菜粉蝶熱激蛋白70(HSP70)基因的分子特性及其對(duì)殺蟲劑脅迫的響應(yīng)

丁朝陽, 趙 樂, 劉 蘇, 李茂業(yè)

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 作物有害生物綜合治理安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 合肥230036)

熱激蛋白(heat shock proteins, HSPs)又稱熱休克蛋白，是普遍存在于原核與真核生物的一類分子伴侶，其主要功能是幫助細(xì)胞內(nèi)其他新生肽鏈正確折疊、減少肽鏈非正常聚集，以及幫助錯(cuò)誤折疊的肽鏈降解(Feder and Hofmann, 1999)。生物體在外界不利環(huán)境因子(如低溫、高溫和紫外線輻射等)的脅迫下，蛋白功能受損，細(xì)胞穩(wěn)態(tài)被破壞，此時(shí)HSPs大量表達(dá)，幫助生物體抵御外界脅迫，從而增強(qiáng)生物體的抗逆能力(S?rensenetal., 2003)。根據(jù)HSPs的分子量大小，可將其劃分為4個(gè)家族：HSP90, HSP70, HSP60和小分子量HSP(King and MacRae, 2015)。其中HSP70家族又包括誘導(dǎo)型HSP70和組成型HSC70。誘導(dǎo)型HSP70在正常情況下表達(dá)量較低，但受到外界因子脅迫后其表達(dá)量迅速增加；而組成型HSC70在外界因子脅迫下表達(dá)量變化不顯著(Moreira-de-Sousaetal., 2018)。

昆蟲同樣表達(dá)多個(gè)家族的HSPs(王海鴻和雷仲仁, 2005)。其中HSP70家族是最為保守的一類，該家族因?yàn)樵诶ハx抵御外界脅迫中的重要功能而受到廣泛關(guān)注(King and MacRae, 2015)。如煙粉虱Bemisiatabaci受到高溫脅迫后，1個(gè)HSP70基因表達(dá)量迅速上調(diào)，而利用RNA干擾技術(shù)沉默該基因后，試蟲在高溫脅迫下的死亡率顯著升高(Wangetal., 2019)。又如大量失水使埃及伊蚊Aedesaegypti的1個(gè)HSP70基因的表達(dá)水平大幅提升，而沉默該基因后，試蟲對(duì)失水脅迫的耐受性顯著降低(Benoitetal., 2010)。此外，當(dāng)昆蟲遭受紫外線、殺蟲劑、重金屬、病原物以及天敵寄生等脅迫時(shí)，HSP70基因的表達(dá)量均迅速增加，以增強(qiáng)昆蟲對(duì)這些脅迫因子的抵御能力(Chenetal., 2012; Huetal., 2019; 楊昌利等, 2019; Zhouetal., 2020)。還有一些研究表明，昆蟲HSP70基因的表達(dá)受保幼激素調(diào)控，并參與昆蟲的生殖與發(fā)育過程(Guetal., 2012; Luoetal., 2017)。

菜粉蝶Pierisrapae屬鱗翅目(Lepidoptera)粉蝶科(Pieridae)，是為害十字花科作物的重要害蟲。菜粉蝶幼蟲取食葉片，嚴(yán)重時(shí)葉片只剩葉脈和葉柄；幼蟲排泄物能引起作物軟腐病，嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和質(zhì)量(蔣杰賢等, 2002)。施用化學(xué)殺蟲劑仍是目前控制菜粉蝶為害的有效措施，高效氯氟氰菊酯和氯蟲苯甲酰胺是當(dāng)前常用的兩種藥劑(王品舒等, 2017)。在其他昆蟲中雖有一些研究表明HSP70在抵御殺蟲劑脅迫中起作用，但菜粉蝶的HSP70是否參與對(duì)殺蟲劑脅迫的響應(yīng)，目前仍然未知。本研究鑒定了菜粉蝶3個(gè)HSP70基因，分析了它們所編碼蛋白的分子特征，并檢測(cè)了這些基因在不同發(fā)育階段、不同組織以及在高效氯氟氰菊酯和氯蟲苯甲酰胺脅迫下的表達(dá)譜，以期為進(jìn)一步研究HSP70在菜粉蝶抵御殺蟲劑脅迫中的功能和作用機(jī)制提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

供試菜粉蝶為本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)種群(Liuetal., 2017)。幼蟲使用甘藍(lán)葉片飼養(yǎng)，成蟲飼喂10%(v/v)蜂蜜水，飼養(yǎng)溫度為25±1℃，相對(duì)濕度為70%±5%，光周期為16L∶8D。收集2-5齡幼蟲、蛹和雌雄成蟲，其中2齡幼蟲收集30頭，其余齡期幼蟲、蛹和成蟲均為15頭，分別為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)。取4齡幼蟲30頭為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，在冰上解剖中腸、馬氏管、脂肪體和體壁。各蟲齡試蟲和組織解剖試蟲取樣均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。所有樣品均用液氮速凍，置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 殺蟲劑處理

高效氯氟氰菊酯和氯蟲苯甲酰胺原藥購自德國Dr. Ehrenstorfer公司，純度均大于95%。將兩種殺蟲劑分別溶于丙酮，并分別稀釋至0.12和1.04 ng/μL。采用點(diǎn)滴法，將2種藥劑分別點(diǎn)滴至菜粉蝶4齡幼蟲腹部背板上，每頭幼蟲點(diǎn)滴1 μL。所用劑量均為這2種殺蟲劑的LD20劑量(Liuetal., 2017)。對(duì)照組試蟲點(diǎn)滴等量的丙酮。分別于處理后0, 6, 12, 18和24 h收集存活的試蟲，液氮速凍后保存于-80℃超低溫冰箱。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)包含30頭試蟲。

1.3 RNA提取和cDNA第1鏈合成

使用RNAiso Plus試劑(寶生物，大連)提取樣本的總RNA。使用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific，美國)檢測(cè)RNA的完整性和濃度。利用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover反轉(zhuǎn)錄試劑盒(東洋紡，日本)合成cDNA第1鏈。

1.4 菜粉蝶HSP70基因鑒定與序列分析

以小菜蛾P(guān)lutellaxylostella的HSP70氨基酸序列為模板(夏曉峰等, 2013)，使用BioEdit軟件中的BLAST程序(TBLASTN算法，e-value=1×105)，在菜粉蝶轉(zhuǎn)錄組unigene庫(Qietal., 2016)中進(jìn)行同源檢索，獲得菜粉蝶HSP70基因的cDNA序列。這些基因所編碼蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)使用ExPASy在線工具計(jì)算(http:∥web.expasy.org/compute_pi/)，亞細(xì)胞定位使用CELLO程序預(yù)測(cè)(http:∥cello.life.nctu.edu.tw/)。下載菜粉蝶全基因組DNA序列(Shenetal., 2016)，使用Splign程序分析菜粉蝶HSP70基因在基因組框架(scaffold)上的位置及其外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/splign/splign.cgi)。多序列聯(lián)配使用Clustal Omega程序進(jìn)行(http:∥www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo/)，聯(lián)配結(jié)果導(dǎo)入MEGA7.0軟件，使用最大似然法(maximum likelihood)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(Kumaretal., 2016)。各分支置信度經(jīng)Bootstrap法循環(huán)檢驗(yàn)1 000次。

1.5 基因表達(dá)譜分析

使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)菜粉蝶HSP70基因的表達(dá)譜。所用引物列于表1，使用菜粉蝶18S rRNA和β-actin基因作為雙內(nèi)參基因(Liuetal., 2017)。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，先利用反轉(zhuǎn)錄PCR和瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)這些引物的擴(kuò)增產(chǎn)物均為單一條帶，再將條帶回收，送生物公司測(cè)序，確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物是目標(biāo)片段。同時(shí)以不同濃度的cDNA第1鏈為模板進(jìn)行擴(kuò)增，以Ct值為縱坐標(biāo)，模板濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，進(jìn)行直線擬合，根據(jù)直線的斜率計(jì)算引物擴(kuò)增效率(表1)。

熒光定量PCR所用試劑為SYBR Green Real-time PCR Master Mix(東洋紡，日本)，反應(yīng)總體系(20 μL): SYBR Green Mix 10 μL, cDNA第1鏈模板(10 ng)1 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,無核酸酶的水8 μL。所用儀器為Bio-Rad公司CFX96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，熱循環(huán)參數(shù): 95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 60℃ 25 s, 40個(gè)循環(huán)。熱循環(huán)步驟結(jié)束后，溫度從60℃逐步上升至95℃，記錄熔解曲線，以檢測(cè)是否存在引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。同時(shí)在每一輪反應(yīng)中均設(shè)置無核酸酶的對(duì)照和無cDNA模板的對(duì)照，以檢測(cè)反應(yīng)液中是否存在污染。試驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)中包含4次技術(shù)重復(fù)，使用相對(duì)定量法計(jì)算基因表達(dá)量(Pfaffl, 2001)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)v9.5版(Tang and Zhang, 2013)進(jìn)行，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)結(jié)合Tukey氏多重比較法分析多個(gè)樣本之間的顯著性差異，顯著性水平設(shè)為P<0.05。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in this study

2 結(jié)果

2.1 菜粉蝶HSP70基因序列分析

通過檢索菜粉蝶轉(zhuǎn)錄組，獲得了3個(gè)HSP70基因的cDNA序列，分別命名為PrHsp70-1,PrHsp70-2和PrHsp70-3(GenBank登錄號(hào)分別為MW691114, MW691115和MW691116)。這3個(gè)PrHsp70基因編碼的PrHSP70蛋白長度分別為628, 630和653個(gè)氨基酸，分子量分別為68.7, 69.2和71.7 kD。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，這3個(gè)PrHSP70蛋白均位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。BLASTX最佳匹配結(jié)果表明，PrHSP70-1和PrHSP70-2分別與慶網(wǎng)蛺蝶Melitaeacinxia的HSP70-3(GenBank登錄號(hào): AGR84218)和HSP70-2(GenBank登錄號(hào): AGR84224)的氨基酸一致性最高，分別為85%和91%；而PrHSP70-3與小菜蛾HSC70(GenBank登錄號(hào): BAE48743)的氨基酸一致性最高，為92%。

多序列聯(lián)配結(jié)果表明，3個(gè)PrHSP70蛋白中均含有HSP70家族的3個(gè)特征序列，前2個(gè)特征序列分別為IDLGTTYS和IFDLGGGTFDVSIL，第3個(gè)特征序列在PrHSP70-1和PrHSP70-2中為I/VVM/LVGGSTRIPKIQN/S，而在PrHSP70-3中為IVLVGGSTRIPRVQK(圖1)。此外，3個(gè)PrHSP70蛋白羧基末端的4個(gè)氨基酸殘基均為EEVD(圖1)。

3個(gè)PrHsp70基因位于不同的基因組框架(scaffold)上，其中PrHsp70-1位于scaffold_7，而PrHsp70-2和PrHsp70-3分別位于scaffold_109和scaffold_95(圖2)。PrHsp70-1和PrHsp70-2僅有1個(gè)外顯子，無內(nèi)含子，而PrHsp70-3在2個(gè)外顯子之間有一段346 bp的內(nèi)含子(圖2)。

2.2 HSP70基因系統(tǒng)進(jìn)化

基于不同種類昆蟲的HSP70蛋白序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。從圖中可見，昆蟲HSP70被分為3個(gè)主要類群：胞質(zhì)HSP70、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)HSP70和線粒體HSP70。本研究鑒定的3個(gè)菜粉蝶PrHSP70均被劃分至胞質(zhì)HSP70類群，且被聚類至不同的進(jìn)化分支中(圖3)。菜粉蝶PrHSP70-1與慶網(wǎng)蛺蝶的McHSP70(GenBank登錄號(hào): AGR84218)親緣關(guān)系最近，而PrHSP70-2所在的進(jìn)化分支中有多個(gè)鱗翅目HSP70，如家蠶Bombyxmori的BmHSP70(GenBank登錄號(hào): NP_001296526)、斜紋夜蛾Spodopteralitura的SlHSP70(GenBank登錄號(hào): XP_022834808)和煙草天蛾Manducasexta的MsHSP70(GenBank登錄號(hào): XP_030032651)等。PrHSP70-3則與小菜蛾P(guān)xHSC70(GenBank登錄號(hào): BAE48743)和二化螟CsHSC70(GenBank登錄號(hào): BAE44308)處于同一進(jìn)化分支(圖3)。

圖1 菜粉蝶PrHSP70氨基酸序列聯(lián)配Fig. 1 Alignment of amino acid sequences of PrHSP70s of Pieris rapae3個(gè)HSP70特征序列和羧基末端的EEVE基序以方框標(biāo)示。Three HSP70 signature motifs and the C-terminal EEVE motif are boxed.

圖2 菜粉蝶PrHsp70基因的外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)Fig. 2 Exon-intron structure of PrHsp70 genes of Pieris rapae

圖3 基于氨基酸序列的昆蟲HSP70系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of insect HSP70s based on amino acid sequence蛋白來源物種名縮寫Origin species abbreviation of proteins: Pr: 菜粉蝶Pieris rapae; Cs: 二化螟Chilo suppressalis; Px: 小菜蛾P(guān)lutella xylostella; Mc: 慶網(wǎng)蛺蝶Melitaea cinxia; Cf: 云杉卷葉蛾Choristoneura fumiferana; Bm: 家蠶Bombyx mori; Ms: 煙草天蛾Manduca sexta; Ha: 棉鈴蟲Helicoverpa armigera; Sl: 斜紋夜蛾Spodoptera litura; Tc: 赤擬谷盜Tribolium castaneum; Ld: 馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata; Dp: 山松大小蠹Dendroctonus ponderosae; Lo: 稻水象甲Lissorhoptrus oryzophilus; So: 米象Sitophilus oryzae; At: 小蜂甲Aethina tumida; Fo: 西花薊馬Frankliniella occidentalis; Nl: 褐飛虱Nilaparvata lugens; Dm: 黑腹果蠅Drosophila melanogaster; Aa: 埃及伊蚊Aedes aegypti. 括號(hào)中為GenBank登錄號(hào); 3個(gè)PrHSP70蛋白以黑色圓圈標(biāo)注。GenBank accession numbers are shown in parentheses. Three PrHSP70s are indicated by solid circles.

2.3 PrHsp70基因在不同發(fā)育階段和不同組織的表達(dá)模式

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，PrHsp70-1和PrHsp70-2基因具有相似的表達(dá)模式，即在低齡幼蟲期表達(dá)量最低，在5齡幼蟲期表達(dá)量最高，但在蛹期和成蟲期表達(dá)量又顯著降低(P<0.05)(圖4: A, B)；PrHsp70-3在供試的不同發(fā)育階段樣本中的表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)(圖4: C)。PrHsp70基因在4齡幼蟲不同組織中的表達(dá)模式不同，PrHsp70-1在脂肪體中的表達(dá)水平最高，且顯著高于在其他組織中的(P<0.05)(圖4: D)，PrHsp70-2在中腸中的表達(dá)水平最高(圖4: E)，PrHsp70-3在體壁和脂肪體中的表達(dá)量均最高(圖4: F)。

圖4 菜粉蝶PrHsp70基因在不同發(fā)育階段(A-C)和4齡幼蟲不同組織(D-F)中的表達(dá)譜Fig. 4 Expression profiles of PrHsp70 genes in Pieris rapae at different developmental stages (A-C)and in different tissues of the 4th instar larvae (D-F)A, D: PrHsp70-1; B, E: PrHsp70-2; C, F: PrHsp70-3. 2nd: 2齡幼蟲2nd instar larva; 3rd: 3齡幼蟲3rd instar larva; 4th: 4齡幼蟲4th instar larva; 5th: 5齡幼蟲5th instar larva; P: 蛹Pupa; fA: 雌成蟲Female adult; mA: 雄成蟲Male adult; MG: 中腸Midgut; MT: 馬氏管Malpighian tubules; FB: 脂肪體Fat body; IN: 體壁Integument. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同小寫字母表示基因表達(dá)量差異顯著(P<0.05, 單因素方差分析和Tukey氏多重比較法)。Data in the figure are mean±SE. Different lowercase letters above bars indicate significant difference in the gene expression level (P<0.05, one-way ANOVA and Tukey’s test). 圖5同The same for Fig. 5.

2.4 PrHsp70基因在LD20劑量殺蟲劑脅迫下的表達(dá)模式

LD20劑量高效氯氟氰菊酯處理4齡幼蟲后，PrHsp70-2響應(yīng)最迅速，處理6 h后其表達(dá)量即顯著高于丙酮處理的對(duì)照組(P<0.05)(圖5: B)，而PrHsp70-1和PrHsp70-3對(duì)高效氯氟氰菊酯的響應(yīng)較遲緩，在處理12 h后才開始上調(diào)(圖5: A, C)。PrHsp70-1在高效氯氟氰菊酯處理18 h后達(dá)到最大表達(dá)量，但在24 h時(shí)下調(diào)至正常水平,與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)(圖5: A)。PrHsp70-2在18 h時(shí)的表達(dá)量最高，在24 h時(shí)雖然下調(diào)，但仍顯著高于對(duì)照組(圖5: B)。PrHsp70-3在處理18 h后開始下調(diào)，處理24 h后其表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(圖5: C)。

LD20劑量氯蟲苯甲酰胺處理4齡幼蟲后，PrHsp70-1和PrHsp70-2的表達(dá)水平在4個(gè)時(shí)間段(6, 12, 18和24 h)均顯著上調(diào)(P<0.05)(圖5: D, E)。其中PrHsp70-1表達(dá)量在處理12 h后達(dá)到最大值(圖5: D)，而PrHsp70-2表達(dá)量在處理18 h后達(dá)到最大值(圖5: E)。PrHsp70-3的表達(dá)量在處理6 h后顯著上調(diào)，處理12 h和18 h后雖有下降，但仍顯著高于對(duì)照組；該基因在處理24 h后恢復(fù)正常表達(dá)水平,與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)(圖5: F)。

圖5 菜粉蝶4齡幼蟲PrHsp70基因在LD20劑量的高效氯氟氰菊酯(A-C)和氯蟲苯甲酰胺(D-F)脅迫下的表達(dá)譜Fig. 5 Expression profiles of PrHsp70 genes in the 4th instar larvae of Pieris rapae exposed toLD20 of lambda-cyhalothrin (A-C) and chlorantraniliprole (D-F)A, D: PrHsp70-1; B, E: PrHsp70-2; C, F: PrHsp70-3.對(duì)照組試蟲點(diǎn)滴等體積丙酮。The test insects in the control group were dipped with equal volume of acetone.

3 討論

本研究鑒定了菜粉蝶3個(gè)PrHsp70基因。這3個(gè)基因編碼的PrHSP70蛋白的分子量均為70 kD左右，均與其他昆蟲中注釋的HSP70蛋白具有極高的氨基酸一致性，并且這3個(gè)PrHSP70蛋白均具有HSP70家族的3個(gè)特征序列(圖1)，表明它們屬于HSP70家族成員(譚瑤等, 2017; 楊昌利等, 2019)。HSP70家族包含誘導(dǎo)型HSP70和組成型HSC70，Sonoda等(2006)和Zhang等(2015)分析了鱗翅目代表性昆蟲二化螟和小菜蛾的HSP70和HSC70序列，認(rèn)為“IVLVGGSTRIPKVQK”可能是鱗翅目HSC70的代表性特征。但本研究鑒定的3個(gè)PrHSP70蛋白均不具備該特征，因此這3個(gè)PrHSP70蛋白之中是否存在HSC70，尚需進(jìn)一步研究。此外，3個(gè)PrHSP70蛋白羧基末端的4個(gè)氨基酸殘基均為EEVD，此基序是熱激蛋白的胞質(zhì)定位信號(hào)，推測(cè)3個(gè)PrHSP70蛋白均位于胞質(zhì)內(nèi)(Rosenzweigetal., 2019)，這一推論也與亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)和系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果相符。PrHsp70基因序列的成功獲得為后續(xù)研究這些基因在菜粉蝶生長發(fā)育及脅迫響應(yīng)中的功能奠定了基礎(chǔ)。

研究PrHsp70基因在菜粉蝶不同發(fā)育階段和幼蟲組織的表達(dá)模式，對(duì)于基因功能的預(yù)測(cè)有重要意義。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在供試的菜粉蝶不同發(fā)育階段和幼蟲組織樣本中均能檢測(cè)到PrHsp70基因的表達(dá)，表明這3個(gè)基因編碼的蛋白廣泛參與菜粉蝶不同發(fā)育階段的生理活動(dòng)中。在不同發(fā)育階段菜粉蝶中，PrHsp70-1和PrHsp70-2的表達(dá)水平均隨著幼蟲齡期的增加而增加，但在蛹期和成蟲期顯著下降(圖4: A, B)，表明這2個(gè)基因在幼蟲生長發(fā)育中起重要作用。相對(duì)于蛹期和成蟲期，幼蟲期的昆蟲更容易遭受外界不利因子的脅迫(王澤華等, 2014; Stejskaletal., 2021)，因而高量表達(dá)的PrHsp70基因可能也反映了幼蟲期菜粉蝶受到的環(huán)境壓力。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，PrHsp70-1在脂肪體的表達(dá)水平最高(圖4: D)，PrHsp70-2在中腸的表達(dá)水平最高(圖4: E)。脂肪體是昆蟲重要的新陳代謝器官，其較高的氧化水平可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壓力增大(Lietal., 2019)；中腸是昆蟲重要的消化器官，中腸細(xì)胞需要應(yīng)對(duì)食物中的植物次生化合物以及食物表面的環(huán)境污染物和病原微生物等(Terraetal., 2019)，因此這些器官需要PrHSP70來保護(hù)并維持細(xì)胞的正常功能。在其他昆蟲中，也發(fā)現(xiàn)很多在脂肪體和中腸大量表達(dá)的HSP70基因(夏曉峰等, 2013; 孫猛等, 2014)。PrHsp70-3既大量表達(dá)于脂肪體，也大量表達(dá)于體壁(圖4: F)。昆蟲體壁是內(nèi)部器官與外界環(huán)境之間的屏障，外界不利環(huán)境因子直接作用于體壁之上(劉曉健等, 2019)。因此PrHsp70-3在體壁大量表達(dá)可能會(huì)提高菜粉蝶對(duì)逆境的耐受性。

對(duì)于昆蟲來說，殺蟲劑是最為重要的一類非生物脅迫因素。HSP70基因在昆蟲抵御殺蟲劑脅迫中的作用已有一些報(bào)道，如在褐飛虱Nilaparvatalugens中，吡蟲啉脅迫顯著增加了1個(gè)HSP70基因的表達(dá)水平，而沉默該基因后，試蟲對(duì)吡蟲啉的敏感性顯著上升(Luetal., 2017)；在亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis中，HSP70蛋白能夠結(jié)合蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白，增強(qiáng)害蟲的抗性(Shabbiretal., 2020)。 此外，當(dāng)西花薊馬Frankliniellaoccidentalis、蘋果蠹蛾Cydiapomonella和灰飛虱Sogatellafurcifera等昆蟲受到阿維菌素、啶蟲脒、噻蟲嗪等殺蟲劑脅迫后，HSP70基因表達(dá)水平均顯著上調(diào)(Wangetal., 2014; Yangetal., 2016; Zhouetal., 2020)。本研究發(fā)現(xiàn)LD20劑量高效氯氟氰菊酯和氯蟲苯甲酰胺處理能夠誘導(dǎo)3個(gè)PrHsp70基因不同程度上調(diào)表達(dá)(圖5)，它們的功能可能是在細(xì)胞內(nèi)合成更多的PrHSP70蛋白，進(jìn)而通過修復(fù)殺蟲劑脅迫導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，增強(qiáng)菜粉蝶對(duì)殺蟲劑脅迫的抵御能力。另一方面，本研究發(fā)現(xiàn)LD20劑量高效氯氟氰菊酯處理24 h后，PrHsp70-3顯著下調(diào)表達(dá)(圖5: C)。外界脅迫誘導(dǎo)HSP70基因下調(diào)的現(xiàn)象在云杉卷葉蛾Choristoneurafumiferana和灰飛虱等昆蟲中也存在(Quanetal., 2020; Zhouetal., 2020)，這可能是昆蟲應(yīng)對(duì)殺蟲劑脅迫的一種生理應(yīng)激機(jī)制，因?yàn)镠SP70蛋白行使功能需要消耗腺苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)，HSP70基因下調(diào)表達(dá)可以維持細(xì)胞內(nèi)ATP合成與消耗之間的平衡(Quanetal., 2020)。

需要指出的是，本研究只探討了菜粉蝶PrHsp70基因?qū)⑾x劑脅迫的響應(yīng)，未研究這些基因在溫度脅迫下的表達(dá)模式。明確PrHsp70基因?qū)囟让{迫的響應(yīng)可以更好地區(qū)分誘導(dǎo)型和組成型HSP70家族成員，并有助于更好地理解該基因家族在抵御外界脅迫中的作用。此外，本研究只從基因表達(dá)層面分析了PrHsp70基因與殺蟲劑脅迫之間的關(guān)系，未研究這些基因所編碼的蛋白質(zhì)在這一過程中的作用。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們將利用蛋白異源表達(dá)和RNA干擾等技術(shù)，深入探討PrHsp70基因響應(yīng)殺蟲劑及其他環(huán)境脅迫因子的生理與分子機(jī)制。