芙蓉凝膠對(duì)急性乳腺炎大鼠的抗炎作用及機(jī)制

萬(wàn) 靜，陳曉蘭，楊曉梅，楊敬鴻，韓 偉，高 遠(yuǎn)

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.福建省南平市人民醫(yī)院，福建 南平 354200；3.畢節(jié)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州 畢節(jié) 551700)

急性乳腺炎是乳腺的急性化膿性感染，好發(fā)于產(chǎn)后哺乳的婦女，尤以初產(chǎn)婦更為多見，往往發(fā)生在產(chǎn)后3～4周[1]。因乳房血管豐富，早期就可出現(xiàn)寒戰(zhàn)、高熱及脈搏加快等膿毒血癥表現(xiàn)。西醫(yī)主要通過抗生素等藥物治療和穿刺或引流等手術(shù)治療該疾病，預(yù)后較好。但對(duì)于哺乳期的婦女使用抗生素，其孩子會(huì)出現(xiàn)一些菌群失調(diào)、腹瀉等癥狀[2]，而手術(shù)治療會(huì)對(duì)乳腺外形造成不可修復(fù)的損傷。中醫(yī)以清熱解毒、消腫排膿為主[3-4]，臨床上用乳腺寧搽劑治療急性乳腺炎，效果顯著。其藥物組成有木芙蓉葉和穿心蓮。由于搽劑存在施藥不方便，藥液易于流淌的缺陷，課題組前期將其制備成芙蓉凝膠劑，具有使用方便、貼敷舒適、刺激性小、患者依存性高、載樣量大等優(yōu)勢(shì)。本研究以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)急性乳腺炎大鼠為對(duì)象，通過觀察大鼠乳腺組織病理切片，檢測(cè)其乳腺組織中相關(guān)炎癥因子白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的水平和髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的活性,從炎癥因子和分子蛋白水平等方面探討芙蓉凝膠對(duì)LPS誘導(dǎo)急性乳腺炎大鼠的保護(hù)作用及可能機(jī)制，并借助信息熵理論綜合評(píng)價(jià)不同劑量芙蓉凝膠對(duì)上述指標(biāo)的影響，以期為外用新劑型的研發(fā)和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SD大鼠，體質(zhì)量250 g，購(gòu)于長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(湘)2014-0011。給予充足的水和鼠飼料，自由飲水?dāng)z食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，雌雄鼠按2∶1的比例同籠飼養(yǎng)，當(dāng)雌鼠有明顯孕相后，將雄鼠移出，待雌鼠自由產(chǎn)仔。

1.2 藥物與試劑 空白凝膠膏劑、芙蓉乳腺寧凝膠膏劑(自制，符合凝膠膏劑要求)；乳腺寧貼(批號(hào)201804092，桂林市威諾敦醫(yī)療器械有限公司)。脂多糖(批號(hào)044M4000V，美國(guó)Sigma公司)；蘇木素(批號(hào)180634)及IL-1β、IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)試劑盒(批號(hào)1218E18)均購(gòu)自南京賽博生物技術(shù)有限公司；滅菌PBS溶液(pH 7.2～7.4，批號(hào)20180829，北京索萊寶科技有限公司)；MPO兔單克隆抗體[批號(hào)ab208670，艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司]；山羊抗兔工作液(批號(hào)SP-9001)、正常山羊血清(批號(hào)ZLI-9021)、濃縮型DAB試劑盒(批號(hào)K135925C)均購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。水合氯醛(批號(hào)2015050501，成都市新科龍化工試劑廠)；75%乙醇(批號(hào)180826，貴州康泰利健消毒制品有限公司)；4%多聚甲醛(批號(hào)1804895，蘭杰柯科技有限公司)。

1.3 儀器 BCD-201STPA型冰箱(青島海爾股份有限公司)；Multlskan Mk3型酶標(biāo)儀[賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司]；-80 ℃冰箱(青島海爾特種電器有限公司)；徠卡-2016型轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；TSJ-Ⅱ型全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)、BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司)；BA400Digital型數(shù)碼三目攝像顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)。

2 方法

2.1 造模 參考文獻(xiàn)[5]報(bào)道，選取分娩后5～7 d，乳頭管明顯膨大、完整性好的雌鼠，4%水合氯醛麻醉(0.75 mL/100 g)后固定在手術(shù)臺(tái)上，用剪刀將大鼠第4對(duì)乳腺周圍的毛小心剔除(不可剪破鼠皮)，面積7 cm2左右，并用醫(yī)用膠帶、鐵絲網(wǎng)、紗布固定大鼠腹部，使其松緊適度，不影響飲水?dāng)z食，連續(xù)4 d。第5天將大鼠麻醉，固定在手術(shù)臺(tái)上，用75%乙醇對(duì)第4對(duì)乳腺周圍消毒，用鑷子將該處乳頭輕輕調(diào)起，使其充分暴露，左手拿小鑷子輕輕夾起并固定，右手用剪刀小心剪掉乳頭管尖端1 mm左右，用100 μL鈍性微量進(jìn)樣器往大鼠每側(cè)乳頭管緩慢灌注100 μL 1 mg/mL LPS，停留數(shù)秒后，將微量進(jìn)樣器緩慢拔出，用棉簽輕揉乳腺周圍，使LPS均勻分布。

2.2 藥物制備 根據(jù)課題組前期均勻試驗(yàn)優(yōu)選出的最佳基質(zhì)處方(NP700 0.100 0 g、高嶺土0.500 0 g、甘油 4.146 7 g、PVP 0.398 2 g、酒石酸0.004 0 g、甘羥鋁0.040 0 g，水4.000 0 g)，加入3%丙二醇促滲劑，制得空白凝膠膏劑[6]。課題組前期以君藥木芙蓉葉臨床劑量的8倍，即每天1.7 g/kg為有效劑量換算成小鼠總劑量[7-8]，用等比基線法設(shè)定木芙蓉、穿心蓮不同配比，進(jìn)行鎮(zhèn)痛抗炎實(shí)驗(yàn)[9]，確定兩者最佳配比為1∶1，分別以空白凝膠膏劑中載10%、1.25%的木芙蓉葉與穿心蓮純化物為高、低劑量組[6]。

2.3 分組與給藥 分組前1 h將幼鼠與母鼠分開，將雌鼠隨機(jī)分為空白組(0 g/kg)、假手術(shù)組(0 g/kg)、模型組(0 g/kg)、陽(yáng)性組(1 g/kg)和芙蓉凝膠低(2 g生藥/kg)、高劑量組(16 g生藥/kg)，每組10只，空白組、假手術(shù)組、模型組均于大鼠第4對(duì)乳腺貼空白凝膠，陽(yáng)性組貼乳腺寧貼，芙蓉凝膠組貼相應(yīng)的藥物，每天1次，連續(xù)4 d，第5天模型組、給藥組大鼠按“2.1”項(xiàng)下方法處理，空白組不做任何處理，假手術(shù)組大鼠緩慢注入滅菌PBS溶液(100 μg/側(cè))，造模后各組大鼠再給藥1次。

2.4 取材 造模24 h后大鼠脫頸處死，固定在手術(shù)臺(tái)上，75%乙醇擦拭第4對(duì)乳腺周圍，剪刀小心大鼠腹部(切勿剪破腹膜)，剝開皮膚以使乳腺充分暴露，剝離組織，左側(cè)用4%多聚甲醛固定，用于后期制作病理組織學(xué)切片和免疫組化切片；右側(cè)迅速轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，用于IL-1β、IL-6、TNF-α水平的檢測(cè)。

2.5 病理切片制備和HE染色 流水沖洗固定好的大鼠乳腺組織，梯度乙醇脫水，依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中直至呈透明狀態(tài)，石蠟包埋，切片，烘干，脫蠟，進(jìn)行HE染色和封片，在顯微鏡下觀察病理組織變化。

2.6 MPO表達(dá)檢測(cè) 大鼠乳腺組織經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋、切片、烘干、脫蠟后，滴加山羊血清封閉液進(jìn)行抗原修復(fù)并阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，加入MPO抗體，在4 ℃濕盒中孵育過夜，加入酶標(biāo)二抗，室溫孵育20 min，DAB顯色液顯色，終止顯色后蘇木素復(fù)染，脫水后封片，鏡檢，采用數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)對(duì)切片進(jìn)行圖像采集，Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)光密度(OD)和面積，計(jì)算每張圖像平均OD值，用以表述MPO表達(dá)。

2.7 TNF-α、IL-1β、IL-6水平檢測(cè) 將右側(cè)大鼠乳腺組織取出后，按1∶9 的比例加入PBS溶液，組織勻漿機(jī)勻漿后離心15 min，棄去上層乳白色脂肪部分，收集上清液，采用ELISA 試劑盒檢測(cè)組織上清液TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 大鼠乳腺組織病理組織學(xué)變化 空白組和假手術(shù)組大鼠乳腺小葉結(jié)構(gòu)較為明顯，未見其他明顯病理變化；模型組大鼠乳腺組織病變嚴(yán)重，乳腺小葉結(jié)構(gòu)較為明顯，腺泡數(shù)量較為正常，導(dǎo)管管腔內(nèi)有大量中性粒細(xì)胞滲出；陽(yáng)性組大鼠乳腺小葉結(jié)構(gòu)較為明顯，導(dǎo)管及腺泡管腔內(nèi)有少量中性粒細(xì)胞滲出，未見其他明顯病理變化；芙蓉凝膠低劑量組乳腺小葉結(jié)構(gòu)較為明顯，導(dǎo)管管腔內(nèi)有較多中性粒細(xì)胞滲出；芙蓉凝膠高劑量組大鼠乳腺小葉結(jié)構(gòu)明顯，導(dǎo)管上皮細(xì)胞形態(tài)及腺泡數(shù)量較為正常，導(dǎo)管管腔內(nèi)有少量中性粒細(xì)胞滲出，見圖1。與空白組比較，模型組大鼠炎癥反應(yīng)及乳腺、導(dǎo)管等細(xì)胞損傷明顯增強(qiáng)；與模型組比較，陽(yáng)性組、芙蓉凝膠高劑量組大鼠病變程度相對(duì)較輕，芙蓉凝膠低劑量組作用一般，提示陽(yáng)性組、芙蓉凝膠高劑量組對(duì)急性乳腺炎模型大乳腺組織有較好改善作用。

圖1 大鼠乳腺組織病理圖(HE，×400)Fig.1 Histopathological images for mammary gland of rats in each group (HE，×400)

3.2 大鼠乳腺組織MPO表達(dá) 表1顯示，模型組大鼠乳腺組織MPO表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，陽(yáng)性組、芙蓉凝膠高劑量組大鼠乳腺組織MPO表達(dá)均降低(P<0.01)，芙蓉凝膠低劑量組無(wú)明顯變化(P>0.05)。

表1 各組大鼠乳腺組織MPO表達(dá)Tab.1 MPO expressions in mammary glands of rats in each group

3.3 大鼠乳腺組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平 與空白組比較，模型組大鼠乳腺組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高(P<0.01)；與模型組比較，陽(yáng)性組、芙蓉凝膠高劑量組大鼠乳腺組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平均降低(P<0.01)，見表2。

表2 各組大鼠乳腺組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平Tab.2 Levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in mammary glands of rats in each

3.4 藥效評(píng)價(jià) 對(duì)上述指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，結(jié)果見表3，以其建立原始藥效指標(biāo)矩陣(X)后轉(zhuǎn)換為概率矩陣(P)，見圖2，再根據(jù)概率矩陣計(jì)算第i個(gè)指標(biāo)的熵值(Hi)，得Hi=[0.700 8,0.954 9,0.949 8,0.955 4]，計(jì)算各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)(Wi)，為[0.681 4,0.102 7,0.114 3,0.101 6]，陽(yáng)性組、芙蓉凝膠低劑量組、芙蓉凝膠高劑量組的M值分別為0.565、0.083、0.352，可知芙蓉凝膠高劑量組綜合影響較大，低劑量組影響較小。

表3 各組指標(biāo)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理結(jié)果Tab.3 Results of standardized processing of indicator data in each group

圖2 藥效指標(biāo)矩陣(X)和概率矩陣(P)Fig.2 Pharmacodynamic index matrix (X)and probability matrix (P)

4 討論

LPS誘導(dǎo)的炎癥可使TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高，且TNF-α、IL-1β能夠調(diào)節(jié)嗜中性粒細(xì)胞的滲出，造成乳腺組織損傷，而MPO的表達(dá)和分布與嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)量成正相關(guān)[14-15]，故本實(shí)驗(yàn)選用TNF-α、IL-1β和IL-6指標(biāo)評(píng)價(jià)芙蓉凝膠對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性乳腺炎模型大鼠的影響。經(jīng)芙蓉凝膠干預(yù)后，大鼠乳腺組織MPO的表達(dá)降低，高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平受到抑制，即對(duì)急性乳腺炎大鼠有較好的保護(hù)作用。

熵在信息論中，表示不確定性的量度[16]。熵權(quán)法以信息熵理論為依據(jù)，客觀地對(duì)各因素賦權(quán)，進(jìn)行綜合評(píng)分，可為多指標(biāo)研究數(shù)據(jù)分析提供依據(jù)[17]。在藥物效應(yīng)評(píng)價(jià)試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理中，利用信息熵理論對(duì)多個(gè)效應(yīng)評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行客觀賦權(quán)，建立綜合評(píng)價(jià)度量指標(biāo)，其綜合評(píng)分能直觀清晰反映不同劑量組藥物對(duì)多個(gè)效應(yīng)指標(biāo)的綜合影響，同時(shí)也避免了各指標(biāo)數(shù)據(jù)間的相互影響，提升實(shí)驗(yàn)研究的科學(xué)性與嚴(yán)謹(jǐn)性[18-19]。本研究借助信息熵理論，以炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平及MPO表達(dá)為藥效評(píng)價(jià)指標(biāo)，最終建立綜合藥效評(píng)價(jià)度量指標(biāo)，考察不同劑量芙蓉凝膠對(duì)大鼠MPO表達(dá)及炎癥因子水平的綜合影響。通過熵權(quán)法公式計(jì)算各指標(biāo)的信息熵值，指標(biāo)的信息熵越小，該指標(biāo)提供的信息量越大，權(quán)重就越高，在綜合評(píng)價(jià)中所起作用越大[20]。熵權(quán)法計(jì)算得MPO信息熵最小，說明該因子在綜合評(píng)價(jià)中所起作用最大，在對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性乳腺炎模型大鼠進(jìn)行藥物效應(yīng)評(píng)價(jià)時(shí)，選擇以MPO表達(dá)為評(píng)價(jià)指標(biāo)具有一定可靠性。經(jīng)芙蓉凝膠干預(yù)后，高劑量組MPO免疫組化檢測(cè)OD值降低(P<0.01)，即MPO的表達(dá)被抑制。熵權(quán)法綜合評(píng)分結(jié)果顯示，各藥效指標(biāo)的綜合評(píng)分陽(yáng)性組最高，芙蓉凝膠高劑量組次之，芙蓉凝膠低劑量最低，表明芙蓉凝膠對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性乳腺炎模型大鼠有一定改善作用，其機(jī)制可能與抑制大鼠乳腺組織MPO表達(dá)有關(guān)。