冷馴化對(duì)松墨天牛幼蟲脂代謝的影響

陳俊賢, 周 嬌, 魏洪義, 趙莉藺,3,4,*

(1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 南昌 330045; 2. 中國科學(xué)院動(dòng)物研究所, 農(nóng)業(yè)蟲害鼠害綜合治理研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100101;3. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 4. 中國科學(xué)院生物互作卓越創(chuàng)新中心, 北京 100049)

溫度為生物生境中重要的環(huán)境因子，生物在應(yīng)對(duì)溫度變化，尤其是低溫脅迫時(shí)，會(huì)采取多種生存策略適應(yīng)低溫。昆蟲為變溫動(dòng)物，其生理狀態(tài)極易受到溫度的影響，而耐寒性則對(duì)于昆蟲種群的擴(kuò)散和分布起關(guān)鍵作用。昆蟲的耐寒策略大致可分為行為和生理兩種策略(Danks, 2004, 2005; 馮宇倩等, 2014)，在行為上，昆蟲通過尋找溫差變化較小、相對(duì)溫暖的場(chǎng)所進(jìn)行越冬；在生理上，昆蟲可通過改變過冷卻點(diǎn)、冰點(diǎn)、含水量，產(chǎn)生并利用低分子糖醇、抗凍蛋白、熱激蛋白等方式調(diào)節(jié)自身穩(wěn)態(tài)適應(yīng)低溫，同時(shí)自身的脂代謝也會(huì)響應(yīng)參與調(diào)節(jié)(Clark and Worland, 2008; 秦明等, 2017; 呂兵等, 2020)。

脂肪體可作為昆蟲的器官，調(diào)控能量儲(chǔ)備、合成循環(huán)代謝物及響應(yīng)激素調(diào)節(jié)(Arrese and Soulages, 2010)。脂肪體富含大量的脂肪，昆蟲主要利用脂類進(jìn)行能量的貯存與轉(zhuǎn)化。脂肪為昆蟲各個(gè)發(fā)育階段的重要能量來源，昆蟲可通過分解積累的脂肪所產(chǎn)生的能量支持其變態(tài)、飛行、繁殖與越冬等生理活動(dòng)(Ziegler 1991; Behroozietal., 2012; Wang, 2017)。除基本的儲(chǔ)能作用外，脂類物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物還參與昆蟲應(yīng)對(duì)低溫的耐受過程。昆蟲對(duì)抗寒冷脅迫的重要防御措施之一是抗凍保護(hù)劑低分子量多元醇的積累，如游離氨基酸(free amino acid, FAA)可作為一種保護(hù)性化合物，作用于黑菌蟲Alphitobiusdiaperinus的耐寒過程(Lalouetteetal., 2007)。甘油可作為重要的防凍劑(Storey and Storey, 1986)來響應(yīng)昆蟲短期和長期的冷適應(yīng)，和其他低溫保護(hù)劑共同作用提升昆蟲的過冷卻能力，參與細(xì)胞滲透壓的調(diào)節(jié)，穩(wěn)定低溫脅迫環(huán)境下昆蟲的細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與狀態(tài)(Crosthwaiteetal., 2011)。有研究發(fā)現(xiàn)，在紅尾肉蠅Sarcophagacrassipalpis中檢測(cè)存在的甘油 (Leeetal., 1987)，在熱帶的麻蠅Peckiaabnormis和Sarcodexiasternodontis中卻并未檢測(cè)到其存在(Chenetal., 1990)。脂肪酸(fatty acids, FAs)為脂代謝重要產(chǎn)物之一，是一類一端中含一羧基的長鏈有機(jī)化合物，在生物代謝能量的儲(chǔ)存、細(xì)胞和生物膜結(jié)構(gòu)以及生理學(xué)的調(diào)節(jié)等方面具多種功能(Jump, 2004)。昆蟲的卵母細(xì)胞可利用脂肪酸合成三酰甘油等參與體內(nèi)的生理代謝(Ferenz, 1985)；游離脂肪酸可殺滅或抑制真菌和細(xì)菌的生長(Feldlauferetal., 1993; Benkendorffetal., 2005; Urbaneketal., 2012; 邢東旭等, 2017)，維持包括脂肪體在內(nèi)的其他組織的代謝活性(Arrese and Soulages, 2010)；脂肪酸潛在的營養(yǎng)價(jià)值還可被開發(fā)與利用(高正輝等, 2017)。此外，有研究表明游離脂肪酸還與昆蟲的耐寒性相關(guān)，昆蟲可通過改變磷脂中不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例使自身在寒冷條件下維持液晶狀態(tài)而不被凍結(jié)，減少低溫?fù)p傷(lachtaetal., 2002)。且不同昆蟲間的脂肪酸組成存在差異，還受其食用飼料、自身發(fā)育情況、所處的氣候環(huán)境等多種因子的影響(Joanisse and Storey, 1996; Khanietal., 2007; Izumietal., 2009; Oonincxetal., 2020)。

媒介昆蟲作為一種傳播病原的重要昆蟲對(duì)控制病原具有關(guān)鍵的作用，但對(duì)媒介昆蟲的脂肪動(dòng)員過程中游離脂肪酸的種類和功能的研究則相對(duì)缺乏(Gondimetal., 2018)。松墨天牛Monochamusalternatus屬鞘翅目(Coleoptera)天牛科(Cerambycidae)溝脛天牛亞科(Lamiinae)墨天牛屬M(fèi)onochamus，是一類為害松樹的蛀干型林業(yè)檢疫害蟲，其成蟲是攜帶及傳播松材線蟲Bursaphelenchusxylophilus的重要媒介昆蟲，在取食為害松樹，影響樹內(nèi)營養(yǎng)輸送的同時(shí)，加快了松樹枯萎病(pine wilt disease, PWD)的傳播。且松墨天牛在中國、日本、韓國等多個(gè)亞洲國家均有分布(楊寶君等, 2003)，為亞洲地區(qū)松材線蟲病最重要的傳播媒介(Akbulut and Stamps, 2012)。我國大部分區(qū)域均為松墨天牛的適生區(qū)(時(shí)鵬等, 2019)，現(xiàn)已有包括浙江、四川、福建、湖北、遼寧等共18個(gè)省級(jí)行政區(qū)的松樹被松材線蟲病侵染(國家林業(yè)和草原局, 2020)，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重(朱誠棋等, 2017)。松墨天牛幼蟲的適應(yīng)性與抗逆能力極強(qiáng)，在嚴(yán)寒地區(qū)仍可完成完整的世代發(fā)育。據(jù)國家氣象科學(xué)數(shù)據(jù)中心(data.cma.cn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，遼寧省內(nèi)部分地區(qū)連續(xù)4年(2016-2020年)的冬季(11月-次年1月)的冬季平均氣溫低至- 6℃，最低平均溫度可達(dá)-20℃。因此耐寒能力成為影響松墨天牛幼蟲成功越冬的重要因素，也是控制松墨天牛種群數(shù)量和決定其在不同溫區(qū)內(nèi)成功定殖的關(guān)鍵因子，脂代謝在天牛幼蟲越冬期的作用和響應(yīng)就顯得尤為重要。

本研究組的前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，松墨天牛幼蟲經(jīng)10 d的4℃低溫處理后，其耐寒性增強(qiáng)，且其過冷卻點(diǎn)在第7天時(shí)最低，與常溫下(25℃)的對(duì)照組天牛幼蟲存在極顯著性差異(Zhangetal., 2020)。故本實(shí)驗(yàn)以松墨天牛的4齡幼蟲為供試?yán)ハx，分別設(shè)置25℃處理的常溫對(duì)照組和4℃處理7 d的冷馴化組,測(cè)定分析松墨天牛在應(yīng)對(duì)低溫環(huán)境下的體內(nèi)脂質(zhì)代謝的變化，在一定程度上揭示松墨天牛的生理狀態(tài)及其抗寒應(yīng)對(duì)策略，可為研究松墨天牛幼蟲的生長發(fā)育的適應(yīng)機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，為松墨天牛的種群動(dòng)態(tài)變化的預(yù)測(cè)和綜合防治等研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

本研究所用的松墨天牛初始種群采自浙江省杭州市富陽區(qū)新登鎮(zhèn)(30°4′34.93″N, 119°35′5.54″E)的馬尾松Pinusmassoniana木段中，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室人工飼料飼養(yǎng)建立室內(nèi)實(shí)驗(yàn)種群，至用于實(shí)驗(yàn)時(shí)已連續(xù)飼養(yǎng)20余代。

1.2 試蟲飼養(yǎng)方法及其脂肪體收集

室內(nèi)實(shí)驗(yàn)種群松墨天牛全程置于智能人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：溫度25℃±1℃，相對(duì)濕度70%±10%，光周期12L∶12D。其中，天牛幼蟲光照條件模擬其在野外出于松樹內(nèi)的黑暗環(huán)境，不設(shè)置光照周期。將野外采回的松墨天牛幼蟲在裝有人工飼料的10 mL的離心管內(nèi)進(jìn)行單頭飼養(yǎng)，至老熟幼蟲化蛹羽化后，喂食松枝并提供新鮮木段供其產(chǎn)卵，待其在木段中孵化并取食長至1-2齡幼蟲后，從木段中剖出幼蟲，繼續(xù)以主要成分為松樹木屑的復(fù)合人工飼料進(jìn)行飼養(yǎng)。選取同一代成蟲所產(chǎn)的卵，將孵化后長至4齡幼蟲選為試蟲。隨機(jī)選取30頭天牛幼蟲，將其中15頭從25℃轉(zhuǎn)至4℃條件中進(jìn)行低溫冷適應(yīng)，其余15頭繼續(xù)處于25℃條件下。7 d后，分別取出，并置于體視顯微鏡下解剖，除去頭部、表皮、中腸及馬氏管，將脂肪體收集入1.5 mL離心管內(nèi)，隨后迅速用液氮冰凍轉(zhuǎn)至-80℃冰箱中存用。

1.3 脂滴尼羅紅染色

用1×PBS緩沖液將收集的松墨天牛幼蟲的脂肪體清洗3次后，加適量的含20%甘油的已稀釋的尼羅紅染料(尼羅紅染料∶1×PBS=1∶10 000, v/v)進(jìn)行染色。避光染色3～5 h后，再次用1×PBS緩沖液清洗組織3次，隨后轉(zhuǎn)至貼好雞眼圈的載玻片上，并滴加抗熒光淬滅劑，將組織伸展開后蓋上玻片，用中性樹脂固定封片。轉(zhuǎn)至激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM710)在63倍油鏡下觀察并拍攝脂滴照片，選用激發(fā)波長543 nm，發(fā)射波長626 nm。

1.4 脂肪含量測(cè)定

參照Liu等(2009)和Feng等(2014)的方法。在脂肪體收集階段，稱量脂肪體樣品的鮮重(fresh weight, FW)。隨后將脂肪體置于10 mL離心管中，在60℃條件下干燥48 h，直至樣品質(zhì)量不再發(fā)生變化，稱量得到干重(dry weight, DW)。用手持電動(dòng)研磨儀將其磨成粉末后，加入4 mL混合溶液(甲醇∶氯仿=1∶2, v/v)，充分混勻后轉(zhuǎn)至離心機(jī)2 600 g離心10 min，濾掉上清液，再加入混合溶液混勻，離心、棄上清，重復(fù)兩次。隨后再次在60℃條件下干燥72 h，直至樣品質(zhì)量不再發(fā)生變化，稱取此時(shí)殘?jiān)氖莞芍?lean dry weight, LDW)。脂肪含量=[(DW-LDW)/FW]×100。

1.5 脂肪酸甲酯化和游離脂肪酸的測(cè)定

參照Wang等(2017)的方法,使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent Technologies 6890N GC-5973 MSD)進(jìn)行檢測(cè)。樣品處理:將松墨天牛的脂肪體樣品放入1.5 mL加5 μL十三酸甲酯作為內(nèi)參，再加入1 mL HPLC級(jí)的混合試劑(硫酸∶甲醇=1∶49, v/v)均勻研磨。恒溫金屬浴鍋預(yù)先加熱至80℃，用防爆夾夾緊離心管，溫育1 h。待冷卻至室溫后，將樣品轉(zhuǎn)移至5 mL離心管內(nèi)，加入1.5 mL雙蒸水和0.3 mL HPLC級(jí)正己烷溶液，充分震蕩進(jìn)行萃取，使脂肪酸甲酯化后，使用離心機(jī)5 000 g離心10 min。隨后吸取50 μL上層有機(jī)相到進(jìn)樣瓶(Agilent)中，剩余的上層有機(jī)相存入樣品瓶中密閉好，置于-20℃?zhèn)溆谩ＩV條件: HP-5MS毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)(J&W Scientific, Folsom, CA)。 柱溫升溫程序: 50℃ 30 s；以5℃/min速率升至200℃；換用2℃/min速率升至240℃；再以5℃/min速率升至250℃；250℃后保持10 min；最后以3℃/min速率升至280℃；280℃保持3 min。GC-MS傳送桿: 280℃離子源: 230℃四級(jí)桿: 50℃組分分析電子能: 70 eV，掃描范圍35～400 amu，溶劑延遲3 min。

1.6 總RNA提取及cDNA第1鏈合成

參照總RNA提取試劑盒(TIANGEN)說明書提取松墨天牛幼蟲脂肪體的總RNA，再用NanoDrop 2000分光光度計(jì)(NanoDrop Products, 美國)測(cè)定RNA的濃度與純度(OD260/OD280)，取1 μg提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，余下RNA保存于-80℃保存?zhèn)溆?。最后參照Fast Quant cDNA 第1鏈合成試劑盒(TIANGEN)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。并用RNase-Free ddH2O將cDNA的量濃度統(tǒng)一至200 ng/μL，以此作為模板利用PCR檢測(cè)cDNA質(zhì)量合格后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 基因表達(dá)量實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)測(cè)定

使用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)基因的特異性引物(表1)，擴(kuò)增基因片段長度150～300 bp，送至深圳華大基因科技有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primer information

以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，使用Super Real PreMix Plus試劑盒(TIANGEN)進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，按說明書配制反應(yīng)體系溶液。利用ABI 7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用三步法進(jìn)行檢測(cè)和數(shù)據(jù)收集。每個(gè)處理含10個(gè)生物樣品重復(fù)，每個(gè)樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用GC-MS(Gas Chromatography-Mass Spectrometer)軟件結(jié)合NIST02數(shù)據(jù)庫(Rev. D.04.00, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)以及標(biāo)準(zhǔn)品滯留時(shí)間對(duì)松墨天牛游離脂肪酸的數(shù)據(jù)進(jìn)行定性及定量分析，其組成采用峰面積歸一化法計(jì)算解析組分的相對(duì)百分含量。數(shù)據(jù)的綜合統(tǒng)計(jì)分析采用軟件Excel 2016和SPSS 22.0;各處理組采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)比較法進(jìn)行差異顯著性分析;作圖利用軟件GraphPad Prism 7.0完成。

2 結(jié)果

2.1 冷馴化后松墨天牛4齡幼蟲脂肪體內(nèi)脂肪含量變化

為研究低溫是否會(huì)影響松墨天牛脂肪的積累水平，我們檢測(cè)了脂肪的含量并染色觀察其狀態(tài)變化。將松墨天牛幼蟲進(jìn)行7 d的冷處理(4℃)后，對(duì)其脂肪體進(jìn)行尼羅紅染色，我們觀察到脂肪體內(nèi)的脂滴存在明顯變小且密度降低的現(xiàn)象，表明松墨天牛幼蟲在低溫環(huán)境下脂質(zhì)代謝發(fā)生了變化，脂質(zhì)被分解消耗(圖1)。且松墨天牛冷處理前后的脂肪含量差異由圖2可知，松墨天牛的脂肪積累受到低溫環(huán)境的影響，對(duì)照組脂肪含量為15.70%±2.72%，處理組脂肪含量為13.18%±2.67%。經(jīng)歷低溫后的脂肪含量較之前有所下降，說明低溫下脂肪分解代謝。松墨天牛幼蟲在越冬期進(jìn)食量減少，通過體內(nèi)儲(chǔ)備脂肪的消耗來維持其基本代謝。

2.2 冷馴化后松墨天牛4齡幼蟲脂肪體內(nèi)游離脂肪酸種類

為了進(jìn)一步證明低溫加快脂分解代謝，我們對(duì)β-氧化信號(hào)通路上游的游離脂肪酸進(jìn)行了定性和定量分析。如圖3所示，利用GC-MS檢測(cè)分析松墨天牛4齡幼蟲脂肪體中的游離脂肪酸，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和處理組中的主要脂肪酸均為C16∶0, C18∶0, C16∶1, C18∶1和C18∶2，共5種。此外，此次共檢測(cè)到11種脂肪酸(表2)，含7種飽和脂肪酸：月桂酸(C12∶0)、十五烷酸(C14∶0)、棕櫚酸(C16∶0)、十七烷酸(C17∶0)、硬脂酸(18∶0)、花生酸(C20∶0)、山俞酸(C22∶0)；4種不飽和脂肪酸，其中含3種單不飽和脂肪酸：棕櫚油酸(C16∶1)、油酸(C18∶1)和二十碳烯酸(C20∶1)，1種多不飽和脂肪酸——亞油酸(C18∶2)。一般情況下，隨溫度的降低，生物體內(nèi)脂肪總量會(huì)發(fā)生變化，脂肪酸也會(huì)相應(yīng)發(fā)生改變。本研究中，對(duì)照組和處理組松墨天牛4齡幼蟲脂肪體內(nèi)的脂肪酸組成成分相同，但其各部分含量發(fā)生了變化。兩組中C16∶0, C18∶0, C16∶1, C18∶1和C18∶2為主要脂肪酸，其中C18∶2的相對(duì)含量在兩組中均為最高，在25℃時(shí)達(dá)31.83%±8.82%，經(jīng)冷馴化后降至25.16%±2.88%。C16∶0, C16∶1和C18∶2脂肪酸含量經(jīng)冷馴化后也均呈下降趨勢(shì)。而冷馴化后，C18∶0與C18∶1的相對(duì)含量則呈上升趨勢(shì)，C18∶1的含量由25℃下的14.43%±1.92%增至冷馴化后的16.37%±1.06%，與之前Kostal和Simek(1998)所報(bào)道的地中海燈蛾Cymbalophorapudica幼蟲經(jīng)冷處理后的C18∶1含量變化的趨勢(shì)一致(表2)。

圖1 冷馴化后松墨天牛4齡幼蟲脂肪體中脂滴形態(tài)變化Fig. 1 Morphological changes of lipid droplets in the fat body of the 4th instar larvae of Monochamus alternatus after cold acclimationA: 未經(jīng)冷馴化，松墨天牛4齡幼蟲一直在常溫(25℃)下飼養(yǎng)(對(duì)照組)Non-subjected to cold acclimation, the 4th instar larvae of M. alternatus were reared at room temperature (25℃) all the time as the control group. B: 經(jīng)歷冷馴化，松墨天牛4齡幼蟲由常溫(25℃)轉(zhuǎn)至低溫(4℃)下飼養(yǎng)7 d(處理組) Subjected to cold acclimation, the 4th instar larvae of M. alternatus were transferred from room temperature (25℃) to low temperature (4℃) and reared for 7 d as the treatment group.

圖2 冷馴化后松墨天牛4齡幼蟲脂肪體中脂肪含量的變化Fig. 2 Changes in the fat content in the fat body of the 4th instar larvae of Monochamus alternatusafter cold acclimation以一直在25℃下飼養(yǎng)的幼蟲為對(duì)照組；以從25℃轉(zhuǎn)移至4℃冷馴化7 d的幼蟲為處理組。Larvae reared at 25℃ all the time as the control group, and those transferred from 25℃ to 4℃ and subjected to cold acclimation for 7 d as the treatment group. 下同The same below. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，每個(gè)處理均有5頭昆蟲作為重復(fù)；兩組間采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。Each value in the figure represents mean±SE of 5 individual replicates. Statistical significance of differences between the two groups was analyzed using independent-samples t-test. nsP>0.05.

2.3 冷馴化后松墨天牛4齡幼蟲脂肪體中主要游離脂肪酸相對(duì)豐度變化

昆蟲的不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸的比例與昆蟲的抗寒性相關(guān)。未經(jīng)冷馴化的對(duì)照組和經(jīng)冷馴化的處理組中，松墨天牛4齡幼蟲脂肪體的主要脂肪酸組成均以不飽和脂肪酸所占豐度最高(圖3)。經(jīng)冷馴化后松墨天牛4齡幼蟲脂肪體中的脂肪酸豐度由于脂質(zhì)的消耗，整體呈下降趨勢(shì)(圖4)，其中C16∶0, C16∶1及C18∶2的豐度下降顯著，分別減少了30.95%, 47.85% 及35.56%。但冷處理后的松墨天牛的游離脂肪酸的雙鍵指數(shù)UFA/SFA(不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸的比例)上升，由25℃條件下的2.32±0.16增至4℃低溫處理后的2.41±0.21。

2.4 冷馴化后松墨天牛幼蟲脂肪體中脂肪酸β-氧化關(guān)鍵酶基因表達(dá)變化

根據(jù)前部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，松墨天牛4齡幼蟲在經(jīng)歷低溫處理后其脂肪體內(nèi)的脂肪含量減少(圖2)，游離脂肪酸含量及相對(duì)豐度呈下降趨勢(shì)(表2和圖4)，幼蟲脂肪體的脂質(zhì)被分解消耗，脂肪代謝發(fā)生改變。為進(jìn)一步探索松墨天牛幼蟲在低溫條件下的脂肪代謝水平的變化，我們分別對(duì)未經(jīng)冷馴化和經(jīng)冷馴化的松墨天牛4齡幼蟲脂肪體中脂肪酸β-氧化關(guān)鍵代謝酶[carnitine palmitoyltransferase 1(CPT1), 4-ketoacyl-CoA thiolase(4KCT), very long chain acyl-CoA dehydrogenase(VLCAD), enoyl-CoA hydratase (ECH), 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase(3HCD-1)]基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了測(cè)定和分析。經(jīng)歷7 d的低溫處理后，松墨天牛4齡幼蟲脂肪體中脂肪酸酶的表達(dá)水平均呈上調(diào)狀態(tài)，但只有VLCAD編碼基因的表達(dá)量在兩組間存在顯著性差異(P<0.05)，處理組的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組的表達(dá)量(圖5)。這表明松墨天牛幼蟲脂肪體的脂肪酸的代謝水平在經(jīng)歷低溫處理后高于未經(jīng)歷低溫的對(duì)照組的代謝水平，且此時(shí)的脂肪酸分解水平升高，松墨天牛幼蟲通過脂肪酸的β-氧化獲得能量，維持其在低溫下的內(nèi)部穩(wěn)態(tài)，增強(qiáng)了天牛幼蟲的抗逆能力。

3 討論

溫度可影響昆蟲的進(jìn)食、繁殖等生理活動(dòng)，對(duì)其生長發(fā)育、代謝及種群的分布具有重大生物學(xué)意義。本研究以媒介昆蟲松墨天牛的幼蟲為研究對(duì)象，探究了低溫下其脂肪代謝的變化，并探討了游離脂肪酸的種類和含量在其耐寒過程中的作用。我們發(fā)現(xiàn)，松墨天牛幼蟲在經(jīng)歷低溫馴化期間的儲(chǔ)存脂肪被充分動(dòng)員分解，脂肪酸酶的代謝水平加快，脂肪酸雙鍵指數(shù)上升，脂肪及其代謝物質(zhì)在天牛幼蟲自身的供能和耐寒保護(hù)機(jī)制中起重要作用。

昆蟲的脂肪含量的變化對(duì)其耐寒性產(chǎn)生了影響。本研究中松墨天牛幼蟲在經(jīng)歷冷處理后進(jìn)入低溫滯育狀態(tài)，取食量減少，只能依靠現(xiàn)有的脂肪貯存來進(jìn)行脂代謝，故其脂滴變小，密度下降，且脂肪含量下降(圖1和2)。 這與之前在如Ocneriaterebinthina及Arimaniacomaroffi等一些越冬昆蟲中觀察到的脂肪含量變化趨勢(shì)一致，研究人員發(fā)現(xiàn)這些越冬昆蟲在越冬前積累脂肪，之后脂肪含量隨越冬時(shí)間延長而逐漸下降，越冬結(jié)束后的脂肪含量顯著低于越冬前(Behroozietal., 2012; Bemanietal., 2012; 楊海博等, 2019; 吳有芳等, 2019)。一般動(dòng)物在越冬前，會(huì)通過增加體內(nèi)貯存的脂肪含量來抵御寒冷，大多越冬昆蟲也如此，在其滯育或越冬前會(huì)進(jìn)行脂肪的積累(Hahn and Denlinger, 2007)。積累的脂質(zhì)可通過氧化作用為大部分昆蟲供能，作為昆蟲越冬和越冬后活動(dòng)的主要燃料，維持生命活動(dòng)。且昆蟲可通過提高脂肪含量，降低體內(nèi)含水量來增高體內(nèi)的溶質(zhì)濃度，減緩新陳代謝速率(Canavosoetal., 2001; 任小云, 2016)從而提高自身的耐寒性，而越冬結(jié)束時(shí)所儲(chǔ)存的脂質(zhì)含量明顯比開始時(shí)減少(Sinclair and Marshall, 2018)。本實(shí)驗(yàn)冷馴化處理組與常溫對(duì)照組間松墨天牛幼蟲體內(nèi)的脂肪含量差異不顯著(圖2)，或許與低溫冷處理持續(xù)的時(shí)間有關(guān)，若松墨天牛長期處于低溫環(huán)境或滯育狀態(tài)，其累積的脂肪消耗含量可能會(huì)表現(xiàn)出顯著差異。這說明松墨天牛等昆蟲在低溫條件下，利用脂代謝產(chǎn)生的能量維持生理穩(wěn)態(tài)。

圖3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)分析松墨天牛4齡幼蟲經(jīng)冷馴化后脂肪體中主要游離脂肪酸組成的變化Fig. 3 Changes in the composition of main free fatty acids in the fat body of the 4th instar larvae of Monochamus alternatus after cold acclimation analyzed by GC-MSA: 25℃未經(jīng)冷馴化(對(duì)照組)Non-subjected to cold acclimation at 25℃(CK); B: 4℃冷馴化7 d Subjected to cold acclimation at 4℃ for 7 d. 檢測(cè)的物質(zhì)均為甲酯化的游離脂肪酸。The substances detected were the products of methyl esterification of free fatty acids.

脂肪酸的含量變化會(huì)影響昆蟲的耐寒性，昆蟲在受到低溫脅迫后會(huì)通過一系列的脂代謝調(diào)控策略為自身在寒冷環(huán)境下的生存提供有力的保障。松墨天牛4齡幼蟲進(jìn)入低溫環(huán)境后，取食活動(dòng)停止，其主要游離脂肪酸的相對(duì)豐度下降(圖4)，脂肪酸β-氧化的關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量上調(diào)(圖5)，脂肪酸的分解代謝水平升高，從而產(chǎn)生并獲取能量維持基本代謝。與此同時(shí)，在人工冷馴化過程中天牛為適應(yīng)環(huán)境溫度的變化，其C18∶1的相對(duì)含量增加(表2)，體內(nèi)不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例(UFA/SFA)上升，與Kostal和Simek(1998)研究報(bào)道經(jīng)冷處理的地中海燈蛾C.pudica幼蟲的雙鍵指數(shù)及Joanisse和Storey(1996)研究報(bào)道的金針癭蚊Eurostasolidaginis幼蟲及白斑小卷蛾Epiblemascudderiana幼蟲越冬后的雙鍵指數(shù)變化趨勢(shì)一致。此現(xiàn)象在處于自然低溫環(huán)境變化中和人工低溫馴化條件下的部分昆蟲中均有發(fā)現(xiàn)(Izumietal., 2009; 易杰群等, 2015)，由此增加低溫下細(xì)胞膜的流動(dòng)性，減少膜的脂流動(dòng)性，從而提高昆蟲自身的耐寒性(Khanietal., 2007; Rozsypaletal., 2014)。游離脂肪酸的組成種類會(huì)隨著昆蟲物種及其自身所處環(huán)境的差異而產(chǎn)生變化(Ohtsuetal., 1993; Rozsypaletal., 2014; Zhuetal., 2016)，但幾乎所有的昆蟲都能生物合成C16∶0, C18∶0和C18∶1(Stanley-Samuelsonetal., 1988)，且在本實(shí)驗(yàn)中還作為松墨天牛幼蟲的主要游離脂肪酸被檢測(cè)出，天牛幼蟲的游離脂肪酸種類在經(jīng)歷低溫處理的前后均未發(fā)生改變(表2)。目前未有直接證據(jù)指明昆蟲能合成亞麻酸(C18∶3)，此次在松墨天牛幼蟲中也未檢測(cè)到，但在日常膳食含有C18∶3的昆蟲體內(nèi)中可檢測(cè)到其存在。南美大閃蝶Morphopeleides因其生境中的食物紫檀葉中富含C18∶3不飽和脂肪酸，長期進(jìn)食過程中極大地增加了幼蟲體內(nèi)不飽和脂肪酸含量，使其耐寒力增強(qiáng)，順利越冬(Wangetal., 2006)。

表2 經(jīng)冷馴化后松墨天牛4齡幼蟲脂肪體中游離脂肪酸相對(duì)含量Table 2 Relative contents of the free fatty acids in the fat body of the 4th instar larvaeof Monochamus alternatus after cold acclimation

圖4 冷馴化后松墨天牛4齡幼蟲脂肪體中主要游離脂肪酸相對(duì)豐度的變化Fig. 4 Changes in the relative abundance of main free fatty acids in the fat body of the 4th instar larvae ofMonochamus alternatus after cold acclimation圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，每個(gè)處理均有10頭昆蟲作為重復(fù)；組間采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)比較法進(jìn)行差異顯著性分析。Each value in the figure represents mean±SE of 10 individual replicates. The significance of statistical differences was analyzed using independent samples t-test. nsP>0.05; * 0.01≤P≤0.05. 圖5同The same for Fig. 5.

圖5 冷馴化后松墨天牛幼蟲脂肪體中脂肪酸β-氧化過程關(guān)鍵代謝酶基因在mRNA水平上的變化Fig. 5 Changes in the mRNA levels of genes of key enzymes involved in fatty acid β-oxidation in the fat body of the 4th instar larvae of Monochamusalternatus after cold acclimation以β-肌動(dòng)蛋白基因作為PCR過程中的內(nèi)參基因。β-Actin gene was used as the reference gene in the PCR process.

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，松墨天牛在低溫環(huán)境下因自身有限的能源儲(chǔ)備，調(diào)整了耐寒生存策略，降低整體的代謝水平從而維持基本生命活動(dòng)。松墨天牛的脂代謝在此期間發(fā)生了一系列適應(yīng)性的改變:(1)脂肪作為能源物質(zhì)被利用消耗，其脂滴變小，密度及脂肪含量下降；(2)脂肪酸種類未發(fā)生變化，但脂肪酸含量隨脂肪的減少而下降；(3)脂肪酸分解代謝水平升高，通過β-氧化獲取能量；(4)脂肪酸雙鍵指數(shù)(UFA/SFA)，即不飽和脂肪酸的相對(duì)比例上升，防止了儲(chǔ)存脂肪的凝固，并保持了其流動(dòng)性，增強(qiáng)了松墨天牛的耐寒性。下一步可聯(lián)系其生活史中的各個(gè)因素探究低溫時(shí)脂肪酸脫飽和酶(fatty acid desaturase, FAD)對(duì)松墨天牛體內(nèi)不飽和脂肪酸形成的影響，對(duì)松墨天牛的耐寒生理適應(yīng)策略開展進(jìn)一步研究?？傊愇镔|(zhì)可作為松墨天牛幼蟲在低溫環(huán)境下的基礎(chǔ)能量來源并增強(qiáng)其低溫抗逆能力，脂肪代謝為松墨天牛幼蟲耐寒生理反應(yīng)機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)研究松墨天牛的耐寒性及其種群地理分布具有一定的理論指導(dǎo)意義。