HPLC法測(cè)定蘇格木勒-10中5種成分

良 良，陳香梅，鮑布日額，張媛媛，王秀蘭

(內(nèi)蒙古民族大學(xué),內(nèi)蒙古 通遼 028005)

蘇格木勒-10是始載于《四部醫(yī)典》的主治腎寒、尿閉、結(jié)石病的蒙藥復(fù)方[1]，由益智、干姜、白硇砂、蓽茇等10味藥材組成，療效顯著[2-3]。方中君藥益智中的圓柚酮、楊芽黃素[4]具有保護(hù)腎臟，抗腫瘤增殖和促凋亡[5]，抗炎[6]和抗應(yīng)激[7]，抑制炎癥、凋亡和自噬[8-10]，調(diào)節(jié)免疫等作用，可用于多種腎臟疾病的治療；使藥干姜所含6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚具有抗心腎損傷[11-12]，抗炎[13]，抑制腫瘤活性，抗氧化[14]，抗卵巢癌[15-16]作用。目前。關(guān)于蘇格木勒-10質(zhì)量研究的報(bào)道集中在個(gè)別單藥單一成分含量測(cè)定上[17-19]，難以完整系統(tǒng)地體現(xiàn)該蒙藥方劑成分的多樣性。因此，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法測(cè)定方中君藥益智主要成分圓柚酮、楊芽黃素，以及使藥干姜主要成分6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的含量，以期為完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器 ULMATE3000高效液相色譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；Nikon E200電子顯微鏡、DS-U3拍照裝置(北京恒三江儀器銷售有限公司)；T-1700M馬弗爐(鄭州天縱電氣設(shè)備有限公司)；DHG-9023A電熱恒溫箱(寧波江南儀器廠)；AUY-120電子天平(最大210 g，感量0.01 mg，日本島津公司)；KQ-100E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；MILLIPORE型純水機(jī)[序列號(hào)SH3CA00008A，默克密理博實(shí)驗(yàn)室設(shè)備(上海)有限公司]；0.22 μm微孔濾膜(天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(功率50 W)、B220恒溫水浴鍋(功率1 000 W)(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試劑與藥物 6-姜酚(批號(hào)191115，純度≥98%)、8-姜酚(批號(hào)200204，純度≥98%)、10-姜酚(批號(hào)190513，純度≥98%)對(duì)照品均由北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院提供；諾卡酮(批號(hào)A10J10R79508，純度≥98%)、楊芽黃素(批號(hào)Z17O8X44888，純度≥98%)對(duì)照品均由上海源葉生物科技有限公司提供。乙腈為色譜純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；其余試劑均為分析純；水為超純水。

益智仁(批號(hào)20190512，產(chǎn)地安徽)、干姜(批號(hào)20190904，產(chǎn)地安徽)、榧子(批號(hào)20200807，產(chǎn)地安徽)、白硇砂(批號(hào)20200322，產(chǎn)地新疆)均購(gòu)自安徽省金芙蓉中藥飲片有限公司；蓮子(批號(hào)20200127，產(chǎn)地湖南)、蓽茇(批號(hào)20190521，產(chǎn)地廣西)均購(gòu)自安徽中美堂中藥飲片有限公司；冬葵果(批號(hào)20170768，產(chǎn)地河北)、苦石蓮(批號(hào)20200207，產(chǎn)地四川)、方海(批號(hào)20200121，產(chǎn)地山東)均購(gòu)自安國(guó)市彤康藥業(yè)有限公司；麝香(批號(hào)20140704，產(chǎn)地河北)購(gòu)自河北省菁草堂醫(yī)藥貿(mào)易有限公司)，上述藥材經(jīng)內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院鮑布日額教授鑒定為正品。

按《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》(蒙藥分冊(cè)1998)[18]記載，稱取益智、方海各150 g，干姜、白硇砂、蓽茇、榧子、冬葵果、蓮子、苦石蓮各60 g，麝香0.1 g，制成蘇格木勒-10(S11)，其余11批(S1～S10、S12)購(gòu)于10家醫(yī)院制劑室，具體見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚 Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相水(含0.2%磷酸)(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～8.5 min，30%～35%A，70%～65%B；8.5～10 min，35%～30%A，65%～70%B；10～22 min，30%A，70%B)；體積流量0.8 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm。

2.1.2 圓柚酮、楊芽黃素 Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相水(含0.2%磷酸)(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～8.0 min，30%～27%A，70%～73%B；8.0～12 min，27%～22%A，73%～78%B；12～17 min，22%～27%A，78%～73%B；17～20 min，27%～30%A，73%～70%B)；體積流量0.8 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm；進(jìn)樣量5 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取圓柚酮、楊芽黃素、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚對(duì)照品適量，置于25 mL量瓶中，甲醇溶解定容，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為2 000、2 000、1 000、2 000、2 000 μg/mL的貯備液，再分別進(jìn)一步稀釋至200、200、103.13、200、200 μg/mL，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取全方(S11)粉末5 g，置于200 mL圓底燒瓶中，加75%甲醇100 mL，超聲(功率100 W)處理30 min，濾過(guò)，濾液減壓濃縮，冷卻至室溫，甲醇定容至5 mL，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按全方工藝分別制備缺益智、缺干姜的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果圖1～2。由此可知，在該色譜條件下各成分均能達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)以6-姜酚峰計(jì)均不低于8 000，陰性無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

1.楊芽黃素 2.圓柚酮1.tectochrysin 2.nootkatone圖1 楊芽黃素、圓柚酮HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of tectochrysin and nootkatone

1.6-姜酚 2.8-姜酚 3.10-姜酚1.6-gingerol 2.8-gingerol 3.10-gingerol圖2 6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of 6-gingerol,8-gingerol and 10-gingerol

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密稱取對(duì)照品溶液0.25、0.50、1.0、2.0、4.0、5.0 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻，分別精密量取5 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液5 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得圓柚酮、楊芽黃素、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚峰面積RSD分別為1.33%、1.47%、1.29%、2.14%、1.05%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液適量，室溫下于0、2、4、6、8、10、24、36 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得圓柚酮、楊芽黃素、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚峰面積RSD分別為1.11%、1.86%、2.50%、2.20%、1.92%、1.21%，表明溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取全方(S11)6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得圓柚酮、楊芽黃素、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚含量RSD分別為1.73%、1.12%、2.16%、1.76%、1.47%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的全方(S11)9份，每份2.5 g，分別按1.5∶1、1∶1、0.5∶1比例加入對(duì)照品(圓柚酮793.5、529、264.5 μg/g，楊芽黃素3.57、2.38、1.19 μg/g，6-姜酚175.05、116.7、58.35 μg/g，8-姜酚23.38、15.6、7.78 μg/g，10-姜酚8.72、5.81、2.91 μg/g)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，圓柚酮、楊芽黃素、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚平均加樣回收率分別為99.09%、88.72%、100.74%、96.80%、95.08%，RSD分別為0.84%、1.42%、1.11%、3.03%、1.12%。

2.3.7 樣品含量測(cè)定 取12批全方(S1～S12)，每份5 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定3次，計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

表3 各成分含量測(cè)定結(jié)果(μg/g，n=3)Tab.3 Results of content determination of various constituents(μg/g,n=3)

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)[13，19-20]對(duì)5種成分進(jìn)行波長(zhǎng)篩選，發(fā)現(xiàn)6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚在205 nm處均有吸收峰，并且6-姜酚、8-姜酚有較大吸收，而圓柚酮、楊芽黃素在238 nm處吸收較好。因此，在保證各成分檢測(cè)靈敏度及基線分離的情況下，選擇205、238 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。然后，考察了乙腈/甲醇與水/水(含磷酸)的組合，發(fā)現(xiàn)乙腈-水(含磷酸)的洗脫能力更優(yōu)，并且磷酸體積分?jǐn)?shù)為0.2%時(shí)無(wú)拖尾，故選擇其作為流動(dòng)相。再考察了75%甲醇、95%乙醇的提取效果，發(fā)現(xiàn)其中前者提取時(shí)峰面積、基線穩(wěn)定性、噪聲、分離度優(yōu)于后者，而且超聲提取相較于回流提取，具有峰面積大、基線平穩(wěn)、噪聲小、分離度理想、雜峰少、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。

含量測(cè)定結(jié)果顯示，12批蘇格木勒-10中圓柚酮、6-姜酚含量均較高，楊芽黃素、10-姜烯酚含量相當(dāng)，8-姜酚含量均較低；S4中8-姜酚含量明顯低于其他批次；S11中圓柚酮、10-姜酚含量最高；S7中楊芽黃素含量最高；S2中6-姜酚含量最高；S3中8-姜酚含量最高。雖然上述成分含量差異較大，但因它們?yōu)榉街芯幰嬷?、使藥干姜的主要活性成分[17,19-21]，故仍將其作為檢測(cè)指標(biāo)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)首次建立HPLC法測(cè)定蘇格木勒-10中圓柚酮、楊芽黃素、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的含量，該方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確、專屬性、重復(fù)性良好，檢測(cè)成本低，可為完善和提高該方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。