阻斷CCR2信號(hào)對(duì)IgA腎病模型大鼠腎病理?yè)p傷及炎性因子表達(dá)的影響

沈雁婕，朱志清，王 蕊，閆莉莉，鹿 玲，張 琴，任振華

IgA腎病(IgA nephropathy, IgAN)是指腎小球系膜區(qū)以IgA沉積和系膜細(xì)胞增殖為特征的原發(fā)性腎小球腎炎。IgA1合成和糖基化異常，導(dǎo)致循環(huán)半乳糖缺陷型IgA1增加失調(diào)。異常糖基化的IgA1與特定的自身抗體形成免疫復(fù)合物，沉積在腎小球引起其系膜細(xì)胞增殖[1]。同時(shí)，免疫復(fù)合物誘導(dǎo)增殖的系膜細(xì)胞釋放炎癥因子和趨化因子，促進(jìn)腎臟組織炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步導(dǎo)致腎臟間質(zhì)纖維化[2]。目前，IgAN的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，臨床以保守治療和皮質(zhì)類(lèi)固醇藥物治療為主[3]，但藥物毒副作用較大且療效不顯著。因此，明確IgAN的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療方法顯得尤為迫切。C-C趨化因子受體2(C-C chemokine receptor 2, CCR2)信號(hào)通路被認(rèn)為與多種腎病相關(guān)[4-5]，但MCP-1/CCR2在IgAN中的作用尚不清楚。奧美沙坦是一類(lèi)血管緊張素II受體拮抗劑，常用于IgAN治療[6-7]。本實(shí)驗(yàn)著重探討CCR2在IgAN模型大鼠腎組織中的表達(dá)及與腎臟病理的關(guān)系，分析CCR2信號(hào)通路在IgAN發(fā)生、發(fā)展中的作用，為臨床治療IgAN提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑兔抗大鼠CCR2抗體購(gòu)自BioVision公司；CCR2阻滯劑RS102895購(gòu)自Tocris Bioscience公司；炎癥因子IL-6、IL-17和TNF-α抗體及趨化因子MCP-1抗體和山羊抗大鼠IgA抗體，均購(gòu)自Abcam公司。二抗、DAB顯色試劑盒等，均購(gòu)自北京中杉金橋公司。奧美沙坦購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒、牛血清白蛋白、脂多糖、二硫蘇糖醇等，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶等，購(gòu)自Promega公司；造模用蓖麻油和四氯化碳，均購(gòu)自天津光復(fù)化工公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組Wistar大鼠48只(6周齡)，雄性，每只質(zhì)量(150±10)g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。Wistar大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組(14只)和IgAN模型組(34只)。參照湯穎等[8]的造模方法建立IgAN模型，首先用BSA(100 g/L)每隔1天給大鼠灌胃(4 mL/kg)，合計(jì)8周；皮下注射0.3 mL蓖麻油和0.1 mL四氯化碳，每周1次，合計(jì)注射9次；第6和第8周的第一日尾靜脈注射0.05 mg脂多糖，對(duì)照組采用等量氯化鈉溶液。第7和第12周末取2只對(duì)照組及IgAN模型組大鼠，取腎臟皮質(zhì)以備熒光染色和病理染色。造模完成后，將30只IgAN模型大鼠隨機(jī)分成IgAN模型組、CCR2拮抗劑組和奧美沙坦組，每組10只。CCR2拮抗劑組大鼠RS102895(10 mg/kg)灌胃，奧美沙坦組以O(shè)lmesartan(10 mg/kg)灌胃，IgAN模型組以同等劑量生理鹽水代替，1天1次，持續(xù)2周，第14周末處死大鼠，取腎皮質(zhì)備用。

1.3 方法

1.3.1血液和尿液標(biāo)本檢測(cè) 收集各組大鼠尿液和血液樣本，在第7、9、12、14周末收集24 h尿液，在第12周末和第14周末采集血液樣本。生化分析儀測(cè)定24 h尿蛋白(NPr)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCre)和血尿酸(UA)，各組樣本分3次檢測(cè)，取平均值統(tǒng)計(jì)比較。

1.3.2腎組織切片及染色 處死動(dòng)物，取腎皮質(zhì)組織塊，經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片。標(biāo)本行HE、PAS、PASM和Masson染色，觀察腎臟組織病理改變及腎小球系膜細(xì)胞增生。切片常規(guī)脫蠟至水，分別行IgA熒光染色和DAB染色。熒光染色一抗采用山羊抗大鼠IgA過(guò)夜，二抗為FITC標(biāo)記兔抗山羊IgG；DAB染色采用3%H2O2室溫30 min，5%BSA室溫封閉1 h，加一抗4 ℃孵育過(guò)夜，室溫復(fù)溫1 h。洗滌后，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，DAB工作液顯色，蘇木精復(fù)染，封固后顯微鏡觀察拍片。陰性對(duì)照以PBS代替一抗染色。

1.3.3Western blot法 腎臟組織稱(chēng)重加入裂解緩沖液，4 ℃震蕩破碎，低溫離心30 min取上清。測(cè)定蛋白濃度，煮沸蛋白，-80 ℃分裝保存。30 μL蛋白樣品電泳，PVDF膜電轉(zhuǎn)，5%BSA或5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TPBS洗膜3次，每次5 min，HRP標(biāo)記的二抗IgG室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)拍攝。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎功能損傷表現(xiàn)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中IgAN模型大鼠出現(xiàn)不同程度的精神不振，食欲下降。造模第7周大鼠出現(xiàn)NPr，并呈進(jìn)行性加重。造模第8周，大鼠出現(xiàn)鏡下血尿。造模第14周末，IgAN模型組大鼠24 h NPr、SCre、BUN水平明顯升高(P<0.01，圖1)。與IgAN模型組相比，CCR2拮抗劑組和奧美沙坦組處理后，24 h Npr、BUN和SCre水平明顯下降(P<0.01)，UA水平未見(jiàn)明顯變化。

圖1 各組大鼠尿液和血液樣本檢測(cè)：A.24 h尿蛋白；B.血肌酐；C.血尿素氮；D.血尿酸；**P<0.01,##P<0.01

2.2 各組大鼠腎臟病理學(xué)改變第14周末IgA免疫熒光結(jié)果顯示，IgAN模型大鼠腎小球系膜區(qū)IgA沉積，強(qiáng)度為IgA(～)，CCR2拮抗劑RS102895能明顯緩解IgAN模型大鼠腎小球系膜區(qū)IgA沉積。HE、Masson、PASM和PAS染色結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，IgAN模型組大鼠腎組織可見(jiàn)腎小球腫脹，體積增大，系膜區(qū)細(xì)胞及基質(zhì)增生，基膜空泡變性。與IgAN模型組相比，CCR2拮抗劑組和奧美沙坦組能明顯緩解大鼠腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)增生(圖2)。

正常對(duì)照組IgAN模型組CCR2拮抗劑組奧美沙坦組IgAHEPASPASMMasson

2.3 各組大鼠腎組織炎癥因子的表達(dá)正常對(duì)照組和IgAN模型組大鼠腎組織均表達(dá)CCR2，以腎小管的表達(dá)最為強(qiáng)烈(圖3A)。與正常對(duì)照組相比，IgAN模型組大鼠與CCR2拮抗劑組大鼠的腎臟組織CCR2的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05)，以CCR2拮抗劑組更為明顯，而奧美沙坦組CCR2表達(dá)降低(P<0.05，圖3B)。Western blot法結(jié)果亦證實(shí)，與正常對(duì)照組相比，IgAN模型組與CCR2拮抗劑組大鼠腎臟組織CCR2表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05，圖3C、D)。

圖3 大鼠腎組織中CCR2表達(dá)檢測(cè)：A.各組大鼠腎組織中CCR2的表達(dá)，PV兩步法；B.免疫組化OD值分析；C.Western blot法檢測(cè)各組大鼠腎組織中CCR2表達(dá)；D.Western blot法檢測(cè)CCR2表達(dá)的定量分析：*P<0.05,**P<0.01,#P<0.05,##P<0.01

正常對(duì)照組大鼠腎小球基本無(wú)MCP-1陽(yáng)性信號(hào)，IgAN模型組大鼠腎小球僅有少量MCP-1陽(yáng)性細(xì)胞，MCP-1陽(yáng)性信號(hào)主要集中于腎小管。與正常對(duì)照組相比，IgAN模型組大鼠腎組織中MCP-1陽(yáng)性信號(hào)明顯增強(qiáng)(P<0.05)，而CCR2拮抗劑和奧美沙坦處理后能明顯降低MCP-1的表達(dá)(P<0.05，圖4)。

圖4 大鼠腎組織中MCP-1、IL-17、IL-6和TNF-α表達(dá)檢測(cè)：A.各組腎組織中標(biāo)志物的表達(dá)，PV兩步法；B.各組免疫組化OD值分析：*P<0.05,**P<0.01,#P<0.05,##P<0.01

正常對(duì)照組大鼠腎組織中有少量IL-6和IL-17表達(dá)，主要集中于集合管。與對(duì)照組相比，IgAN模型組大鼠腎組織中IL-6和IL-17陽(yáng)性信號(hào)明顯增加(P<0.01)，IL-6陽(yáng)性信號(hào)主要集中于腎小球和集合管，而IL-17陽(yáng)性信號(hào)主要集中于腎小球和腎小管。CCR2拮抗劑和奧美沙坦能降低模型大鼠腎組織中IL-6和IL-17的表達(dá)(P<0.05，圖4A)。

正常對(duì)照組腎組織僅少量表達(dá)TNF-α，IgAN模型大鼠腎組織中TNF-α陽(yáng)性信號(hào)明顯增加(P<0.05)，陽(yáng)性信號(hào)主要集中于腎小球和集合管。CCR2拮抗劑和奧美沙坦能降低IgAN模型組腎組織的TNF-α陽(yáng)性信號(hào)(P<0.05，圖4B)。

3 討論

IgAN又稱(chēng)Berger病，是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的原發(fā)性腎小球腎炎，其病理特征是異常糖基化的IgA1復(fù)合物在腎小球系膜區(qū)沉積[4]。目前，IgAN發(fā)病機(jī)制仍不清楚，可能與感染、炎癥、免疫反應(yīng)等多種因素有關(guān)。IgAN臨床、病理表現(xiàn)多樣化，預(yù)后有異質(zhì)性，尚無(wú)特效的治療方法。

MCP-1屬于CC亞家族，具有較強(qiáng)的趨化性，可以激活單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，分泌多種炎癥因子和纖維化因子。有文獻(xiàn)報(bào)道IgAN患者中MCP-1水平與24 h NPr、腎小管間質(zhì)損傷和血肌酐呈正相關(guān)，表明MCP-1可能與IgAN進(jìn)展有關(guān)[9]。CCR2是MCP-1的受體，在炎癥性疾病和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[10-11]。有研究報(bào)道，MCP-1和CCR2基因多態(tài)性可能影響IgAN的進(jìn)展[4]。目前，尚未有研究報(bào)道CCR2信號(hào)通路在IgAN中的作用及機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立IgAN大鼠模型，用CCR2拮抗劑干預(yù)后，對(duì)大鼠腎組織病理變化和相關(guān)臨床指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，并以正常對(duì)照組、IgAN模型組和奧美沙坦組作為對(duì)照，觀察CCR2在IgAN中的作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，IgAN模型組大鼠24 h NPr明顯升高，BUN和SCre水平顯著上升。用CCR2拮抗劑RS102895干預(yù)后，大鼠24 h NPr、BUN和SCre水平顯著降低，提示CCR2拮抗劑對(duì)IgAN模型大鼠腎功能有改善作用。

異常糖基化的IgA1免疫復(fù)合物系膜沉積參與IgAN發(fā)生、發(fā)展，且系膜區(qū)IgA沉積物面積大小與IgAN病理組織學(xué)分級(jí)密切相關(guān)[12]。IgAN的診斷需評(píng)估腎活檢標(biāo)本并檢測(cè)IgA符合物沉積，通常伴系膜/毛細(xì)血管內(nèi)細(xì)胞增多和纖維化[13]。免疫熒光染色結(jié)果顯示，IgAN組腎小球系膜區(qū)IgA沉積，熒光強(qiáng)度為IgA(～)。病理染色結(jié)果顯示，IgAN模型大鼠腎組織中，系膜區(qū)細(xì)胞和基質(zhì)增生，基膜空泡變性，提示造模成功。給予CCR2拮抗劑RS102895干預(yù)后，IgAN模型組大鼠腎小球系膜區(qū)IgA沉積明顯減少，且系膜細(xì)胞和基質(zhì)增生被緩解；提示CCR2拮抗劑能改善IgAN大鼠的病理學(xué)變化。

IgA1沉積于腎小球系膜區(qū)，引起腎小球系膜細(xì)胞增殖[14]，而異常增殖的系膜細(xì)胞釋放各種趨化因子和炎癥因子，進(jìn)一步促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖，進(jìn)而導(dǎo)致腎小球損傷[2]。免疫組化結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，IgAN模型組大鼠腎組織中炎癥相關(guān)因子MCP-1、TNF-α、IL-6和IL-17陽(yáng)性信號(hào)增強(qiáng)，與Zhang等[15]的結(jié)果一致。第12～14周給予CCR2拮抗劑干預(yù)后，上述炎癥相關(guān)因子的陽(yáng)性信號(hào)明顯減弱。即CCR2拮抗劑能緩解IgAN模型組大鼠腎組織中的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，阻斷CCR2信號(hào)途徑能改善IgAN模型組大鼠的腎功能，減少系膜細(xì)胞增生和炎癥反應(yīng)，提示CCR2信號(hào)途徑可能參與IgAN的發(fā)生、發(fā)展。為臨床治療IgAN提供新思路和理論依據(jù)，但CCR2信號(hào)通路在IgAN中的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步分析。