基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究當(dāng)歸四逆湯抗多囊卵巢綜合征的藥理作用與機制

于 丹，底雪梅，張其鏘，王 菲，張 海，李 偉*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟南 250355；2.同濟大學(xué)附屬第一婦嬰保健院藥劑科，上海 201204)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是青春期及育齡期女性最常見的一種內(nèi)分泌紊亂性疾病，其發(fā)生率占育齡婦女的5%～10%，在不孕癥患者中發(fā)病率可達50%～70%[1-2]。在臨床治療方面，通常采用抗雄激素治療，二甲雙胍、噻唑烷二酮類藥物等[3]，但并沒有形成規(guī)范統(tǒng)一的治療方案。中醫(yī)藥在治療PCOS方面有其天然的優(yōu)勢，特別是中藥復(fù)方可以從整體宏觀的角度，通過多成分多靶點多途徑協(xié)同拮抗起到治療作用。

當(dāng)歸四逆湯為漢代張仲景所作經(jīng)典名方，出自《傷寒論》厥陰篇中，是治療厥陰傷寒的代表方劑[4]。當(dāng)歸四逆湯由當(dāng)歸、桂枝、芍藥、細(xì)辛、通草、大棗、甘草(炙)等熬制而成[5]。近年來有關(guān)當(dāng)歸四逆湯臨床研究表明，當(dāng)歸四逆湯可治療子宮內(nèi)膜異位癥、盆腔炎性等婦科疾病，特別對PCOS療效確切[6-8]。但有關(guān)當(dāng)歸四逆湯的藥理作用機制的研究報道較少，其有效成分、作用靶點及分子作用機制還不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)研究的一部分，其整體觀和系統(tǒng)理論與中藥復(fù)方配伍作用機制完全一致，所以是研究中藥復(fù)方配伍作用和藥理作用機制的有效技術(shù)方法，近年來在業(yè)內(nèi)得到廣泛應(yīng)用[9-10]。本研究以當(dāng)歸四逆湯為研究對象，通過構(gòu)建大鼠PCOS病理模型，評價當(dāng)歸四逆湯的藥理作用；然后收集主要活性成分和作用靶點，利用Cytoscape軟件構(gòu)建“成分-靶點”交互作用網(wǎng)絡(luò)，然后進行GO與KEGG功能富集分析；最后，采用Discovery Studio對主要藥效成分和作用靶點進行分子靶點對接，并對當(dāng)歸四逆湯抗PCOS的分子作用機制進行探討。這將為當(dāng)歸四逆湯進一步的配伍機制研究和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 當(dāng)歸、桂枝、生白芍、細(xì)辛、蜜炙甘草、通草、大棗均購自上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?。來曲唑片(批號19991001)，規(guī)格2.5 mg/片，購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。4%多聚甲醛(批號G-1002)購自武漢谷歌生物科技有限公司。石蠟切片機(型號RM2235，德國Leica公司)；光學(xué)顯微鏡(型號IX70，日本Olympus公司)；電子分析天平(型號JA5003N，上海菁華科技儀器有限公司)。SPF級6周齡SD雌性大鼠，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2016-0006，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)在同濟大學(xué)實驗動物中心。

1.2 模型建立 50只大鼠每日灌胃給予來曲唑(1 mg/kg)，連續(xù)21 d，解剖大鼠可觀察到其卵巢表面蒼白，包膜增厚明顯，體積增大，光鏡下可見較多閉鎖卵泡，囊泡擴張增加，顆粒細(xì)胞層減少，黃體數(shù)量下降，說明造模成功。

1.3 分組及給藥 稱取當(dāng)歸40 g、桂枝30 g、生白芍30 g、細(xì)辛10 g、蜜炙甘草20 g、通草20 g、大棗10 g，8倍量85%乙醇超聲提取(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，分離藥液，生藥量1.0 g生藥/mL。大鼠隨機分為正常對照組、模型組、當(dāng)歸四逆湯低劑量組(每天6 g/kg)、當(dāng)歸四逆湯高劑量組(每天9 g/kg)、克羅米芬組(每天15 mg/kg)，每組10只，正常對照組、模型組給予等容量生理鹽水，均連續(xù)15 d。

1.4 卵巢組織病理切片 末次給藥后禁食24 h，大鼠頸椎脫臼處死，取新鮮卵巢，4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋常規(guī)切片，HE染色，在光學(xué)顯微鏡觀下察大鼠卵巢組織病理切片形態(tài)學(xué)變化。

1.5 當(dāng)歸四逆湯成分和靶點數(shù)據(jù)庫構(gòu)建 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺TCMSP(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php)，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為篩選條件，得到當(dāng)歸四逆湯的活性成分，并檢索其藥物靶點。通過NCBI PubChem數(shù)據(jù)庫(www.NCBI.nlm.nih.gov/pccompound)查找活性成分的SMILES結(jié)構(gòu)，利用Uniprot(https：//www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫對檢索到的藥物靶點進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，限定物種為“Homo-Sapiens”，將藥物作用靶點名稱轉(zhuǎn)換成對應(yīng)基因名稱。以“PCOS”為關(guān)鍵詞，在DrugBank(www.drugbank.ca)和Genecards(https：//www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫中檢索與PCOS相關(guān)的靶點，刪除重復(fù)靶點，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫將其轉(zhuǎn)換成對應(yīng)基因，最后篩選得到藥物與疾病兩者的交集作用靶點。

1.6 當(dāng)歸四逆湯成分靶點交互作用和作用機制研究 采用Cytoscape 3.6.1軟件，構(gòu)建當(dāng)歸四逆湯成分-疾病-靶點交互作用網(wǎng)絡(luò)圖。利用“Network Analysis”功能進行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治?，依?jù)度值大小篩選分析關(guān)鍵化合物。采用DAVID數(shù)據(jù)庫，對交集作用靶點進行GO生物學(xué)過程分析和KEGG代謝通路富集分析，預(yù)測當(dāng)歸四逆湯作用于PCOS的分子作用機制。采用Discovery studio 3.0分子對接軟件建立藥物分子與靶點的相關(guān)性，首先篩選靶結(jié)構(gòu)均為X射線測定的晶體結(jié)構(gòu)，隨后將其導(dǎo)入到Discovery Studio 3.0中，初步預(yù)處理后，通過加氫除水和結(jié)構(gòu)簡化優(yōu)化各個結(jié)構(gòu)，同時將化合物SMILES式導(dǎo)入軟件構(gòu)建分子結(jié)構(gòu)，最后將每個分子與靶點結(jié)構(gòu)對接，獲得dock參數(shù)Xlibdockscore，生成配體-蛋白相互作用三維和二維平面圖。

2 結(jié)果

2.1 抗PCOS作用評價

2.1.1 大鼠體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量、子宮質(zhì)量 表1顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量增加(P<0.05)，與大多數(shù)臨床PCOS患者體質(zhì)量超重或肥胖、卵巢增大相符；當(dāng)歸四逆湯低、高劑量組大鼠體質(zhì)量減輕(P<0.05)，表明用藥有一定效果。模型組及當(dāng)歸四逆湯低劑量組大鼠子宮質(zhì)量較低，當(dāng)歸四逆湯高劑量組大鼠子宮質(zhì)量恢復(fù)正常水平(P<0.05)。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量、子宮質(zhì)量Tab.1 Weights of bodies,ovarians and uterines of rats in each

2.1.2 大鼠卵巢卵泡數(shù)及黃體數(shù) 與正常對照組比較，模型組大鼠生長卵泡數(shù)增加(P<0.05)，成熟卵泡數(shù)及黃體數(shù)均減少(P<0.05)，提示造模成功；與模型組比較，當(dāng)歸四逆湯低、高劑量組大鼠成熟卵泡數(shù)及黃體數(shù)升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠生長卵泡、成熟卵泡、黃體數(shù)Tab.2 Growing follicles，mature follicles and corpus luteum of rats in each

2.1.3 大鼠卵巢組織形態(tài)結(jié)構(gòu) 如圖1所示，空白組大鼠卵巢組織形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)沒有異常，可見不同發(fā)育階段的卵泡、多個黃體，形態(tài)完整，排列較為整齊；模型組大鼠卵巢組織可見大小不等的囊腔，粒層細(xì)胞被擠壓呈扁平或立方形，各種發(fā)育階段卵泡與黃體稀少；與模型組比較，當(dāng)歸四逆湯低劑量組(6 g/kg)、克羅米芬組大鼠卵巢病理性改變減輕。

圖1 各組大鼠卵巢組織切片HE染色(×100)Fig.1 HE staining for ovarian tissue sections of rats in each group(×100)

2.2 當(dāng)歸四逆湯成分和靶點數(shù)據(jù)庫構(gòu)建 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中，檢索到當(dāng)歸四逆湯化學(xué)成分967種，經(jīng)OB、DL值篩選得到155種，其中當(dāng)歸2種，桂枝7種，白芍13種，細(xì)辛8種，通草4種，甘草92種，大棗29種，刪除39種無作用靶點的化合物，最終得到116種成分，對應(yīng)1 791個靶點，重復(fù)靶點僅保留1個，共得到282個單一靶點。以“PCOS”為關(guān)鍵詞進行檢索，在DrugBank和Genecards數(shù)據(jù)庫中搜索相關(guān)靶點，刪除重復(fù)靶點，最終得到疾病靶點2 282個。將282個藥物靶點與2 282個疾病靶點進行交集，發(fā)現(xiàn)有166個靶點重合。

2.3 核心靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將166個共同作用靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中，繪制相關(guān)靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2，設(shè)置置信度為0.9，PPI圖中有40個節(jié)點，80條邊，期望邊數(shù)為19，PPI的富集顯著性P<1.0×10-16。節(jié)點代表藥物治療PCOS的作用靶點，邊代表靶點與靶點之間有相互作用，說明這些靶點在某些方面是相互關(guān)聯(lián)，協(xié)同配合起到治療疾病的作用。導(dǎo)出含有節(jié)點信息的TSV文件，在Cytoscape中分析節(jié)點信息，篩選出前14個核心調(diào)控基因靶點，結(jié)果見表3。

表3 關(guān)鍵靶點基因的拓?fù)鋵W(xué)分析Tab.3 Topological analysis for key target genes

圖2 核心靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network diagram for Protein-protein interaction of core targets

2.4 “成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 116種活性成分用C1-C116表示，40個作用靶點用相應(yīng)基因代號表示，利用Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建“成分-靶點”相互作用網(wǎng)絡(luò)，見圖3。該網(wǎng)絡(luò)圖包含157個節(jié)點，1 558條邊，可直觀體現(xiàn)當(dāng)歸四逆湯治療PCOS的多成分、多靶點的作用特點。再進行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治觯罁?jù)度值大小篩選出排名前10的潛在重要活性成分，見表4。

表4 當(dāng)歸四逆湯主要活性成分Tab.4 Main active ingredients in Danggui Sini Decoction

2.5 生物過程與通路分析 生物過程分析主要涉及一氧化氮生物合成過程的正向調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、藥物反應(yīng)、細(xì)胞對有機循環(huán)化合物的反應(yīng)、NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控及凋亡過程的正向調(diào)控等，結(jié)果見圖4A。由此可知，在細(xì)胞組成和分子功能方面，主要集中在細(xì)胞質(zhì)溶膠、膜筏和線粒體外膜中，涉及了酶結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚化結(jié)合、類固醇激素受體結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性，配體激活序列特異性DNA結(jié)合、蛋白結(jié)合等。

通過對40個關(guān)鍵靶點進行KEGG信號通路分析，共得到82條信號通路(P<0.05)，選取其中排名前20者繪制氣泡圖，進行可視化分析，見圖4B。由此可知，共同靶點主要富集于TNF、Toll樣受體信號通路、細(xì)胞凋亡、甲狀腺激素信號通路、神經(jīng)鞘脂類信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)信號通路等。

注：紅色三角形代表當(dāng)歸四逆湯中活性成分，藍綠色圓角矩形代表蛋白靶點。圖3 成分-靶點交互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Network diagram for Component-Target interaction

圖4 生物學(xué)過程(A)、KEGG富集分析(B)氣泡圖Fig.4 Bubble diagrams for biological process(A)and KEGG enrichment analysis(B)

2.6 分子對接結(jié)果 將當(dāng)歸四逆湯治療多囊卵巢綜合征的潛在活性成分和PPI分析中的核心靶點分別對接，發(fā)現(xiàn)不少化合物能與ESR1、NCOA2、NOS2、CASP8、PPARG、BCL2、IL6對接成功，選取代表性成分異鼠李素(isorhamnetin)、槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、甲氧基菜豆素(1-methoxyphaseollidin)，采用分子對接和二維相互作用圖進行分析驗證，結(jié)果如圖5所示。由此可知，異鼠李素中的羥基與PPARG中的PHE360形成氫鍵，槲皮素中的羥基與BCL2中的VAL133形成氫鍵，山柰酚中的兩個羥基分別與CASP8中的THR337、GLU396形成氫鍵，甲氧基菜豆素中的一個氧原子與IL6中的GLN175、ARG179形成共軛π鍵，表明當(dāng)歸四逆湯活性成分預(yù)測的作用靶點具有一定的準(zhǔn)確性，可以用于后續(xù)實驗。

圖5 “活性成分-作用靶點”分子對接圖Fig.5 Diagram for ‘a(chǎn)ctive ingredient s-targets’molecular docking

3 討論

多囊卵巢綜合征是一種以高雄激素血癥、排卵障礙、胰島素抵抗及糖脂代謝異常為基本特征的綜合病癥，其發(fā)病因素復(fù)雜，主要包括下丘腦-垂體-卵巢軸調(diào)節(jié)功能紊亂、機體胰島素抵抗造成內(nèi)分泌紊亂等[11-12]。在分子生物學(xué)水平，相關(guān)信號通路的失衡或者關(guān)鍵基因的異常表達也可以導(dǎo)致PCOS的發(fā)生[13]。本研究首先進行了藥理學(xué)實驗驗證了當(dāng)歸四逆湯可以有效改善大鼠多囊卵巢綜合征，并基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，根據(jù)當(dāng)歸四逆湯中藥材組成建立成分-靶點數(shù)據(jù)庫，經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖分析，篩選獲得潛在活性成分槲皮素、山柰酚、植物甾醇、異鼠李素、甘草黃酮等，其中槲皮素能夠改善PCOS胰島素抵抗，抑制TLR/NF-κB通路，改善PCOS炎癥微環(huán)境，逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗[14]；山柰酚能夠激活A(yù)MPK/HO-1信號通路，減輕氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡，降低炎癥反應(yīng)[15]；異鼠李素具有一定的降血糖活性，還可以抑制血小板聚集，調(diào)控一氧化氮合酶活性發(fā)揮抗炎作用[16]；其余的活性成分大多為黃酮類化合物，具有抗炎、降低血脂、改善凝血等作用，能發(fā)揮抗炎、抗氧化功能。經(jīng)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治龊Y選出AKT1、ESR1、BCL2、TNF、IL-6等14個關(guān)鍵靶點，推測可能是當(dāng)歸四逆湯活性成分的主要作用靶點。ESR1是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，該基因編碼雌激素受體，在卵泡發(fā)育和成熟中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[17]。AR屬于核受體超家族成員，是編碼雄激素受體的基因，PCOS的病理特征之一就是雄激素水平升高，較高的雄激素水平可以引起 PCOS患者的痤瘡、多毛等癥狀。IL-6基因是趨化因子家族的一種細(xì)胞因子，廣泛參與炎癥反應(yīng)，IL-6水平升高可以加重PCOS胰島素抵抗[18]。AKT基因在細(xì)胞存活和凋亡中起重要作用，胰島素等生長和存活因子都可以激活A(yù)KT信號途徑，研究表明，胰島素水平缺陷和胰島素抵抗與PCOS卵巢和子宮內(nèi)膜中PI3K/AKT/mTOR信號受損有關(guān)[19]，這一途徑通常與細(xì)胞增殖和細(xì)胞炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，AKT基因是其中的關(guān)鍵靶點。綜上所述，當(dāng)歸四逆湯可能是通過調(diào)控ESR1、AR、IL-6、AKT等關(guān)鍵靶點，介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、炎性微環(huán)境、細(xì)胞凋亡與胰島素抵抗等信號途徑達到治療多囊卵巢綜合征的作用。

GO和KEGG分析結(jié)果涉及一氧化氮生物合成過程的正向調(diào)控、對類固醇激素反應(yīng)、NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控及凋亡過程的正向調(diào)控等，涉及信號分子、轉(zhuǎn)錄因子、受體、蛋白和酶等多種物質(zhì)的參與,可能通過調(diào)控TNF、Toll樣受體、細(xì)胞凋亡等信號通路，是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程。類固醇激素包括性激素、腎上腺皮質(zhì)激素等，其在糖脂代謝、胰島素抵抗、慢性炎癥等多途徑發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，類固醇激素反應(yīng)在PCOS的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，多途徑的參與調(diào)節(jié)PCOS患者體內(nèi)微環(huán)境[20]。經(jīng)KEGG分析，TNF信號通路上富集的基因主要有AKT1、IL-6、TNF、CASP8等，TNF、NF-κB信號通路的激活在PCOS的發(fā)生發(fā)展過程中也起到重要作用。TNF-α是一種與炎癥有關(guān)的細(xì)胞因子，其能夠誘導(dǎo)NF-κB結(jié)合雄激素受體啟動子，激活炎癥信號通路，使IL-6、IL-8、IL-1β等炎癥因子水平升高，增加卵巢局部雄激素表達，誘導(dǎo)PCOS[21]，有研究顯示，當(dāng)歸四逆湯可以降低類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型大鼠外周血清TNF-α、IL-6、IL-1β的水平，改善炎癥反應(yīng)[22]；Toll樣受體是參與非特異性免疫的一類重要的蛋白質(zhì)分子，魏慧玲等[23]通過構(gòu)建硬皮病模型小鼠發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸四逆湯可通過下調(diào)Toll樣受體4(TLR4)以及NF-κB的蛋白表達，抑制TLR4/NF-κB信號通路，降低炎癥因子TNF-α、IL-10 及 IL-16表達。張汝堅等[24]實驗證實IL-6在PCOS患者中高表達，其可能是通過胰島素抵抗或引發(fā)慢性炎癥在PCOS發(fā)病中起作用。本研究通過分析，發(fā)現(xiàn)IL-6、TNF等是當(dāng)歸四逆湯治療PCOS的潛在靶點，結(jié)合既往實驗研究，進一步推測當(dāng)歸四逆湯可能是通過調(diào)控TNF、NF-κB、Toll樣受體信號通路中IL-6、TNF等作用靶點來抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和細(xì)胞凋亡、改善胰島素抵抗等多途徑來達到治療PCOS的目的。

綜上所述，本研究對當(dāng)歸四逆湯抗PCOS藥理作用進行了評價，對其藥理作用機制進行了初步研究探索，結(jié)果表明，當(dāng)歸四逆湯可以有效改善大鼠多囊卵巢癥狀，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對中藥復(fù)方當(dāng)歸四逆湯治療PCOS進行了系統(tǒng)分析，說明當(dāng)歸四逆湯是通過多成分、多靶點、多通路協(xié)同發(fā)揮抗PCOS藥理作用的，為當(dāng)歸四逆湯臨床應(yīng)用提供了新思路，也為進一步實驗研究奠定了基礎(chǔ)，以期可以使更多的多囊卵巢綜合征患者受益。