-3細(xì)胞。

2.1.3 MTT法 參考文獻(xiàn)[5-8]報(bào)道，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721、A549、MGC80-3細(xì)胞用0.25%胰酶消化成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸棄原培養(yǎng)液，加入含不同質(zhì)量濃度藥物的培養(yǎng)基，每種藥物設(shè)5個(gè)，分別為12.5、25、50、75、100 μg/mL，每孔100 μL，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，只加入等體積的無血清培養(yǎng)基。于給藥48 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，混勻后置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，吸棄各孔中上清液，加入150 μL DMSO，振蕩混勻15 min，待其各孔中的紫色結(jié)晶完全溶解后置于自動(dòng)酶標(biāo)儀中，測(cè)定各孔光密度(OD值，波長(zhǎng)490 nm)，重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

2.2 HPLC指紋圖譜建立

2.2.1 色譜條件 ZORBAX SB C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(0～15 min，5%～10%A；15～35 min，10%～15%A；35～55 min，15%～20%A；55～90 min，20%～30%A；90～105 min，30%～33%A)；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取白藜蘆醇適量，加甲醇溶解，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備乙酸乙酯部位，稱取10 mg，定容至2 mL量瓶中，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液(S1)，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，以10號(hào)峰白藜蘆醇為參照，測(cè)得22個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于2%，相對(duì)峰面積RSD均小于5%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批藥材粉末6份(S1)，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以10號(hào)峰白藜蘆醇為參照，測(cè)得22個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于2%，相對(duì)峰面積RSD均小于5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液(S1)，于0、4、8、12、16、24 h在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以10號(hào)峰白藜蘆醇為參照，測(cè)得22個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于2%，相對(duì)峰面積RSD均小于5%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 乙酸乙酯部位對(duì)MGC80-3細(xì)胞存活率的影響 按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，得到乙酸乙酯部位(100 μg/mL)，采用MTT法測(cè)定它對(duì)人胃癌MGC80-3細(xì)胞的存活率。

2.4 譜效關(guān)系研究 采用偏最小二乘法進(jìn)行相關(guān)性分析，以指紋圖譜中各共有峰的峰面積為自變量X，MGC80-3腫瘤細(xì)胞存活率為因變量Y，通過SIMCA-P 13.0軟件對(duì)其進(jìn)行偏最小二乘回歸分析，建立回歸方程。

3 結(jié)果

3.1 不同提取部位對(duì)細(xì)胞存活率的影響

3.1.1 SMMC-7721細(xì)胞 石油醚、乙酸乙酯部位對(duì)SMMC-7721細(xì)胞存活率均具有不同程度的抑制作用，與對(duì)照品比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2，IC50值分別為84.47、47.71 μg/mL，見表3。其中，乙酸乙酯部位抑制作用最強(qiáng)，乙醇提取物和剩余物均無抑制作用，正丁醇部位反而可促進(jìn)其增殖，見圖1。

3.1.2 A549細(xì)胞 不同提取部位對(duì)A549細(xì)胞的存活率與對(duì)照品比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。乙酸乙酯部位具有明顯的抑制作用，IC50值為71.98 μg/mL，最大抑制濃度為100 μg/mL，細(xì)胞存活率為40.05%，呈量效關(guān)系；乙醇提取物、正丁醇部位、剩余物均無抑制作用或促進(jìn)其增殖，見圖1。

3.1.3 MGC80-3細(xì)胞 不同提取部位對(duì)MGC80-3細(xì)胞存活率均具有不同程度的抑制作用，與對(duì)照品比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。細(xì)胞存活率均在80%以下，乙酸乙酯部位具有明顯的抑制作用，并呈劑量依賴性，IC50為27.87 μg/mL，見表3。乙醇提取物、石油醚部位、正丁醇部位和剩余液對(duì)該細(xì)胞的抑制作用及變化不明顯，均未達(dá)到50%，見圖1。

圖1 不同提取部位對(duì)細(xì)胞存活率的影響

表2 不同提取部位對(duì)細(xì)胞存活率的影響

表3 不同提取部位對(duì)細(xì)胞的IC50值

3.1.4 小結(jié) 乙酸乙酯部位對(duì)MGC80-3細(xì)胞較敏感，抑制作用較強(qiáng)，最大抑制濃度為100 μg/mL，故選擇其進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2 圖譜生成 按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液制備10批樣品的供試品溶液，各取10 μL，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，將相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2012.130723版本)，設(shè)置S1圖譜為參照，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.1，得到指紋圖譜(圖2)，確定22個(gè)共有峰，以10號(hào)峰白藜蘆醇為參照，發(fā)現(xiàn)各共有峰相對(duì)保留時(shí)間一致，但相對(duì)峰面積RSD、峰面積值差異較大，表明不同產(chǎn)地藥材主要成分含量具有一定差異，見表4～5。除S3、S5外，其他8批藥材相似度均在0.9以上，見表6。

圖2 10批樣品HPLC指紋圖譜

表4 乙酸乙酯部位共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表5 乙酸乙酯部位共有峰相對(duì)峰面積

表6 10批樣品相似度

3.3 對(duì)MGC80-3細(xì)胞存活率的影響 10批樣品乙酸乙酯部位均有較好抑制腫瘤的作用，與對(duì)照品比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，以S1最強(qiáng)，見表7。

表7 10批樣品乙酸乙酯部位對(duì)MGC80-3細(xì)胞存活率的影響

3.4 譜效關(guān)系研究

3.4.1 偏最小二乘回歸方程 通過SIMCA-P 13.0軟件進(jìn)行偏最小二乘回歸分析[9-11]，得方程為Y=0.177 3X1+0.295 8X2+0.035 2X3-0.217 4X4-0.173 7X5+0.016 0X6+0.465 4X7+0.342 8X8-0.016 4X9+0.034 1X10+0.150 5X11+0.178 7X12-0.352 2X13+0.097 8X16-0.148 7X17-0.060 5X18-0.300 1X19-0.036 4X20-0.421 2X21-0.123 9X22，回歸系數(shù)見圖3。由此可知，峰1、2、3、6、7、8、10、11、12、14、15、16、20與藥效呈正相關(guān)，貢獻(xiàn)度依次為為7>8>15>2>12>1>11>16>20>3>10>6；峰4、5、9、13、17、18、19、21、22與藥效呈負(fù)相關(guān)，貢獻(xiàn)度依次為21>13>19>4>5>17>22>18>9>14。

圖3 各共有峰偏最小二乘回歸系數(shù)

3.4.2變量重要性 變量投影重要性(VIP值)分析結(jié)果見圖4，可知X1、X2、X4、X7、X13、X17、X18、X19、X21的VIP值大于1，依次為X21>X7>X1>X19>X18>X4>X2、X17>X13，其中X1、X2、X7與藥效呈正相關(guān)，VIP值也較大，而X4、X13、X17、X18、X19、X21與藥效呈負(fù)相關(guān)；R2X=0.918，R2X=1，Q2=0.734，表明該模型擬合解釋、模型預(yù)測(cè)能力較強(qiáng)。

圖4 各共有峰的變量重要性

4 討論

本實(shí)驗(yàn)以SMMC-7721、A549、MGC80-3細(xì)胞為篩選模型，以抗腫瘤活性為指標(biāo)，對(duì)短梗菝葜不同提取部位進(jìn)行抗腫瘤活性篩選，結(jié)果抗腫瘤活性物質(zhì)主要存在于乙酸乙酯部位，對(duì)3種腫瘤細(xì)胞均具有抑制作用，但不同腫瘤細(xì)胞株對(duì)同一藥物的敏感性不同，最佳細(xì)胞敏感株為MGC80-3細(xì)胞。張蓮萍等[12]從同屬植物“菝葜”中提取分離出的白藜蘆醇、β-谷甾醇、槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷等化學(xué)成分，具有較好的抗腫瘤活性；而張存莉等[13]發(fā)現(xiàn)短梗菝葜乙酸乙酯部位中也具有上述化學(xué)成分；本研究也發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯部位具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，可能與該部位中的這些成分有關(guān)。正丁醇部位卻具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用，而許靜等[2]從正丁醇部位分離出的僅有少數(shù)甾體皂苷類單體成分具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，大部分則無抑制腫瘤作用；可能與本實(shí)驗(yàn)提取的正丁醇部位為粗提物有關(guān)，粗提物中含有多種化學(xué)成分，化學(xué)成分之間相互拮抗或協(xié)同作用，而影響抗腫瘤活性；乙醇總提物和剩余液幾乎無抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。本實(shí)驗(yàn)初步確定了短梗菝葜乙酸乙酯部位為主要的抗腫瘤活性部位，但抗腫瘤的活性成分有待進(jìn)一步的分離純化，并更深入的研究其抗腫瘤的作用機(jī)制。

在倒置顯微鏡下觀察各提取部位給藥后SMMC-7721、A549和MGC80-3細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞數(shù)目的變化，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯部位給藥前細(xì)胞貼壁性好，細(xì)胞伸展開，飽滿，增殖旺盛，經(jīng)不同濃度給藥48 h后，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)閳A形，甚至破碎，皺縮，細(xì)胞間隙增大，引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死，同時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的不斷增大，細(xì)胞凋亡率也逐漸增大；正丁醇部位細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，但隨著藥物濃度的增大，細(xì)胞數(shù)量明顯增加，因而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖，但采用乙醇總提物、乙醚部位及剩余液給藥后細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目則無明顯的變化。

在指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)中，濟(jì)源市思禮鎮(zhèn)九里溝鄭坪村郭莊(S3)和安陽市林州石板巖鎮(zhèn)紅土崗(S5)產(chǎn)地的相似度分別為0.864和0.75，相似度較低原因是可能與化學(xué)成分含量的差異相關(guān)；而引起化學(xué)成分的差異又與氣候和地理因素等相關(guān)。賀建武等[14]研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)濕度、年降水量和年最低溫等是影響菝葜主要藥效成分的主導(dǎo)因子，年最低溫、年均溫和≥10 ℃有效積溫與菝葜藥效成分呈正相關(guān),相對(duì)濕度、年降水量和無霜期與菝葜藥效成分呈負(fù)相關(guān)。如濟(jì)源市思禮鎮(zhèn)九里溝郭莊(S3)的峰面積與其他產(chǎn)地比較，X1、X3、X7、X8、X9、X10的峰面積較小，可能與相對(duì)濕度、年降水量和無霜期有關(guān)，而導(dǎo)致含量較低；安陽市林州石板巖鎮(zhèn)紅土崗(S5)的峰面積與其他產(chǎn)地比較，X2、X4、X5、X6、X8、X9、X10、X11、X13、X15、X16的峰面積較大，可能與年最低溫、年均溫和≥10 ℃有效積溫等有關(guān)，而導(dǎo)致含量較高。

偏最小二乘回歸法是集多因變量對(duì)多自變量的回歸建模以及多元線性回歸分析、主成分分析、典型相關(guān)分析功能為一體的多元數(shù)據(jù)分析方法，能消除自變量之間的多重相關(guān)性，辨識(shí)系統(tǒng)中的信息與噪聲，更好的體現(xiàn)中藥成分與藥效之間的相關(guān)性，是構(gòu)建中藥譜效關(guān)系的一種有效方法。本實(shí)驗(yàn)采用偏最小二乘法建立短梗菝葜乙酸乙酯部位譜效方程，結(jié)果顯示各成分均對(duì)MGC80-3細(xì)胞存活率有影響，其中9個(gè)成分對(duì)藥效的影響較大，分別X1、X2、X4、X7、X13、X17、X18、X19、X21，說明其抗腫瘤作用取決于多種化學(xué)物質(zhì)共同作用的結(jié)果；X21在指紋圖譜中含量較低，且在偏最小二乘中與藥效呈負(fù)相關(guān)，是發(fā)揮主要作用的藥效物質(zhì)，而X10為白藜蘆醇，含量較高，與藥效呈正相關(guān)，卻不是發(fā)揮藥效的關(guān)鍵物質(zhì)，可見中藥化學(xué)成分的復(fù)雜性。由于有關(guān)短梗菝葜化學(xué)成分文獻(xiàn)報(bào)道較少，故無法指認(rèn)與其對(duì)應(yīng)的化合物，后續(xù)研究中有待分離純化活性成分并進(jìn)行鑒定。